一種降低γ-聚穀氨酸發酵液粘度的方法
2023-06-20 19:36:31
一種降低γ-聚穀氨酸發酵液粘度的方法
【專利摘要】本發明公開一種降低γ-聚穀氨酸發酵液粘度的方法，包括菌種的活化、種子液製備及液體搖瓶發酵，在所述液體藥瓶發酵中，向液體發酵培養基加入高濃度KCl，所述高濃度KCl為0.5-30g/L；所述菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）GXA-28，保藏編號為CCTCCNO：M2012347，保藏日期為2012年9月14日，保藏單位：中國典型培養物保藏中心。該方法在發酵初期在液態發酵培養基中添加質量體積濃度為0.5-30g/L的KCl，在保持高分子量高產量γ-聚穀氨酸的基礎上，將粘度降為原來的10-80%，解決γ-PGA發酵生產發酵液粘度大的瓶頸問題，有很好的應用前景；且成本低，為工業化生產中產物的分離純化降低成本。
【專利說明】一種降低Y-聚穀氨酸發酵液粘度的方法 【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物發酵領域，特別涉及到一種降低聚穀氨酸發酵液粘度的方 法。 【背景技術】
[0002] Υ -聚穀氨酸是由L-穀氨酸或者D-穀氨酸通過Υ -醯胺基結合形成的一種水溶 性的生物高分子聚合物。具有很強的吸水性，可降解性，水解性等眾多特性，因此被廣泛用 於食品、農業、醫藥、綠化以及水處理等多個領域，具有極大的開發價值和應用前景。
[0003] 根據現在文獻報導，Y -PGA是某些細菌莢膜的主要成分，其作用是為了保護菌體 免受外界惡劣環境的影響。故其合成一般是在菌體發酵的中後期，大量代謝廢物積累，營養 物質缺乏促進了細菌分泌合成Y-PGA進行自身保護。因此可以認為合成分泌γ-PGA是細 菌應對外界惡劣環境的一種適應機制。目前研究的熱點多集中於微生物發酵生產，提高產 量，對如何提高分離提取收率的相關報導非常少。
[0004] 一般認為Y -PGA發酵液的粘度隨著產量和分子量的增加而增大，因此在液態發 酵的後期由於Y-PGA濃度增大導致發酵液粘度大大增加，影響氧的傳質，進而影響γ-PGA 的合成，這也是提高Y -PGA濃度的一個最大的瓶頸問題。通過加酸或鹼調節發酵液ρΗ〈5或 ρΗ>8可明顯降低發酵液的粘度（其中ρΗ3. 5時粘度僅為ρΗ6. 5時的1/50左右）。將ρΗ3. 5 的發酵液離心除菌（l〇〇〇〇g，l〇min)後超濾濃縮（濾膜孔徑0· 45 μ m，平均壓力0· 08Mpa) 1 倍，再加入95%乙醇提取γ -PGA，與pH中性時相比，可減少50%以上的能量消耗及40 %的 溶劑，但聚穀氨酸損失約10%。加酸或加鹼處理可使發酵液中Y-PGA的分子結構發生 改變，分子質量降低，這對生產高分子質量的聚穀氨酸不利的。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種降低Y -聚穀氨酸發酵液粘 度的方法，該方法在發酵初期在液態發酵培養基中添加質量體積濃度為〇. 5_30g/L的KC1， 在保持高分子量高產量聚穀氨酸的基礎上，將粘度降為原來的10-80%，解決Y-PGA發 酵生產發酵液粘度大的瓶頸問題，有很好的應用前景；且成本低，為工業化生產中產物的分 離純化降低成本。
[0006] 為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的：
[0007] -種降低聚穀氨酸發酵液粘度的方法，包括菌種的活化、種子液製備及液體 搖瓶發酵，其特徵在於：在所述液體藥瓶發酵中，向液體發酵培養基加入高濃度KC1，所述 高濃度KC1為0. 5-30g/L ;所述菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GXA-28,保藏編 號為CCTCC N0:M2012347,保藏日期為2012年9月14日，保藏單位：中國典型培養物保藏 中心。
[0008] 以上所述高濃度KC1為5-30g/L。
[0009] 以上所述液體發酵培養基成分還包括葡萄糖30_50g/L、穀氨酸鈉20_40g/L、酵母 膏 2· 5-4. 0g/L、KH2P040. 5-lg/L、MgS040. 1-0. 15g/L，ρΗ6· 5-7. 5,蒸餾水配製。
[0010] 以上所述液體搖瓶發酵的發酵條件為：種子液按體積比1-6%的接種量接入已滅 菌的液體發酵培養基中，在40-50°C搖瓶培養20-30h。
[0011] 以上所述菌種的活化，是將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GXA-28接於固體 斜面培養基上，40?50°C培養8-16h，於2?8°C作短期保藏；所述固體斜面培養基的組成 為：葡萄糖8?12g/L，酵母膏3?6g/L，穀氨酸鈉3?6g/L，MgS0 4 · 7H200. 1?0. 2g/L， ΚΗ2Ρ040· 3 ?0· 5g/L，瓊脂 10 ?15g/L，pH 值 6· 5 ?7· 5,蒸餾水配製。
[0012] 以上所述種子液製備，是將斜面上1. 0cm2的菌苔接入裝有30ml液體種子培養 基的250ml三角瓶中，搖床轉速160?250rpm，42°C -50°C搖瓶培養16h-18h ;所述液體 種子培養基濃度組成為：葡萄糖10?50g/l，酵母膏2?10g/l，穀氨酸鈉5?20g/l， MgS04 · 7Η200· 1 ?0· 5g/l，ΚΗ2Ρ040· 5 ?2g/l，pH 值 6. 5 ?7. 5,蒸餾水配製。
[0013] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0014] 1.本發明以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GXA_28為出發菌株，在高濃度 KC1條件下發酵生產Υ-PGA，一方面K+增加了基質的滲透壓，另一面K+是Υ-PGA合成酶的 促進離子，因此給Y -PGA合成提供了有利的環境，結果是在保持甚至提高產量的基礎上， 使分子量提高到了 3000-40001^&，將粘度降為原來的10-80(%，解決了￥^^^濃度增大導 致發酵液粘度增大的技術問題，有很好的應用前景。
[0015] 2.本發明添加 KC1成本低，可以為工業化生產中產物的分離純化降低成本。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1為聚穀氨酸的分子量電泳圖，
[0017] 圖上從左到右依次為Y -聚穀氨酸標品、實施例1-3 γ -聚穀氨酸對照組以及加入 1((：1濃度0.5、1、5、10、15、2(^/1後得到的￥-聚穀氨酸。
[0018] 序列表是菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GXA-28，CCTCC M2012347 的 16S rDNA核苷酸序列信息。 【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式並不局限於 實施例表示的範圍。
[0020] 本發明所利用的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GXA-28性狀特徵為：
[0021] (1)菌體形態特徵：
[0022] 菌株CCTCC NO :M2012347在固體斜面培養基上50°C培養16h後電鏡觀察，菌體呈 杆狀，大小0.7-0.9Χ2.0-3.0μπι，可運動，革蘭氏染色陽性。菌株CCTCC N0:M2012347在 固體斜面培養基上50°C培養30h後芽孢染色觀察，可見明顯芽孢。
[0023] (2)菌落形態特徵：
[0024] 菌株CCTCC NO :M2012347在固體分離培養基平板上50°C培養24h後，在添加穀氨 酸的平板上，菌落圓形、表面呈樹突狀、邊緣分泌粘稠物、菌落直徑達1. 5-2. 0cm ;在不添加 穀氨酸的平板上，菌落乾燥、扁平、中央凹陷、邊緣不規則。
[0025] 菌株CCTCC NO :M2012347在液體分離培養基中培養，在液體表面可形成菌膜，培 養液略顯渾濁。
[0026] (3)CCTCC NO :M2012347生理生化性質如下表3所示。
[0027] 表 1
[0028]
【權利要求】
1. 一種降低聚穀氨酸發酵液粘度的方法，包括菌種的活化、種子液製備及液體搖 瓶發酵，其特徵在於：在所述液體藥瓶發酵中，向液體發酵培養基加入高濃度KC1，所述高 濃度KC1為0. 5-30g/L ;所述菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GXA-28,保藏編號 為CCTCC NO :M 2012347,保藏日期為2012年9月14日，保藏單位：中國典型培養物保藏中 心。
2. 根據權利要求1所述的降低聚穀氨酸發酵液粘度的方法，其特徵在於：所述高 濃度 KC1 為 5-30g/L。
3. 根據權利要求1或2所述的降低γ-聚穀氨酸發酵液粘度的方法，其特徵在於：所 述液體發酵培養基成分還包括葡萄糖30-50 8/1、穀氨酸鈉20-40 8/1、酵母膏2.5-4.0 8/1、 ΚΗ2Ρ04 0· 5-1 g/L、MgS04 0· 1-0. 15 g/L，pH 6. 5-7. 5,蒸餾水配製。
4. 根據權利要求3所述的降低γ-聚穀氨酸發酵液粘度的方法，其特徵在於：所述液 體搖瓶發酵的發酵條件為：種子液按體積比1-6%的接種量接入已滅菌的液體發酵培養基 中，在40-50°C搖瓶培養20-30h。
5. 根據權利要求3所述的降低γ-聚穀氨酸發酵液粘度的方法，其特徵在於：所述 菌種的活化，是將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GXA-28接於固體斜面培養基上， 4(T50°C培養8-16h，於2~8°C作短期保藏；所述固體斜面培養基的組成為：葡萄糖8~12g/ L，酵母膏：T6g/L，穀氨酸鈉：T6g/L，MgS04*7H20 0· 1、· 2g/L，ΚΗ2Ρ04 0· 3、· 5g/L，瓊脂 10?15g/L，pH值6.5?7.5,蒸饋水配製。
6. 根據權利要求5所述的降低γ-聚穀氨酸發酵液粘度的方法，其特徵在於：所述種 子液製備，是將斜面上1. 〇cm2的菌苔接入裝有30ml液體種子培養基的250ml三角瓶中，搖 床轉速160?250rpm，42°C -50°C搖瓶培養16h-18h ;所述液體種子培養基濃度組成為：葡 萄糖 10-30g/L、穀氨酸鈉 5-10 g/L、酵母膏 5-8 g/L、KH2P04 0.5-1 g/L、MgS04 0.1-0. 15 g/ L、pH 6· 5_7· 5〇
【文檔編號】C12R1/125GK104087628SQ201410174064
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】陳桂光, 王青龍, 曾偉, 梁智群 申請人:廣西大學