一種利用光照刺激提高微生物類胡蘿蔔素產量的方法
2023-06-20 12:49:42
1.本發明屬於微生物發酵技術領域，具體涉及一種利用光照刺激提高微生物類胡蘿蔔素產量的方法。
背景技術：
2.微生物油脂又稱單細胞油脂，是由酵母類、黴菌類、細菌類和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂為碳源、氮源、輔以無機鹽生產的油脂和另一些有商業價值脂質。在適宜條件下， 某些微生物產生並儲存的油脂佔其生物總量20%以上， 具有這樣表型的菌株稱為產油微生物。
3.微生物油脂中含有大量不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸是構成生物體內脂肪的一種脂肪酸，是機體不可缺少的脂肪酸。不飽和脂肪酸根據雙鍵個數的不同，分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸兩種。食物脂肪中，單不飽和脂肪酸有油酸等，多不飽和脂肪酸有亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等，人體不能合成亞油酸和亞麻酸，必須從食物中補充。作為一個重要的有機化合物，被廣泛用於人體調節血脂、清理血栓、參與免疫調節，改善關節炎症減輕疼痛等，因此生產不飽和脂肪酸具有強大的經濟效益。
4.類胡蘿蔔素是一類重要的天然色素的總稱， 普遍存在於動物、高等植物、真菌、藻類的黃色、橙紅色或紅色的色素之中。它是含40個碳的類異戊烯聚合物， 即四萜化合物。典型的類胡蘿蔔素是由8個異戊二烯單位首尾相連形成。類胡蘿蔔素的顏色因共軛雙鍵的數目不同而變化。共軛雙鍵的數目越多， 顏色越深、越接近紅色。
5.目前圓紅冬孢酵母的發酵工藝，搖瓶培養階段的條件大都為30 ℃，180 rpm培養120 h，關於改變光照條件來控制圓紅冬孢酵母產物積累的專利甚少。人們普遍認為發酵時溫度越高，菌體生產越快，菌體衰亡的也越早，導致發酵周期縮短，但不利於最終放罐效價的積累。受此認識的影響，優於現有圓紅冬孢酵母的發酵工藝中發酵罐的溫度禁錮在30 ℃的情況下，因而發酵周期長，生產效率低，生產成本高，經濟效益差等問題，不利於工業化生產的長遠發展。但通過光照，可縮短圓紅冬孢酵母的發酵周期並有利於發酵後期的產物積累。
技術實現要素：
6.本發明的目的在於提供一種利用光照刺激提高微生物類胡蘿蔔素產量的方法。
7.為實現上述技術目的，本發明採用如下技術方案：一種利用光照刺激提高微生物類胡蘿蔔素產量的方法，包括斜面培養、種子培養、發酵培養類胡蘿蔔素生產菌株，所述類胡蘿蔔素生產菌株為圓紅冬孢酵母菌，發酵培養過程中每天光照12 h。
8.作為一種優選的實施方式，在斜面培養後，對菌種進行活化。
9.作為一種優選的實施方式，菌種活化的方式為：在有氧培養箱中活化培養直至長出單菌落。
10.作為一種優選的實施方式，所述種子培養的培養基為ypd培養基。
11.作為一種優選的實施方式，將種子培養後的種子液按10%接種量接種至發酵培養基進行發酵培養。
12.作為一種優選的實施方式，所述發酵培養的條件為180rpm，30℃培養。
13.作為一種優選的實施方式，所述斜面培養的培養基成分為：葡萄糖10 g/l、酵母粉20 g/l、蛋白腖20 g/l、瓊脂粉20 g/l。
14.作為一種優選的實施方式，所述種子培養的培養基成分為：葡萄糖10 g/l、酵母粉20 g/l、蛋白腖20 g/l。
15.作為一種優選的實施方式，所述發酵培養的培養基成分為：葡萄糖70 g/l、硫酸銨0.1 g/l、酵母提取物0.75 g/l、kh2po
4 0.4 g/l、mgso4·
7h2o 3.07g/l、微量元素znso4、cacl2、mncl2、cuso4分別為0.1927g/-7 g/l、0.167 g/l、0.5477g-4 g/l、0.1677g-4 g/l。
16.作為一種優選的實施方式，發酵培養時，使用4m naoh和1m h3po4調節發酵體系ph值，控制ph值為6.0。
17.本發明在圓紅冬孢酵母培養過程中採用分時間段進行光照的發酵工藝，縮短了現有技術中圓紅冬孢酵母發酵生產類胡蘿蔔素的時間並提高了產量，將發酵周期縮短了、降低了發酵成本、提高了發酵效率，能夠為工業化生產帶來巨大的經濟效益。
附圖說明
18.圖1為實施例1~2發酵結果，其中a：發酵od
600 nm
生長情況；b：發酵類胡蘿蔔素產量。
具體實施方式
19.本發明所使用的菌種為：圓紅冬孢酵母（rhodosporidium toruloides）z11，已於申請人的在先專利申請cn 113308387a中公開，保藏編號為cctcc no：m 2021226。
20.本發明所採用的類胡蘿蔔素提取方法為：採用分光光度計（od
455 nm
）：將發酵結束後的菌液一式兩份，10000 rpm，3 min；一份菌泥至於105 ℃烘乾過夜至恆重，用於檢測其生物量m；一份菌泥加入400 μl，3m hcl，沸水浴3 min後再冰水浴3 min，13000 rpm，5 min；棄去上清液，向菌體中加入300 μl丙酮，浸提1 h，取帶有類胡蘿蔔素的上清保存好，重複此操作3-4次，直至菌體無色結束，最後合併丙酮，分別加入0.5 ml去離子水和石油醚，離心後棄去無色層，用分光光度計測od
455 nm
，最終得到類胡蘿蔔素c（μg/g）=(od
455 nm
ꢀ×
v(ml)
×
104)/2680*m(g)；(v為樣品溶液即丙酮體積)。
21.實施例中使用的培養基配方如下：斜面培養基（g/l）：葡萄糖10 g/l、酵母粉20 g/l、蛋白腖20 g/l、瓊脂粉20 g/l。ph6.0、115 ℃滅菌20 min；種子培養基（g/l）：葡萄糖10 g/l、酵母粉20 g/l、蛋白腖20 g/l。ph6.0、115 ℃滅菌20 min；發酵培養基（g/l）：葡萄糖70 g/l、硫酸銨0.1 g/l、酵母提取物0.75 g/l、kh2po
4 0.4 g/l、mgso4·
7h2o 3.07g/l、微量元素znso4、cacl2、mncl2、cuso4分別為0.1927g/-7 g/l、0.167 g/l、0.5477g-4 g/l、0.1677g-4 g/l。ph6.0、115 ℃滅菌20min。
22.以下結合具體實施例對本發明所述技術方案做了進一步詳細的說明。
23.實施例1實施例1為無光照條件下發酵情況，具體為：（1）菌種活化：菌種在斜面培養基中進行平板劃線後，在30 ℃有氧培養箱中活化培養48 h，直至長出單菌落；（2）種子培養：挑取單菌落放於裝有5 ml ypd培養液的試管中，放入30 ℃搖床於180 rpm培養28 h；將1 ml種子液接入裝有50 ml ypd的搖瓶中放大培養28 h作為種子液；（3）搖瓶發酵培養：將活化好的種子液接入搖瓶中，接種量為10%（v/v），攪拌速度為180 rpm，30 ℃黑暗處發酵培養；同條件做三組平行實驗，結果如表1：表1 實施例1的發酵結果
實驗批次od
600nm
發酵96h類胡蘿蔔素含量（μg/g）發酵120h類胡蘿蔔素含量（μg/g）146.1490.25654.54249.1486.62616.45348.7704.70536.99
實施例2實施例2和實施例1的不同之處僅在於步驟（3）中每天光照12 h，其餘時間無光照培養，發酵期間其他操作均相同。
24.同條件做三組平行實驗，結果如表2：表2 實施例2的發酵結果
實驗批次od
600nm
發酵96h類胡蘿蔔素含量（μg/g）發酵120h類胡蘿蔔素含量（μg/g）459.3898.02754.56559.7726.27755.67657.4661.47728.25
可以看出，本技術的圓紅冬孢酵母光照發酵工藝與現有技術中的發酵結果相比，提高了圓紅冬孢酵母的類胡蘿蔔素的產量，當發酵條件為：初始糖濃度為70 g/l、ph為6.0，溫度及轉速控制為30℃、180 rpm，培養120 h，圓紅冬孢酵母搖瓶od可達59.7，類胡蘿蔔產量可達898.02 μg/g。此結果遠遠高於現有技術中的發酵結果，進一步提高了生產效率，降低了生產成本，可以為圓紅冬孢酵母的類胡蘿蔔素的工業化生產帶來可觀的經濟效益。