一種寨卡病毒非結構蛋白NS2A多肽及其抗體的製備的製作方法

2023-06-20 12:58:34 4

一種寨卡病毒非結構蛋白ns2a多肽及其抗體的製備
技術領域
1.本發明涉及多克隆抗體，具體涉及寨卡病毒非結構蛋白ns2a多肽及其抗體的製備。


背景技術：

2.寨卡病毒(zika virus，zikv)是一種以蚊媒傳播為主的、有包膜、單股正鏈的rna病毒，與登革病毒(dengue virus，denv)、西尼羅病毒(west nile virus，wnv)、日本腦炎病毒(japanese encephalitis virus，jev)等同屬於黃病毒科黃病毒屬。截止到2019年7月份，全球約87個國家或部落報導了zikv的蚊媒傳播感染。寨卡病毒感染孕婦，導致嬰兒小頭症或神經細胞發育異常，感染成年人會導致吉蘭-巴雷綜合症、神經炎或腦膜炎等神經系統損傷疾病。現有研究表明zikv感染可直接或間接導致神經發生、發育及成熟障礙。
3.zikv基因組有一個開放閱讀框，其編碼區的長度約為10.8kb，依次編碼3種結構蛋白：衣殼蛋白(capsid protein，c)、膜蛋白及其前體(membrane protein and its precursor membrane，m/prm)和包膜蛋白(envelope protein，e蛋白)和7種非結構蛋白(nonstructural protein)，即ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5。其中，ns2a參與zikv複製、組裝及出芽並幫助病毒逃逸宿主免疫，還通過降解連接蛋白和鈣粘附蛋白而破壞大腦皮層中的神經發生，進而導致小頭症。ns2a含226個胺基酸，包括7個跨膜區(transmembrane segments，ptms)，n端區域(ptms1-ptms2)靠近er腔，ptms3橫跨er膜，c端區域(ptms4-ptms7)靠近胞質。ns2a的多重跨膜結構導致目前沒有ns2a蛋白的商業化抗體上市，進而使得對ns2a開展的科學研究也相對較為缺乏。
4.本領域中需要能夠引發抗ns2a抗體的免疫原性片段以及抗ns2a抗體。


技術實現要素：

5.目前未有上市可以購買的zikv ns2a抗體。ns2a抗體多重跨膜結構導致其蛋白體外表達較難，而多肽可通過合成獲得。本發明通過抗原軟體預測ns2a蛋白的抗原區域，通過大量篩選工作獲得多肽。隨後，合成該多肽，偶聯klh，免疫紐西蘭大白兔，獲得免疫血清後，通過抗體純化，最終獲得ns2a抗體。經檢測該ns2a抗體能夠檢測zikv ns2a蛋白。
6.在一方面，本發明提供了多肽，其包含以seq id no.1所示的胺基酸序列或其變體，該變體與以seq id no.1所示的胺基酸序列具有90％的序列同一性。
7.在一方面，本發明提供了綴合物，其包含載體蛋白和本文所述的多肽。在一個實施方案中，載體蛋白是klh蛋白。
8.在一方面，本發明提供了多克隆抗體，該多克隆抗體針對寨卡病毒ns2a蛋白。在一個實施方案中，本發明的多克隆抗體可以通過用本文所述的綴合物免疫動物後純化獲得。
9.在一方面，本發明提供了核酸。在一個實施方案中，本發明的核酸可以包含編碼本文所述的多肽的核苷酸序列。
10.在一個實施方案中，核酸還包含編碼純化標籤，例如his標籤、gst標籤、mbp標籤、
sumo標籤或nusa標籤的核苷酸序列。在一個實施方案中，核酸還包含編碼前導序列的核苷酸序列。
11.在一方面，本發明提供了載體，其包含本文所述的核酸。在一個實施方案中，載體包含與核酸可操作連接的表達控制元件，如啟動子、終止子和/或增強子。
12.在一方面，本發明提供了宿主細胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的載體。在一個實施方案中，宿主細胞是真核細胞或原核細胞。在一個實施方案中，真核細胞是酵母細胞、動物細胞和/或昆蟲細胞。在一個實施方案中，原核細胞是大腸桿菌細胞。
13.在一方面，本發明提供了組合物。本發明的組合物可以包含本文所述的多肽。在一個實施方案中，本發明的組合物可以包含本文所述的綴合物。在一個實施方案中，本發明的組合物還可以包含藥學可接受的載體。在一個實施方案中，藥學可接受的載體是佐劑。在一個實施方案中，組合物還包含從寨卡病毒ns2a蛋白衍生的另一種肽。
14.在一方面，本發明提供了製備多克隆抗體的方法，其包括用本文所述的多肽、本文所述的綴合物、或本文所述的包含多肽或綴合物的組合物免疫哺乳動物，從該哺乳動物收集血液，並且從血液收集多克隆抗體。在一個實施方案中，哺乳動物是兔。
15.在一方面，本發明提供了製備本文所述的多肽的方法，其包括培養本文所述的宿主細胞，並且收集所述多肽。
16.在一方面，本發明提供了本文所述的多克隆抗體在製備用於治療和/或診斷受試者中的寨卡病毒感染或者用於檢測寨卡病毒的ns2a蛋白的試劑盒中的用途。
17.在另一個方面，本發明提供了體外或離體檢測寨卡病毒的方法，其包括使本文所述的多克隆抗體與疑似包含寨卡病毒的物體接觸的步驟。物體可以是細胞或者是包含細胞的物質。
18.在另一個方面，本發明提供了檢測ns2a蛋白的方法，其包括使用本文所述的多克隆抗體，通過蛋白質印跡或免疫螢光檢測方法檢測受寨卡病毒感染的細胞中的ns2a蛋白。
19.本發明的優點包括：
20.1.本發明首次提供了一種zikv ns2a多肽及多肽抗體，其胺基酸序列為gstdhmdhfslgvlc，該多肽與klh偶聯後製備了zikv ns2a抗體。
21.2.本發明提供了一種可用於製備zikv ns2a抗體的多肽序列，包括其偶聯了增強抗原蛋白klh，包括其該抗體用於wb及if實驗，及其他類似的抗原抗體識別實驗中。
22.3.相比於源自天然ns2a蛋白的其他肽，本發明的多肽可以在蛋白質印跡和免疫螢光檢測法中檢測受寨卡病毒感染的細胞中的ns2a蛋白。
23.4.本發明的多肽的長度僅為14個胺基酸，容易合成，並且可以在兔中產生高滴度的抗ns2a抗體。
24.5.與目前現有的檢測寨卡病毒感染的商業抗體，本發明的多克隆抗體可以更好地檢測寨卡病毒感染(在更早期的感染時間點和更高的靈敏性)。
附圖說明
25.圖1：純化抗體多肽4抗體的western印跡檢測。隨時間變化不同抗體的檢測結果。
26.圖2：純化抗體多肽1抗體的western印跡檢測。左側圖為多肽1抗體，以0.65μg/ml濃度使用；右側圖為多肽1抗體，以1μg/ml濃度使用。
27.圖3：純化抗體多肽4抗體的elisa檢測。
28.圖4：純化抗體多肽4抗體的免疫螢光(if)檢測。前兩行為多肽4抗體檢測的結果；中間兩行為e抗體檢測的結果；最後兩行為ns1抗體檢測的結果。e抗體為由4g2雜交瘤細胞製備的鼠單克隆抗體(由中山大學的江麗芳教授贈送的雜交瘤4g2產生)。
29.圖5：對圖4的實驗結果進行統計分析，以圖4的照片中隨機選擇3個視野進行統計分析，使用統計軟體為spss13.0，統計方法為雙尾t-檢驗，*,p＜0.5；***，p＜0.001。
30.圖6：多肽4抗體特異性識別寨卡病毒的ns2a。a)多肽4抗體對不同病毒的免疫螢光(if)檢測。b)多肽4抗體對不同病毒的wb檢測。c)不同病毒株的多肽序列比對。
具體實施方式
31.為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明的實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
32.如本文中所用，「多肽」是指zikv ns2a衍生的具有免疫原性或抗原性的多肽。多肽的長度可以是10-15個胺基酸殘基，例如11、12、13和14個胺基酸殘基。在本文中，多肽包含以seq id no.1(gstdhmdhfslgvlc)所示的胺基酸序列或其變體，該變體與以seq id no.1所示的胺基酸序列具有90％的序列同一性，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
33.如本文中所用，「載體蛋白」是指任何在免疫學上可接收的用於形成完全抗原的蛋白質。載體蛋白包括但不限於牛血清白蛋白、卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白(klh)、人血清白蛋白(hsa)及人工合成的多聚賴氨酸(pll)等。在本文中，載體蛋白可以是鑰孔血藍蛋白(klh)。載體蛋白可以交聯於半抗原和其他抗原，例如多肽，以增強它們的免疫原性。
34.如本文中所用，「綴合物」是指將多肽與載體蛋白綴合形成的物質，其能夠在機體中產生抗體免疫應答。產生綴合物的方式是本領域中公知的。例如，可以使用化學試劑，諸如碘乙醯胺(iodoacetamide)、馬來醯亞胺(maleimide)、或烷基滷(alkyl halide)將載體蛋白與抗原肽綴合。這可以通過載體蛋白上的氨基和抗原肽上的硫氫基進行。
35.如本文中所用，「佐劑」是指能夠增強免疫應答或改變免疫應答類型的物質，應用時可與抗原同時或預先注射與機體。佐劑本身可以有免疫原性，也可以沒有免疫原性。佐劑可以包括無機佐劑(如氫氧化鋁、明礬等)；生物性佐劑(如結核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內毒素、霍亂毒素b亞單位、胞壁醯二肽和細胞因子等)；人工合成佐劑(如雙鏈多聚肌甘酸：胞苷酸(poly i:c)、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸)；弗氏完全佐劑、花生油乳劑；納米佐劑等。
36.如本文中所用，「變體」是指與參考多肽相比具有1個或多個胺基酸殘基的突變(諸如添加、缺失、取代、插入)的多肽。例如，與以seq id no.1所示的胺基酸序列相比，變體可以具有1個或多個胺基酸殘基的突變(諸如添加、缺失、取代、插入)。優選地，突變是保守的胺基酸取代。
37.如本文中所用，「核酸」是指通過核苷酸間連接的多個核苷酸。核苷酸間連接可以是例如磷酸二酯鍵。本文中的核酸可以包含編碼本發明的多肽的多核苷酸。
38.如本文中所用，「多克隆抗體」是對特定抗原所產生的一組免疫球蛋白混合物，每種免疫球蛋白能識別抗原分子上的一個表位。在本文中，多克隆抗體是通過用本文所述的綴合物免疫兔產生的。本文中的多克隆抗體可以用於檢測zikv ns2a或者體外或離體檢測寨卡病毒。
39.為了便於多肽後續處理，本發明的核酸還可以包含編碼純化標籤，例如his標籤、gst標籤、mbp標籤、sumo標籤或nusa標籤的核苷酸，以及當需要時編碼前導序列的核苷酸。
40.如本文中所用，術語「載體」是可將多核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白質獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限於：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動物病毒等。載體可以含有多種控制表達的元件，包括但不限於啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體可以包含本發明的核酸以便於導入細胞進行表達。載體可以包含與所述核酸可操作連接的表達控制元件，如啟動子、終止子和/或增強子。
41.如本文中所用，術語「宿主細胞」是已經通過分子生物學技術將核酸分子引入的細胞。這些技術包括轉染病毒載體，用質粒載體轉化，以及通過電穿孔、脂轉染、和粒子槍加速引入裸dna。宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。例如，真核細胞是酵母細胞、動物細胞和/或昆蟲細胞。原核細胞可以是大腸桿菌細胞。
42.多肽、載體蛋白和綴合物
43.本發明提供了多肽、載體蛋白和綴合物。多肽可以是seq id no.1(gstdhmdhfslgvlc)所示的胺基酸序列或其變體。多肽可以用作免疫原性多肽或抗原多肽以免疫動物產生多克隆抗體。在本文中，可以使用載體蛋白與多肽綴合後得到綴合物免疫動物以增加多克隆抗體的產生。綴合的方式是本領域中已知的。例如，可以使用化學試劑，諸如碘乙醯胺(iodoacetamide)、馬來醯亞胺(maleimide)、或烷基滷(alkyl halide)將載體蛋白與抗原肽綴合。這可以通過載體蛋白上的氨基和抗原肽上的硫氫基進行。使用多肽或綴合物免疫動物以獲得多克隆抗體的方法是本領域中已知的。動物可以是哺乳動物，例如兔、小鼠、豚鼠等。
44.試劑盒
45.本發明的各種材料，包括多肽、載體蛋白、綴合物、抗體(例如多克隆抗體)、佐劑等都可以製備成試劑盒。試劑盒也包含本文所述的各種材料(例如多肽、載體蛋白、綴合物、抗體)中的任一種或多種。試劑盒可以用於各種的目的，例如用於治療和/或診斷受試者中的寨卡病毒感染，體外或離體檢測寨卡病毒或檢測寨卡病毒的ns2a蛋白。
46.應用
47.本發明的各種材料，包括多肽、載體蛋白、綴合物、抗體(例如多克隆抗體)可以在多個方面得到應用。例如，本發明的多克隆抗體可以用於治療和/或診斷受試者中的寨卡病毒感染或者用於檢測寨卡病毒的ns2a蛋白的方法。方法可以包括使用多克隆抗體檢測ns2a蛋白的步驟。例如，可以通過蛋白質印跡或免疫螢光檢測方法檢測受寨卡病毒感染的細胞中的ns2a蛋白的存在。本發明的多克隆抗體也可以用於體外或離體檢測寨卡病毒的方法，
其包括使多克隆抗體與疑似包含寨卡病毒的物體，例如細胞接觸的步驟。
48.實施例
49.提供以下實施例來闡述本發明。本領域技術人員應當理解實施例僅僅是例示性的，而非限制性的。本發明僅僅由所附權利要求書的範圍限定。
50.實施例1：抗原性區域篩選
51.為了篩選獲得ns2a的抗原性區域，首選使用genscript optimumantigen
tm
設計軟體對ns2a的抗原性、親疏水性、跨膜區、同源性、螺旋區、信號肽等進行了預測分析。預測分析結果見表1。表1根據多肽抗原性預測數值的高低排序了胞外的多肽1-多肽8，其中多肽1的抗原性最高。
52.表1：ns2a抗原多肽篩選結果
[0053][0054]
實施例2：多肽抗體的製備
[0055]
發明人選擇多肽1-多肽8，並且委託金斯瑞生物科技有限公司進行多肽的合成和抗體的製備。具體地，委託金斯瑞生物科技有限公司商業合成多肽1-多肽8，並偶聯klh蛋白。將偶聯klh的多肽與金斯瑞生物科技有限公司的自有佐劑混勻，背部多點免疫紐西蘭大白兔，免疫多次。在終免後收集兔子的抗血清，約獲得抗血清40ml/只。使用抗原親和純化抗體，通過檢測od
280
檢測抗體濃度並且產生多肽1-8各自製備的抗體(上述步驟委託金斯瑞完成，使用金斯瑞生物科技有限公司內部免疫流程)。
[0056]
實施例3：多肽抗體的wb檢測
[0057]
在本實施例中，多肽1和多肽4各自製備的抗體的純品(多肽1抗體和多肽4抗體)由金斯瑞生物科技有限公司。發明人使用多肽1抗體和多肽4抗體分別進行了western blot(wb)免疫印跡。發現了多肽4抗體在western blot(wb)免疫印跡中具備更佳的檢測效果。
[0058]
1.western blot(wb)免疫印跡，是將蛋白質變性後轉移到膜上，然後利用抗體進行檢測的方法，常用於檢測目標蛋白的表達水平；在本實施例中用此方法檢測用多肽4製備的兔抗體對目標蛋白ns2a線性表位的識別能力。具體原理如下：首先收集蛋白樣品，經過sds-page膠分離後，將蛋白轉移到固相載體硝酸纖維素薄膜上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，由於上樣前蛋白質經過變性，此時樣本中暴露的蛋白表位主要是線性表位。以固相載體上的蛋白質作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與辣根過氧化物酶酶標記的第二抗體起反應，經過底物顯色以檢測電泳分離的特異性目的蛋白。
[0059]
將生長狀態良好的hmc3細胞鋪於6孔板中，5x105/孔，37℃、5％ co2培養24h後使用。接種zikv/sz01病毒株(genbank號：ku866423)(0.1moi)於hmc3細胞，37℃、5％ co2培養0、12、24、36、48及60h後收集細胞裂解液進行wb。將樣本加於5％濃縮膠(pg113，雅酶生物)
和12％分離膠(pg113，雅酶生物)的sds-pag膠，在電壓80v和120v分別運行20和80min。隨後在300ma恆流條件下將蛋白樣品轉pvdf膜60min。5％脫脂奶粉(tbs溶液配置)封閉60min後，去封閉液，針對擬觀察條帶預期所處位置進行裁膜，隨後分別加入ns2a抗體多肽4抗體、ns1抗體(gtx634158，genetex)或e抗體(b1845，北京博奧龍)(1μg/ml)以及抗gapdh抗體，抗體均使用tbs進行稀釋，4℃孵育過夜。使用tbst清洗3次，每次10min。加入hrp標記抗兔二抗(sa00001-2，proteintech)或抗鼠二抗(sa00001-1，proteintech)，室溫孵育1h，用tbst洗10min x 3次。使用顯色液(wbkls0500，millipore)和全自動化學發光成像分析系統(5200，tanon)顯色。
[0060]
圖1中顯示了本實驗的結果。
[0061]
由圖1可見，由多肽4製備的抗體特異性識別zikv感染細胞後15-25kda之間的一條帶(與預期的ns2a蛋白相符)，且隨著zikv感染時間的延長而表達升高。由於此表達趨勢與zikv感染後其ns1蛋白的表達趨勢一致，而對於zikv結構蛋白e則在24h表達趨於穩定，據此認為抗體能夠特異性識別zikv ns2a線性表位。在此檢測項目中，使用由genetex公司購買的ns1抗體(gtx634158)和由北京博奧龍購買的e抗體(b1845)作為病毒感染細胞後對蛋白樣品檢測的抗體對照。
[0062]
2.將生長狀態良好的hmc3細胞鋪於6孔板中，5x105/孔，37℃、5％ co2培養24h後使用。接種zikv/sz01病毒株(0.1moi)於hmc3細胞，37℃、5％co2培養12、24、48h後收集細胞裂解液進行wb，未感染組(mock，不添加病毒)作為對照。將樣本加於5％濃縮膠和12％分離膠(pg113，雅酶生物)的sds-pag膠，在電壓80v和120v分別運行20和80min。隨後在300ma恆流條件下將蛋白樣品轉pvdf膜60min。5％脫脂奶粉封閉60min後，去封閉液，加入ns2a抗體多肽1抗體(0.65或1μg/ml)，4℃孵育過夜。使用tbst清洗3次，每次10min。加入hrp標記抗兔二抗，室溫孵育1h，用tbst洗10minx3次。使用顯色液(wbkls0500，millipore)和化學發光成像分析系統(5200，tanon)顯色。
[0063]
圖2中顯示了本實驗的結果。
[0064]
由圖2可見，雖然使用多肽1製備的抗體在pvdf膜上看到條帶，但是在對照組位置均有相應的條帶，雜帶多，特異性差，不同抗體濃度檢測均有雜帶。
[0065]
實施例3的實驗證明了多肽1誘導產生的抗體經驗證不能在wb中有效識別ns2a。與多肽1製備的抗體(多肽1抗體)相比，多肽4製備的抗體(多肽4抗體)可以特異性檢測ns2a蛋白。
[0066]
實施例4：多肽抗體(多肽4抗體)的elisa檢測
[0067]
酶聯免疫吸附試驗(elisa)是一種酶標固相免疫測定技術，用於檢測抗體識別抗原的能力。本實施例的檢測原理是：首先將抗原(多肽4)結合到固相載體上，即elisa板；隨後將由兔製備的抗體加入板中，用於識別板中的抗原，然後用洗滌的方法除去未反應的部分；隨後使用抗兔-辣根過氧化物酶標記的二抗用於識別板中剩餘的抗體，再次用洗滌的方法去除未反應的部分；加入底物，底物與結合在固相載體上的酶催化產生有色物質，通過定性或定量檢測有色產物量，可確定樣品中抗體的含量。測定值越高，說明與抗原結合的抗體越多，即能識別多肽4的抗體越多。
[0068]
使用pbs包被液將4μg/ml的多肽包被於elisa板，每孔100μl，4℃孵育過夜。第二天，使用pbst洗滌3次，每孔加入100μl 3％ bsa,37℃封閉1h。待pbst洗滌3次後，將1mg/ml
的多肽4抗體及兔免疫前血清進行稀釋，由1：1000二倍比稀釋至1：512000。37℃孵育1h。經pbst清洗5次，加入hrp標記的抗兔二抗，37℃孵育1h。pbst洗滌5次後，顯色劑顯色5-20min，終止液終止，酶標儀上讀取od
450
吸收值。圖3中顯示了檢測的結果。
[0069]
由圖3可知，多肽4抗體對多肽4識別的elisa效價高於1:521000，說明抗體能很好的識別多肽4。
[0070]
實施例5：多肽4抗體的免疫螢光(if)檢測
[0071]
免疫螢光實驗，是以抗原-抗體反應為基礎，對抗原進行原位表達檢測的一種方法。本實施例中的主要原理是：首先將細胞使用固定液固定，用於保護細胞的形成和蛋白的抗原性，由於在實驗中樣品經過固定，此時蛋白暴露的表位主要為結構表位。隨後使用穿孔劑穿孔，使得抗體能夠進入細胞內識別抗原。隨後使用螢光素標記的二抗識別一抗，從而達到對抗原的原位識別。本實施例用於檢測由多肽4製備的兔抗體對目標蛋白ns2a的結構表位的識別。
[0072]
將生長狀態良好的vero細胞鋪於已放vero細胞爬片的24孔板中，5x104/孔，37℃、5％ co2培養24h後使用。接種0.1moi的zikv/sz01於vero細胞，37℃、5％ co2培養48h後使用。棄上清，用250μl 4％多聚甲醛固定細胞10min。隨後使用250μl 0.2％ tritonx-100處理細胞10min，pbs清洗細胞2min
×
3次。3％ bsa封閉非特異性抗原30min後，去封閉液，分別加1％ bsa稀釋的一抗ns2a抗體多肽4抗體、zikv e結構表位4g2抗體或由genetex公司購買的ns1抗體gtx634158(5μg/ml)室溫孵育1h。未感染病毒對照組經過同樣的處理。隨後使用pbs清洗3min
×
3次，棄上清，加入1％ bsa稀釋的二抗alexa fluor 488donkey anti-rabbit igg(thermo fisher scientific)(1:1000稀釋)，室溫孵育1h，用pbs洗3min
×
5次。使用含dapi的防猝滅封片劑封片。待乾片後，於雷射共聚焦顯微鏡下觀察實驗結果。為檢測抗體能否識別zikv ns2a的結構表位，對zikv感染後的vero細胞進行檢測，結果如圖4、圖5所示，在感染zikv的細胞中觀察到ns2a的特異性表達，其主要表達在胞漿。為了評估ns2a抗體的識別效率，發明人使用廣泛應用的zikv e結構表位4g2抗體和由genetex公司購買的ns1抗體gtx634158作為對照。由圖4、5可見，zikv ns2a抗體與zikv e蛋白抗體檢測zikv對vero細胞感染率分別為34.29％和47.29％，而ns1抗體檢測到的感染率僅有7.09％。ns2a抗體的識別效率顯著高於ns1抗體對ns1的識別效率。說明由多肽4製備的抗體能有效識別zikv感染後ns2a蛋白的表達。
[0073]
實施例6：多肽4抗體特異性識別寨卡病毒的ns2a
[0074]
為了檢測多肽4抗體是否特異性識別zikv ns2a，將生長狀態良好的bhk21細胞鋪於已放細胞爬片的24孔板中，5x104/孔，37℃、5％ co2培養24h後使用。接種0.1moi的zikv/sz01、zikv/flr、zikv/mr766、denv-2或yfv-17d病毒株於bhk21細胞，37℃、5％ co2培養30h後使用。棄上清，用250μl 4％多聚甲醛固定細胞10min。隨後使用250μl 0.2％ tritonx-100處理細胞10min，pbs清洗細胞2min
×
3次。3％ bsa封閉非特異性抗原30min後，去封閉液，分別加1％ bsa稀釋的一抗ns2a抗體多肽4抗體(5μg/ml)室溫孵育1h。使用pbs清洗3min
×
3次，棄上清，加入1％ bsa稀釋的二抗alexa fluor488donkey anti-rabbit igg(thermo fisher scientific)(1:1000稀釋)，室溫孵育1h，用pbs洗3min
×
5次。使用含dapi的防猝滅封片劑封片。待乾片後，於雷射共聚焦顯微鏡下觀察實驗結果。由圖6的a圖可見，多肽4抗體有效識別多種zikv毒株感染後的細胞，包括zikv/sz01、zikv/flr、zikv/mr766，但是不識別
denv-2和yfv-17d感染細胞，說明多肽4抗體特異性識別寨卡病毒的ns2a。
[0075]
為了進一步檢測多肽4抗體是否特異性識別zikv ns2a，將生長狀態良好的vero細胞鋪於6孔板中，5x105/孔，37℃、5％ co2培養24h後使用。接種0.1moi的zikv/sz01、zikv/flr、zikv/mr766、denv-2或yfv-17d病毒株(見yu,y.,deng y.q.,zou p.,et al.,a peptide-based viral inactivator inhibits zika virus infection in pregnant mice and fetuses.nat commun,2017.8:15672)(0.1moi)於vero細胞，37℃、5％ co2培養36h後收集細胞裂解液進行wb。將樣本加於5％濃縮膠(pg113，雅酶生物)和12％分離膠(pg113，雅酶生物)的sds-pag膠，在電壓80v和120v分別運行20和80min。隨後在300ma恆流條件下將蛋白樣品轉pvdf膜60min。5％脫脂奶粉(tbs溶液配置)封閉60min後，去封閉液，針對擬觀察條帶預期所處位置進行裁膜，隨後分別加入ns2a抗體多肽4抗體(1μg/ml)或抗gapdh抗體，抗體均使用tbs進行稀釋，4℃孵育過夜。使用tbst清洗3次，每次10min。加入hrp標記抗兔二抗(sa00001-2，proteintech)或抗鼠二抗(sa00001-1，proteintech)，室溫孵育1h，用tbst洗10min x 3次。使用顯色液(wbkls0500，millipore)和全自動化學發光成像分析系統(5200，tanon)顯色。由圖6的b圖可見，多肽4抗體在zikv/sz01、zikv/flr、zikv/mr766感染細胞樣本中檢測到特異性條帶，條帶大小均處於15-25kda之間，而在denv-2和yfv-17d感染細胞中未見特異性條帶(圖6的b圖)。進一步提示，多肽4抗體特異性識別寨卡病毒的ns2a。
[0076]
隨後發明人使用mage5.1軟體將zikv/sz01、zikv/flr、zikv/mr766、denv-2和yfv-17d病毒的ns2a蛋白與多肽4進行比對，發現不同株ns2a對應胺基酸序列與多肽4胺基酸序列100％一致；而denv-2和yfv-17d的同源性分別為57.1％,和14.3％(圖6的c圖)。胺基酸序列同源性的差異，可能導致了多肽4對不同黃病毒ns2a蛋白的特異性識別差異。
[0077]
發明人發現抗原分析軟體預測的抗原性較高的肽在免疫動物時可能不會誘發特異性抗體。儘管軟體考慮到了可能的二級結構，但它主要分析蛋白質的胺基酸序列，可能會丟失一些信息。在無晶體結構的情況下，分析軟體不能代替考慮蛋白質的整體構象。因此，抗原預測、動物免疫和抗體特異性檢測是用多肽製備抗體所不可缺少的。