殼聚糖內切酶的製備方法
2023-05-09 05:31:41
專利名稱：殼聚糖內切酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種殼聚糖內切酶的製備方法。
背景技術：
殼聚糖(chitosan)是由氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接成的具有生物活性的高分子聚合物，化學名為聚2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。它主要是以被廢棄的蝦殼、蟹殼為原料，經脫鈣、去除蛋白和脫乙醯基等化學過程而得到的。其分子結構式如下圖所示。
殼聚糖具有許多獨特的生物活性。1991年的國際甲殼素大會把殼聚糖確定為除了糖、蛋白質、脂肪、維生素和礦物質之外的第六大生命要素，對它們在醫療保健方面的作用給予了很高的評價。殼聚糖的許多生物活性需要以低分子量或者殼寡聚糖的形式才能體現出來，如抗腫瘤、免疫激活、用作基因載體等。但是由於人體內殼聚糖酶和胃酸的含量很少，殼聚糖的作用效果受到了很大的限制。
低聚糖的製備主要有化學法、氧化法、超聲波法和酶降解法。同其他方法相比較，酶法降解製備殼低聚糖具有反應條件溫和、操作簡單、產物殼低聚糖的相對分子質量容易控制、不產生二次汙染等優點。
目前用於殼聚糖降解的酶有專一性殼聚糖酶，也有非專一性酶如纖維素酶、脂肪酶、溶菌酶等，市售非專一性酶的純度和活力都不大高，而成本較高，不適用於製備相對分子質量分布較窄的高純度殼低聚糖產品。因此，製備高純度殼聚糖內切酶是本領域研究的一個熱點問題。本發明公開了一種製備高純度殼聚糖內切酶的方法。從青黴菌發酵粗酶液中分離純化得到一種殼聚糖內切酶，適用於製備相對分子質量分布較窄的高純度殼低聚糖產品。
發明內容
本發明的目的提供一種製備殼聚糖內切酶的方法。
方法的步驟如下1)將保藏號為CGMCC No.0851的高產殼聚糖酶生產菌(Penicillium sp)接種在5L的發酵罐中，培養基裝液量3-4L，接種量為10％-20％，培養溫度為26-32℃、攪拌速度為200-500r·min-1、通氣量為1.5-5L·min-1，發酵50-80小時後，過濾除去懸浮菌體得到殼聚糖粗酶液；2)截留相對分子質量為2-20kDa的超濾膜對粗酶液進行超濾，然後，用3-5倍的冰乙醇沉澱或者用20％-80％硫酸銨分級沉澱得到殼聚糖粗酶沉澱物；3)用pH4.4-5.5，10-50mmol乙酸緩衝液溶解殼聚糖粗酶沉澱物，再上HiPrep 16/10 SP XL陽離子交換柱，用含0.5-2mol氯化鈉、10-50mmol乙酸緩衝液0-100％線形梯度洗脫，得到殼聚糖內切酶溶液；4)用Sephadex G50凝膠過濾柱過濾，乙酸緩衝液洗脫，濃縮、冷凍、真空乾燥得到殼聚糖內切酶。
培養基為殼聚糖5-40g/L、尿素0.5-3g/L、磷酸二氫鉀0.2-1g/L、；硫酸銨0.5-3g/L、硫酸鎂0.1本發明的優點是酶法降解製備殼低聚糖和殼寡糖具有反應條件溫和，可以控制降解反應速率和產物相對分子質量，不產生二次汙染等優點。特別是使用分離純化後的內切殼聚糖酶降解殼聚糖，可以得到相對分子質量分布較窄的高純度殼低聚糖產品。
具體實施例方式
從高產殼聚糖酶菌株(國家發明專利號ZL 02159880.0，菌種保藏號為CGMCC No.0851)發酵粗酶液，先後採用超濾濃縮、有機溶劑或硫酸銨沉澱、陽離子交換和凝膠過濾的方法分離純化得到一種殼聚糖內切酶。
本發明提供了利用青黴菌發酵製備殼聚糖粗酶液的方法。在5L的發酵罐中，裝入培養基量為3-4L，接種量為10％-20％，培養溫度為26-32℃、攪拌速度為200-450r·min-1、通氣量為1.5-5L·min-1，培養時間50-80小時後，過濾除去懸浮菌體得到殼聚糖粗酶液。
本發明還提供了從殼聚糖粗酶液中分離純化得到殼聚糖內切酶的方法。分別採用超濾濃縮、有機溶劑或者硫酸銨沉澱、陽離子交換和凝膠過濾、冷凍真空乾燥等分離純化的方法，從粗酶液中分離純化得到殼聚糖內切酶。
實施例11、粗酶液的製備取試管斜面保藏菌種8支，活化5小時之後，分別加入無菌水15ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液直接接入5L發酵罐培養基中進行培養。培養溫度28℃，攪拌槳轉速300r·min-1，通氣量為4.5L·min-1，發酵罐培養基組成如下初始pH值為5。
發酵罐培養75小時後，在冰箱中4℃下保存發酵液2小時，然後在6000r·min-1離心後取上清液作為粗酶液，備用。
2、殼聚糖內切酶的分離純化(1)殼聚糖粗酶液的濃縮取上述殼聚糖酶粗酶液，採用超濾方法濃縮，超濾膜面積0.1m2，截留相對分子質量2kDa，操作壓力0.4MPa，截留部分為濃縮的粗酶液。
(2)殼聚糖酶的提取取100ml上述粗酶液，按照冰乙醇和殼聚糖粗酶液3∶1的比例，加入冰乙醇，在4℃條件下靜置，沉澱得到殼聚糖粗酶，用50ml、20mmol的乙酸緩衝液(pH 4.4)溶解。
(3)殼聚糖酶的粗分離採用陽離子交換柱HiPrep 16/10 SP XL，平衡緩衝液為30mmol乙酸緩衝液(pH4.4)，洗脫緩衝液為含1mol氯化鈉的30mmol乙酸緩衝液，0-100％線形梯度洗脫，分步收集。此過程可以將殼聚糖內切酶同外切酶、雜質蛋白質分開，收集殼聚糖內切酶溶液。
(4)殼聚糖內切酶的精製根據殼聚糖內切酶和雜質蛋白相對分子質量的差異，採用凝膠過濾柱Sephadex G-50，緩衝液為20mmol乙酸緩衝液(pH4.4)，精製得到殼聚糖內切酶溶液，比活力478U/mg，冷凍真空乾燥後得到殼聚糖內切酶產品。
實施例21、粗酶液的製備取試管斜面保藏菌種10支，活化5小時之後，分別加入無菌水15ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液直接接入5L發酵罐培養基中進行培養。培養溫度30℃，攪拌槳轉速400r·min-1，通氣量為3.5L·min-1，發酵罐培養基組成如下初始pH值為5。
發酵罐培養70小時後，在冰箱中4℃下保存發酵液2小時，然後在6000r·min-1離心後取上清液作為粗酶液，備用。
2、殼聚糖內切酶的分離純化(1)殼聚糖粗酶液的濃縮取上述殼聚糖酶粗酶液，採用超濾方法濃縮，超濾膜面積0.1m2，截留相對分子質量10kDa，操作壓力0.4MPa，截留部分為濃縮的粗酶液。
(2)殼聚糖酶的提取取100ml上述粗酶液，在4℃條件下緩緩加入硫酸銨使其達到20％飽和度，6000r·min-1離心除去沉澱，繼續加入硫酸銨使其飽和度達到80％，6000r·min-1離心收集沉澱部分，用20ml 20mM的乙酸緩衝液(pH4.8)溶解。使用脫鹽柱進行脫鹽處理，備用。
(3)殼聚糖酶的粗分離採用陽離子交換柱HiPrep 16/10 SP XL，平衡緩衝液為20mM乙酸緩衝液(pH4.8)，洗脫緩衝液為含1mol氯化鈉的20mmol乙酸緩衝液，0-100％線形梯度洗脫，分步收集。此過程可以將殼聚糖內切酶同外切酶、雜質蛋白質分開，收集殼聚糖內切酶溶液。
(4)殼聚糖內切酶的精製根據殼聚糖內切酶和雜質蛋白相對分子質量的差異，採用凝膠過濾柱Sephadex G50，緩衝液為20mmol乙酸緩衝液(pH4.8)，精製得到殼聚糖內切酶溶液，比活力432U/mg，冷凍真空乾燥後得到殼聚糖內切酶產品。
實施例31、粗酶液的製備取試管斜面保藏菌種10支，活化5小時之後，分別加入無菌水15ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液直接接入5L發酵罐培養基中進行培養。培養溫度28℃，攪拌槳轉速500r·min-1，通氣量為5L·min-1，發酵罐培養基組成如下初始pH值為4.5。
2、殼聚糖內切酶的分離純化(1)殼聚糖粗酶液的濃縮取上述殼聚糖酶粗酶液，採用超濾方法濃縮，超濾膜面積0.1m2，截留相對分子質量5kDa，操作壓力0.4MPa，截留部分為濃縮的粗酶液。
(2)殼聚糖酶的提取取100ml上述粗酶液，在4℃條件下緩緩加入硫酸銨使其達到20％飽和度，6000r·min-1離心除去沉澱，繼續加入硫酸銨使其飽和度達到80％，6000r·min-1離心收集沉澱部分，用20ml 10mmol的乙酸緩衝液(pH5.0)溶解。使用透析帶對10mmol的乙酸緩衝液在4℃下透析20小時。
(3)殼聚糖酶的粗分離採用陽離子交換柱HiPrep 16/10 SP XL，平衡緩衝液為50mmol乙酸緩衝液(pH5.0)，洗脫緩衝液為含1mol氯化鈉的50mmol乙酸緩衝液，0-100％線形梯度洗脫，分步收集。此過程可以將殼聚糖內切酶同外切酶、雜質蛋白質分開，收集殼聚糖內切酶溶液。
(4)殼聚糖內切酶的精製根據殼聚糖內切酶和雜質蛋白相對分子質量的差異，採用凝膠過濾柱Sephadex G-50，緩衝液為50mmol乙酸緩衝液(pH5.0)，精製得到殼聚糖內切酶溶液，比活力453U/mg，冷凍真空乾燥後得到殼聚糖內切酶產品。
實施例41、粗酶液的製備取試管斜面保藏菌種15支，活化5小時之後，分別加入無菌水15ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液直接接入5L發酵罐培養基中進行培養。培養溫度32℃，攪拌槳轉速250r·min-1，通氣量為5L·min-1，發酵罐培養基組成如下初始pH值為4.5。
2、殼聚糖內切酶的分離純化
(1)殼聚糖粗酶液的濃縮取上述殼聚糖酶粗酶液，採用超濾方法濃縮，超濾膜面積0.1m2，截留相對分子質量20kDa，操作壓力0.4MPa，截留部分為濃縮的粗酶液。
(2)殼聚糖酶的提取取100ml上述粗酶液，在4℃條件下緩緩加入硫酸銨使其達到20％飽和度，6000r·min-1離心除去沉澱，繼續加入硫酸銨使其飽和度達到80％，6000r·min-1離心收集沉澱部分，用20ml 20mM的乙酸緩衝液(pH5.0)溶解。使用脫鹽柱進行脫鹽處理，備用。
(3)殼聚糖酶的粗分離採用陽離子交換柱HiPrep 16/10 SP XL，平衡緩衝液為20mM乙酸緩衝液(pH5.0)，洗脫緩衝液為含1mol氯化鈉的20mmol乙酸緩衝液，0-100％線形梯度洗脫，分步收集。此過程可以將殼聚糖內切酶同外切酶、雜質蛋白質分開，收集殼聚糖內切酶溶液。
(4)殼聚糖內切酶的精製根據殼聚糖內切酶和雜質蛋白相對分子質量的差異，採用凝膠過濾柱Sephadex G50，緩衝液為20mmol乙酸緩衝液(pH5.0)，精製得到殼聚糖內切酶溶液，比活力496U/mg，冷凍真空乾燥後得到殼聚糖內切酶產品。
權利要求
1.一種殼聚糖內切酶的製備方法，其特徵在於方法的步驟如下1)將保藏號為CGMCC No.0851的高產殼聚糖酶生產菌(Penicillium sp)接種在5L的發酵罐中，培養基裝液量3-4L，接種量為10％-20％，培養溫度為26-32℃、攪拌速度為200-450r·min-1、通氣量為1.5-5L·min-1，發酵50-80小時後，過濾除去懸浮菌體得到殼聚糖粗酶液；2)截留相對分子質量為2-20kDa的超濾膜對粗酶液進行超濾，然後，用2-4倍的冰乙醇沉澱或者用20％-80％硫酸銨分級沉澱得到殼聚糖粗酶沉澱物；3)用pH4.4-5.5，10-50mmol乙酸緩衝液溶解殼聚糖粗酶沉澱物，再上HiPrep 16/10 SP XL陽離子交換柱，用含0.5-2mol氯化鈉、10-50mmol乙酸緩衝液，0-100％線形梯度洗脫，得到殼聚糖內切酶溶液；4)用Sephadex G 50凝膠過濾柱過濾，乙酸緩衝液洗脫，濃縮、冷凍、真空乾燥得到殼聚糖內切酶。
2.根據權利要求1所述一種殼聚糖內切酶的製備方法，，其特徵在於所述的培養基為殼聚糖5-40g/L、尿素0.5-3g/L、磷酸二氫鉀0.2-1g/L、；硫酸銨0.5-3g/L、硫酸鎂0.1-0.5g/L。
3.根據權利要求1所述一種殼聚糖內切酶的製備方法，，其特徵在於所述高產殼聚糖酶生產菌(Penicillium sp)接種是使用斜面培養的菌種直接上發酵罐培養，接種的種子液製備方法是採用100-300ml無菌水洗下5-15支25ml斜面中培養得到的真菌孢子，直接接種到發酵罐中。
全文摘要
本發明公開了一種殼聚糖內切酶的製備方法。用高產殼聚糖酶菌株(國家發明專利號ZL 02159880.0，菌種保藏號為CGMCC No.0851)，接種到加入適量殼聚糖、氮源和無機鹽的溶液的發酵罐中培養，過濾除去大部分懸浮菌體，得到殼聚糖酶粗酶液，發酵粗酶液，先後採用超濾濃縮、有機溶劑或硫酸銨沉澱、陽離子交換和凝膠過濾、冷凍真空乾燥等分離純化的方法分離純化得到一種殼聚糖內切酶。本發明的菌種遺傳性穩定，發酵條件常規化，得到的殼聚糖內切酶純度較高，適用於製備相對分子質量分布較窄的高純度殼低聚糖產品。
文檔編號C12N9/24GK1724659SQ20051005007
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月14日 優先權日2005年6月14日
發明者鄭連英, 隋斯光 申請人:浙江大學