在核心基因和ns3區有突變的突變型瘟病毒的製作方法

2023-09-13 16:57:35 2

專利名稱：在核心基因和ns3區有突變的突變型瘟病毒的製作方法
在核心基因和NS3區有突變的突變型瘟病毒詳述本發明涉及突變型瘟病毒以及含所述病毒的疫苗。瘟病毒在全世界的動物中引起經濟上有重要性的疾病。瘟病毒屬，歸於黃病毒科(Flaviviridae)，包含至少三個種牛病毒性腹灣病毒(Bovine ViralDiarrhea Virus, BVDV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)和羊邊界病病毒(ovine border disease virus，BDV)。據報導還存在包含來自牛和綿羊的分離物的第四種瘟病毒分型，目前通常將此額外的種稱為BVDV-2 ；從而，將經典的BVDV株命名為BVDV-I。CSFV在豬中引起豬瘟(classical swine fever)。豬瘟是在豬中具高度傳染性且有時致命的疾病，並且可造成相當大的經濟損失。動物可能通過接種疫苗來抵抗CSFV，不過，傳統的經滅活或經修飾的活疫苗具有涉及安全性及效力方面的缺陷。因此，應該開發新的、改良的疫苗類型。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是具有廣泛臨床表現的先天性腸道疾病的起因。該病最初被描述為具有高發病率和低死亡率的牛的傳染病。被感染的牛表現出溫度升高、腹瀉和咳嗽。此狀況被稱為牛病毒性腹瀉。現今，BVDV被認為是對全世界經濟具有影響的牛的主要病原體。在牧群中BVDV感染的臨床模式以及由此對生產的影響取決於數種因素的相互作用，包括病毒的株系、牛的年齡、牧群的免疫力以及應激物的相互影響。BVDV-I和B VD V-2二者均在牛中引起急性感染(腹瀉、發熱、出血綜合症)以及(若在懷孕期間發生感染) 流產、胎兒的畸形和小牛的持續感染。瘟病毒的基因組由單鏈(+)RNA組成並包含單個大的開放閱讀框架(ORF)，兩側是 5' UTR和3' UTR。該ORF編碼產生11至12種裂解產物的大前體多蛋白(polyprotein)。 ORF通過細胞的以及病毒的蛋白酶被加工成各種病毒蛋白質。ORF內的病毒蛋白質是以以下次序排列的NH2-Npro-C-Erns-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-C00Ho 瘟病毒的病毒顆粒由四種結構蛋白組成，即小的帶正電荷的核心(C)蛋白，它被認為可能與RNA基因組一起形成核衣殼結構，以及三種糖基化的包膜蛋白(ErnS，El，E2)。主要針對E2-特異性抗體證實了中和活性。例如通過建立缺少結構蛋白質有關基因序列的缺陷型瘟病毒基因組而對瘟病毒複製的最低必要條件進行了研究。研究發現，有缺陷的CSFV基因組仍然複製並且在與輔助A187-CAT RNA —起引入SK-6細胞時可被包裝入病毒顆粒內(Moser et al.，J. Virol.， 7787-7794，1999)。缺少編碼C、Erns, EU E2、p7和NS2的基因的自主複製但有缺陷的 BVDV 基因組已有報導(Behrens et al.，J. Virol.，72，2364-2372，1998)。Beer 等人在 W004/016794中描述了另一種瘟病毒BVDV的反式互補C和El缺失突變體。關於CSFV，已披露了顯示出病毒減毒的突變體。例如，Risattiet al.，Virology 364，371-382，2007，描述了在E2區域內具有取代的、顯示出減毒表型的CSFV突變體。 Maurer et al.，vaccine，23 (25)，3318-28，2005 也描述了 CSFV E2 突變體，其缺少全部或部分E2基因，顯示出對高毒力CSFV的致死性攻擊具有部分保護作用。Meyers et al.,Journal of Virology, 73 (12)，10224-10235，1999 描述了在編碼Erns 蛋白的基因內有導致突變的突變的 CSFV 突變體。Wildjojoatmodjo etal.，J. Virol. , 74 (7), 2973-80, 2000 中描述了 CSFV的反式互補Erns缺失突變體。本發明提供了突變型瘟病毒，它在編碼核心蛋白的基因內有缺失，導致病毒不能表達功能性的核心蛋白質，其中所述病毒進一步的特徵在於在NS3的解旋酶結構域的C末端結構域中包含一個或更多個突變。優選的，本發明的突變型瘟病毒是豬瘟病毒(CSFV)或牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。編碼核心蛋白的基因區域內的突變應該是不能表達功能性核心蛋白質的突變類型。這可通過全部或部分缺失編碼核心蛋白的基因來完成。核心蛋白C末端處的信號序列是多蛋白下遊進一步加工所必需的。因此在缺失(部分)核心基因時應注意保留針對Erns 的轉位信號序列。該轉位序列是位於第250位和第267位胺基酸之間的18個胺基酸的區域，在CSFV Erns 蛋白 N末端前的切割位點之前(Ala-267/Glu_268)。(Ri5menapf et al.，J. Virol.， 65 (2)，589-597，1991 ； Ri5menapf et al.，J. Virol.，67 (6)，3288-3294，1993)。對於 BVDV，在Erns蛋白N末端之前的切割位點是Gly-270/Glu_271。下遊加工所必需序列的確切長度可能在每個株系或細胞類型之間有變化。例如，對於CSFV而言，核心編碼序列可能缺失第169-248位胺基酸(p619)，從而將Npro 的C末端與組成適於Erns的轉位信號的核心蛋白C末端胺基酸融合(CPLWVTSC168/ LEKALLAffAVITILLYQPVAA267/ENIΤ)。對於BVDV而言，核心編碼序列可能缺失胺基酸 169-251，從而將Npro的C末端與組成用於BVDV Erns的轉位信號的核心蛋白C末端胺基酸融合(CPLWVSSC168/LEKALLAWAIIALVFFQVTMG27Q/ENIT)。大部分核心基因的缺失使得 RNA 可以在轉染後複製但不產生有傳染性的病毒後代。通過本發明發現了缺失編碼功能性核心蛋白的基因可以通過病毒基因組NS3區域內的突變進行補償。將這些突變引入其中核心基因已缺失的瘟病毒cDNA拷貝內，(如上所述)可以恢復有傳染性的病毒。NS3區域內的突變集中在NS3解旋酶結構域的C末端， 更具體而言是在C末端結構域的100個胺基酸之內。對於CSFV而言，已鑑定了 NS3區域解旋酶結構域的C末端結構域(第2160-2260位胺基酸)內的7個獨立的突變。依照本發明優選的突變型CSF病毒在NS3解旋酶結構域的C末端結構域內具有一個或多個突變，選自 Asn2177Tyr> Glu2160Gly> Pro2185Thr/Ala> Gln2189Lys> Pro2200Thr 禾Π Asn^^Asp。將突變Asn2177Tyr引入CSFV核心Δ (ρ619)內並進行cRNA的電穿孔導致了有生存能力的傳染性病毒顆粒的驚人釋放。基因組RNA在Northern印跡分析中顯示出大小似乎有輕微的減小，並且濃縮的病毒顆粒不包含核心蛋白。在SK6細胞中病毒滴度高達5 X 105ffu/ ml,因此大約比p447野生型滴度低10倍。接下去將其它突變Glu216tlGly、Pro2185Ala, Gln2189Lys、Pro22tltlThr 和 Asn2256Asp 引入 CSFV 核心 Δ (p619 內，)產生了 ρ 1033 (AIei2185)、 Ρ1034 (Thr2200)、pl035 (Lys2189)、pl036 (Asp2256)、ρ1037 (Gly2160)和 ρ1038 (Asp2256)。在所有情形下，在各自的SP6轉錄物電穿孔後回收到病毒，但生存能力有顯著差異(生長曲線分析)。 最有生存能力的是包含Asn2177Tyr交換的基因組。因此最優選的是本發明的突變型CSFV，其中NS3解旋酶結構域的C末端結構域內的突變包含Asn2177Tyr突變。為了研究這些突變是否具有累加效應，將最強的補償突變體加以合併。對於雙突變而言，將 Asn2177Tyr 與 Glu216tlGly, Pro2185Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr 和 Asn2256Asp 聯合。三突變包含 Asn2177Tyr,連同 I^ro2185Ala 和 I^ro22ciJhiN Pro2185Ala 和 Gln2189Lys^Gln2189Lys 和 ^O22ciciThr 以及 Glu216tlGly 和 Gln2189Lys。所有測試的組合均顯示出相較於單一突變而言生存能力有所降低，表明了添加可行突變改善了核心補償中的NS3。儘管對於親代CSFV野生型而言物理或表型差異不明顯，但CSFV核心Δ在天然宿主內高度減毒。因此本發明的突變型病毒適於用在疫苗中來保護豬抵抗CSFV的感染。對於BVDV而言，已鑑定了 NS3區域解旋酶結構域的C末端結構域(胺基酸 2169-2269)內的8個獨立的突變。本發明優選的突變型BVD病毒在NS3解旋酶結構域的 C末端結構域內具有一個或多個突變，選自Glu2189Lys、Leu2190Pro, Thr2191Ala, Asp2192Glu, Pro2194Leu> Tyr2204His> Asn2265Tyr> Asr^265Asp0最優選的是本發明的突變型BVDV，其中NS3解旋酶結構域的C末端結構域中的突變包含 Asp2192Glu, Tyr2204His, Asn2265Tyr 或 Asn2265Asp 突變。核心蛋白顯然不是形成傳染性顆粒所必需的。顯然C不是瘟病毒裝配所需要的，但它提供了其它功能。它的功能被NS3解旋酶結構域內的突變所抵消。只要保持 Erns的轉位，則對於傳染性病毒顆粒的形成而言就不需要覆蓋CSFV Erns的轉位信號 (LEKALLAffAVITILLYQPVAA268)或 BVDV Erns 的轉位信號(LEKALLAWAIIALVFFQVTMG27CI)(跨越Npro的C末端和Erns的N末端之間距離的序列)的核心蛋白剩餘胺基酸的確切序列。 無關糖蛋白的信號序列在功能上可置換真實的序列。其中核心的剩餘胺基酸已被N-末端 CD46轉位信號完全置換的構建體是可存活的(CD46僅僅作為被轉位細胞蛋白質的例子)。 在引入牛⑶46的跨膜結構域(SSGRSPGWLLLAPLLLLPTSSDA)時，回收到存活的病毒，滴度達到 2X104ffu/ml。在缺少核心的情況下瘟病毒的繁殖為瘟病毒標記疫苗提供了機會。預期在克服瘟病毒感染的動物血清中會存在針對核心蛋白質的抗體。核心蛋白是免疫原性的並且以顯著
量表達。包含本發明傳染性病毒顆粒以及藥用可接受載體的疫苗同樣屬於本發明的部分。 實施例實施例1 核心蛋白缺失構建體為了檢驗NS3中的取代會補償喪失能力的核心蛋白這一假設，將核苷酸改變引入其中核心編碼序列(aa 169-248 (SDDGASG-KPPESRKKL)被缺失的(p619)傳染性CSFV cDNA內。因此Npro的C末端與組成有關Erns的轉位信號的核心部分C末端胺基酸融合 (CPLWVTSC168/LEKALLAWAVITILLYQPVAA267/ENIΤ)。大部分核心基因的缺失使得 RNA 可以在轉染後複製但不產生有傳染性的病毒後代。將突變Asn2177Tyr引入CSFV核心Δ內並進行 cRNA的電穿孔導致了有生存能力的傳染性病毒顆粒的驚人釋放。該基因組RNA在Northern 印跡分析中顯示出大小有輕微的減小，並且濃縮的病毒顆粒不包含核心蛋白。在SK6細胞中病毒滴度高達5X l(fffU/ml，因此比p447野生型滴度低大約10倍。接下去將其它突變 Glu2160Gly, Pro2185Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr 和 Asn2256Asp 引入 CSFV 核心 Δ (ρ619)內， 產生了 pl033 (Ala2185)、pl034 (Thr2200)、pl035 (Lys2189)、pl036 (Asp2256)、pl037 (Gly2160)和 Ρ1038 (Asp2256)。在所有情形下，在經各自的SP6轉錄物電穿孔後均回收到病毒，但生存能力有顯著差異。最有生存能力的是包含Asn2177Tyr交換的基因組(突變體"CSFV1017COre Δ")。核心蛋白顯然不是形成傳染性顆粒所必需的。它的功能可通過NS3的螺旋酶結構域內的突變得到補償。為了評估NS3內的突變對缺失的核心部分的補償是否也適用於BVDV，用引物 BVT86(GCAGCTTGAAACCCATAGGGGGCAG)和 Core268 (CTAGAGAAAGCCCTATTGGCCTG)對含 XhoI/ BglII片段(核苷酸222-2335)的亞克隆進行PCR，去除BVDV cDNA克隆NCP7 (GeneBank 登錄號AF220247)的核心編碼序列。經由測序證實缺失並通過Biol/Ncol片段(核苷酸222-4671)的連接引入全長cDNA克隆中。所產生的缺少核心部分的全長質粒(pl026) 編碼在Erns信號序列之前的NPM，與CSFV核心Δ (p619)類似。在MDBK細胞中pl(^6 的轉錄物是可複製的，但沒有觀察到有傳染性的病毒。將取代ftx)2194Ala、ftx)22(19Tyr和 Asn2265Asp弓I入NCP7 Δ C中使得在對MDBK細胞進行滴定時，傳染性病毒滴度恢復到大約103ffu/ml。經人工改造適於在豬SK6細胞內繁殖的改良NCP7AC顯示在Tyi~22Q4HiS、 Asn2265Tyr, Asn2265Asp, Pro2194Leu, Gln2198Lys 和 Leu2199Pro 情況下有核心補償。以顯著的滴度從SK6細胞中恢復了缺少核心蛋白的NCP7病毒(Asn2265Tyr :3. 3 X IO5, Tyr2204His :2X IO4 以及Asp2192Glu 1. 5X104ffu/ml)。基於有傳染性的BVDV C86拷貝，一種在MDBK細胞中生長良好的正常I型BVDV病毒，如上所述產生了核心部分缺失突變體並引入了類似於 Asn2265Asp (Asn2433Asp)的突變。在SK6細胞中進行轉染後以滴度5 X 104ffu回收到病毒。核心蛋白衍生的跨膜結構域在功能上可被宿主的細胞序列所置換為了排除覆蓋適於Erns的轉位信號(LEKALLAWAVITILLYQPVAA268)的剩餘胺基酸的功能重要性，用牛⑶46的跨膜結構域(SSGRSPGWLLLAPLLLLPTSSDA)置換CSFV核心 ΔΝ2177Υ(ρ1017)內跨越Npro C末端和Erns N末端之間距離的序列。將各自的cDNA (ρ1246) 的SP6轉錄物轉染入SK6細胞內。回收到可存活病毒，滴度達到2Χ 104ffu/ml。材料和方法細胞和病毒將SK6細胞在塑料皿上含10%胎牛血清和非必需胺基酸的DMEM中於具有5% C02的培養箱內進行增殖。每3天對細胞進行傳代。所有CSFV病毒均來自非-CP CSFV株 Alfort-p447(Gallei et al.，J. Virol.，79(4)，2440-2448，2005)。電穿孔將2yg的SP6轉錄物經電穿孔導入5X106個SK6細胞。為此目的，將SK6細胞(90%匯合率)經胰酶消化、用PBS(Ca++和Mg++)漂洗兩次、與轉錄物混合成總體積為310μ 1，然後在2mm間隙的電擊杯中進行電穿孔(Biorad Gen印ulser，0. 18KV和 0. 95 μ Fd)。從電擊杯中回收細胞並接種於35mm塑料皿內補充了 10%胎牛血清的DMEM中。RNA製備和cDNA合成對用挽救的病毒感染的SK6細胞進行漂洗並按製造商的推薦使用foieasy Kit(Quiagen)製備RNA。用由實際目的位置決定的不同引物對2 μ g RNA進行逆轉錄。用合適的引物進行PCR並亞克隆入pGEM-T載體(ftOmega)。實施例2 動物實驗.為了在實驗條件下鑑定豬瘟病毒(CSFV)突變體〃 CSFV1017Core Δ 〃的毒力，進行動物實驗。
目標該實驗的主要目標是研究CSFV突變體〃 CSFV 1017Core Δ 〃是否顯示出與親本株"CSFV Alfort ρ447"相比較而言毒性減弱。站崗豬的使用可以粗略研究病毒的發散和傳播。由於已證實毒性減弱，所以在1月2日用高度致病的CSFV病毒株Koslov對餘下的豬進行攻擊。動物實驗部分I-感染6隻斷奶仔豬是於2006年10月16日購自商業豬場並放入病毒研究所的高容納單元內。將動物隨機分成兩組，每組三隻豬。全部動物均單獨用數字和耳標進行標記。將兩個組(組1 號碼75-77的動物；組2 號碼78-80的動物)在高容納條件(負空氣壓為IOOPa) 下飼養於分開的籠子中，使它們在整個實驗過程中沒有任何的相互接觸。每天餵養動物1 次。水的補給隨意。試驗開始時動物在臨床上是健康的。在實驗開始前收集來自全部動物的血樣並通過中和試驗檢查針對瘟病毒(CSFV)、邊界病病毒(Border Disease Virus,BDV) 和牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的中和抗體的存在。在對新環境適應一段時間後，將每組的兩隻豬分別肌肉內注射約IO7TCID50的CSFV1017 (組1)和CSFV Alfort p447 (組2)進行感染。 在接種後將站崗豬(每組1隻)從組中取出至少12小時。此期間過後將它們再次放入各自的組中。每日監測兩組動物的臨床症狀和體溫。體溫超過40°C記錄為發熱。在實驗過程中，出於使動物安寧的原因將臨床症狀表現為不再能忍受的動物進行安樂死。對所有動物進行屍檢並記錄。在感染後第0，2，4，7，10，14，21和觀天從所有動物中採集血樣(原血和EDTA抗凝血)。另外的樣品是在安樂死的那天採集。將原血樣品以1500rpm於室溫離心 15分鐘(Labofuge 400R, Heraeus，Germany)獲取血清。然後將血清分成0. 5至2ml的合適等分試樣並貯存於-80°C至進一步檢測。部分II-攻擊對經感染(部分I)後繼續存活的豬鼻內施加IO4 5 TCID50的高度致病的CSFV病毒株Koslov進行攻擊(感染後第71天)。在激發後第0，3，6天和各個豬安樂死的當天採集血樣。實驗室檢驗白細胞計數在以乙酸)裂解紅細胞後根據Neubauer (改良的)使用計數室對來自EDTA 血的白細胞進行手動計數。將EDTA血依照Thoma吸入液稀釋移液管中到達0.5刻度。然後，加入乙酸)至刻度11，並將樣品稀釋液溫和搖動約60秒。將稀釋液注入準備好的計數室內，在光學顯微鏡下對白細胞計數區內的白細胞進行計數。依照計數室的說明計算確切的數值。數值在10G/1以下記錄為白細胞減少症(leucopenia)。在感染後第0，2，4， 7，10，14，21和28天進行白細胞計數。中和過氧化物酶聯接抗體檢驗依照歐盟委員會的「診斷手冊」(2002年2月1日的委員會決議2002/106)及其附帶的技術部分，利用分別適於檢測抗CSFV和BVDV/瘟病毒之抗體的以下病毒進行中和過氧化物酶聯接抗體檢驗(NPLA)。· BVDV NADL
.CSFV 參照病毒株〃 Alfort 187〃 (CSF 902)· CSFV Alfort p447 (親本病毒株)· CSFV Koslov (攻擊病毒株).CsFvDkpholz(CSFOKM)用於檢測BVDV抗體的NPLAs用原代胎牛腎臟細胞進行，而用於檢測CSFV抗體的 NPLAs則用永生化的豬腎臟細胞(SK 6)進行。抗體效價表示為在兩個重複孔中阻止病毒複製50%的最高起始血清稀釋度的倒數。用KlRBER的方法計算這些中和稀釋度50% (ND50)。在感染(CSFV Alfort p447，和CSF0902)後第0，10，14，21和沘天進行用於檢測 CSFV抗體的NPLAs。此外，對在攻擊後第0，3，和6天以及進行安樂死的當天採集的樣品進行分析(CSFV Alfort p447，和CSF0902)。用CSFV Koslov和CSFtlltl4對攻擊後所取樣品進行NPLA。在實驗開始前進行關於檢測抗BVDV的中和抗體的NPLA。抗體酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)除了 NPLA之外，對感染後第0，14，21和觀天以及安樂死當天收集的血清樣品進行可商品化購買的抗體的酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)，以檢測針對CSFV的抗體。所有檢驗均完全按製造商說明書所述進行。使用的ELISA檢測試劑盒如下· HerdChek CSFV, Idexx Laboratories, Worrstadt, Germany。病毒分離依照EU診斷手冊(委員會決議2002/106/EC)在永生豬腎臟細胞系SK6和Rie 5-1 上經兩代進行來自白細胞製品的病毒分離。用瘟病毒特異性單克隆抗體BVD/C16 (Peters et al. ,1986)和商品化的物種特異性過氧化物酶聯接綴合物(RAMP0，Dako)進行間接免疫標記。抗原ELISA除了病毒分離之外，還完全按製造商說明書所述進行可商品化購買抗原的酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)。在第0，4，7和10天取樣進行分析。使用的ELISA檢測試劑盒如下· CHEKIT HCV-抗原，構建者 Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern，瑞士結果部分I-感染臨床體徵和溫度(見

圖1)在此實驗的感染期間，只有76號動物在感染後第8天顯示出輕微的發熱 (40. I0C )。對75號和76號動物在感染後的第14天記錄到40. 0°C的次發熱溫度。相反，組2的全部動物均出現發熱。動物78號在感染後第8和第9天以及從感染後第13天直至第觀天實驗結束表現出發熱的溫度。動物79號在感染後第9天以及從第14天直至實驗結束表現為發熱。動物80號在感染後第7、9、10以及從第13天至第20天記錄為發熱的溫度。在第21天，動物80號表現體溫為:35.6°C。組1的動物(75-77號)在實驗的第一部分期間未表現出指示關於CSFV感染的任何臨床體徵，而組2的全部動物(78-80號)則表現出明顯的臨床症狀。不同動物之間的臨床體徵嚴重程度有所不同。動物76號在感染後第44天由於與CSF感染無關的嚴重跛腿而實施安樂死。在實驗過程中，動物78號發生嚴重的腹瀉、結膜炎、厭食、皮膚損傷和運動失調。在感染後第28天將動物安樂死。動物79號只表現出輕微的不典型症狀，包括食慾下降和輕微的腹瀉。該動物在感染後第28天被安樂死。動物80號表現出嚴重的症狀，包括胃腸道和呼吸方面的徵兆、厭食、遲鈍和皮膚損傷。該動物在感染後第21天被安樂死。 白細胞計數(圖2)大體上，組1的動物未顯示白細胞減少症。不過，動物75和77號在感染後第20天顯示出低於10G/1的數值。同一天，動物76號顯示僅10. 3G/1。組2的全部動物在經CSFV Alfort p447感染後均表現為嚴重的白細胞減少症。在動物78號中，白細胞減少症在感染後第4天開始，且在安樂死當天記錄僅為0. 45G/1。站崗豬79號在感染後第21天和第28 天顯示白細胞減少的數值，並且在感染後第14天已達到10.6G/1的極限值。動物80號在感染後第4天開始顯示嚴重的白細胞減少症。感染後第21天終值達1. 4G/1。病理學在實驗的感染部分期間組1的動物未被安樂死。組2的動物顯示不同的病理徵兆。動物78號顯示瀰漫性皮炎，腫脹以及內臟和呼吸道內的出血性淋巴結、胸腺萎縮、支氣管肺炎、潰瘍性胃炎、卡他性腸炎、腎盂腎炎和腎皮層內的瘀點出血。動物79號表現出輕微的胸腺萎縮、內臟和呼吸道內淋巴結輕微腫脹、肺炎(肺葉)、潰瘍性胃炎、嚴重的卡他性腸炎和膀胱炎。動物80號表現為真皮和皮下組織 (肢端、腹部)的瘀點出血、極度擴大的水腫並出血性淋巴結(全身的)、嚴重的胸腺萎縮、 腦膜、脾、會厭、氣管、胃、內臟壁、回盲瓣、膀胱、肝、膽囊和腎臟內的瘀點出血。此外，動物80 號表現出卡他性化膿性肺炎、在心內膜下和心肌內的廣泛出血、嚴重的出血性胃炎、便秘和嚴重的間質性腎炎。抗體檢測中禾口過氧化物醇聯接抗體檢驗(Neutralization peroxidase-linkedantibody assay, NPLA)經檢測全部動物在實驗前均為BVDV/瘟病毒抗體陰性。第0天採集的所有樣品對 NPLA中所用的兩種CSFV株系(CSF0902和Alfortp447)均顯示陰性(< 5ND5(1)結果。利用CSFV株系Alfort p447，組1的動物在感染後第14天開始表現出陽性結果 (動物75號)。具體而言，動物75號在感染後第14天顯示抗體效價為7. 5ND50,並在之後增加到316ND5(1。動物76號在感染後第21和28天顯示抗體效價達158，5ND5(1的陽性結果。 站崗動物77號未顯示任何的抗體效價。利用CSF0902，只有動物76號在感染後第28天顯示出7. 5ND50的低抗體效價。組 2的動物在整個實驗期間進行的所有NPLA中均保持對CSFV抗體陰性(< 5ND5(I)。抗體酶聯免疫吸附檢驗(Ab-ELISA)動物75號在感染後第21天首次顯示不確定的結果，並在感染後第28天為陽性， 而動物76號在感染後第14天顯示不確定的結果並在感染後第21和28天顯示為陽性結果。 動物77號保持陰性。動物78和79號在整個試驗中顯示陰性結果，而動物80號則在安樂死的當天(感染後第21天)顯示出不確定的結果。
病毒分離組1的動物在用SK6和Rie 5-1細胞二者所進行試驗的整個感染部分均顯示陰性結果。動物78號在分別感染SK6和Rie 5_1細胞後的第4、7、10 (只對SK6細胞進行了調查)和14天均顯示陽性結果。此外，該豬在感染Rie 5-1細胞後第2天達到陽性結果。 站崗豬，即動物79號對兩個細胞系均保持陰性。對於SK 6細胞，動物80號在感染後第7、 10和14天顯示陽性結果。對於Rie 5-1細胞在第7和14天(由於缺少樣品材料第10天未檢測)也發現陽性結果。抗原酶聯免疫吸附檢驗(Ag-ELISA)對於組1的所有動物和組2的78和79號動物，其Ag-ELISA均保持陰性。只有動物80號在感染後第10天顯示陽性結果。部分II-攻擊 臨床體徵和體溫在感染後第71天用高度致病的CSFV株系Koslov對經感染後餘留的豬，即動物75 和77號進行攻擊。動物75號未出現發熱溫度或者針對攻擊感染的任何臨床徵兆，在攻擊後第16天安樂死。動物77號在攻擊後第3天出現發熱並持續至安樂死。該動物在攻擊後第8天安樂死，出現嚴重的神經學上的症狀。病理學在攻擊之前，動物76號由於嚴重的跛腿而被安樂死。該動物未顯示CSF指徵性的任何病理損傷。它只表現肺葉的輕微肺炎。除了肺葉的輕微肺炎和輕微的潰瘍性胃炎之夕卜，動物75號未顯示病理學方面的症狀。動物77號顯示腫脹、部分出血性淋巴結、卡他性肺炎、腹水、輕微的潰瘍性胃炎、肝充血、膽囊水腫和間質性腎炎。抗體檢測在攻擊感染後，動物75號顯示160ND5(1的抗攻擊病毒的抗體效價(攻擊後第16 天)，以及> 640的抗CSFciltl4的效價。動物77號保持陰性。概要和結論.CSFV突變體〃 CSFV 1017核心部分Δ"顯示與親本株系"CSFVAlfort p447" 相比近乎完全的毒性減弱。·與組2的動物相反，對於組1動物在不同細胞系上的病毒分離物中未檢測到病
ο·除了站崗豬之外，組1的動物經CSFV 1017Core Δ感染後均產生了中和抗體。 組1的站崗豬在抗體和抗原檢測兩方面均未顯示任何陽性結果。因此，病毒突變體的發散和傳播是極其不可能的。·用高度致病性CSFV株系進行攻擊感染後沒有臨床症狀證實了先前用CSFV 1017Core Δ感染的動物得到了完全保護。·站崗豬在用CSFV Koslov進行攻擊感染後顯示出急性致死的CSF進程。
權利要求
1.突變型瘟病毒，其特徵在於所述病毒在編碼核心蛋白的基因內有突變，導致該病毒不能表達功能性核心蛋白，所述病毒的進一步特徵在於它在NS3之解旋酶結構域的C末端結構域內包含一個或多個突變。
2.依照權利要求1的突變型瘟病毒，其特徵在於所述瘟病毒是豬瘟病毒(CSFV)。
3.依照權利要求2的突變型CSFV，其特徵在於NS3之解旋酶結構域的C末端結構域內的突變選自 Asn2177Tyr> Glu2160Gly> Pro2185Thr/Ala> Gln2189Lys, Pro2200Thr 禾口 Asn22M;Asp。
4.依照權利要求2或3的突變型CSFV，其特徵在於NS3之解旋酶結構域的C末端結構域內的突變包含Asn2177Tyr突變。
5.依照權利要求1的突變型瘟病毒，其特徵在於所述瘟病毒是牛病毒性腹瀉病毒 (BVDV)。
6.依照權利要求5的突變型BVDV，其特徵在於NS3之解旋酶結構域的C末端結構域內的突變選自 Glu2189Lys, Leu2190Pro, Thr2191Ala, Asp2192Glu, Pro2194Leu, Tyr2204His, Asn2265Tyr, Asr^265Asp。
7.依照權利要求5或6的突變型BVDV，其特徵在於NS3之解旋酶結構域的C末端結構域內的突變包含 Asp2192Glu、Tyr22tl4His、Asn2265Tyr 或 Asn2265Asp 突變。
8.一種疫苗，其特徵在於包含根據前述權利要求中任一項的突變型瘟病毒和藥用可接受載體。
全文摘要
本發明涉及突變型瘟病毒以及含所述病毒的疫苗。
文檔編號C07K14/08GK102159705SQ200980136090
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月16日 優先權日2008年9月17日
發明者H·T·魯門納普弗, H-J·斯爾, M·黑曼 申請人:英特威國際有限公司