活化幹細胞的rna幹擾的製作方法

2023-06-20 08:50:31

活化幹細胞的rna幹擾的製作方法
【專利摘要】本發明涉及沉默PW1表達的幹擾RNA具體地在再生醫學的情形下用以體外或體內活化成體幹細胞的用途。
【專利說明】活化幹細胞的RNA幹擾

【技術領域】
[0001] 本發明涉及通過RNA幹擾選擇性降低（knockdown)PWl表達以體內和體外調控哺 乳動物幹細胞，所述調控特別適用於組織修復和再生醫學的情形。

【背景技術】
[0002] 幹細胞是由連續自我更新並且產生其所在位置的組織的分化子代的能力所定義。 幹細胞佔總細胞結構的小百分比。例如，在小腸中，在小於300個細胞的總的小囊群體中， 在小囊底部附近或許最多存在10個幹細胞。在骨骼肌中，衛星（幹）細胞構成所有細胞 核的約5%，但是在骨髓中，多潛能造血幹細胞稀有得多，其頻率為，在所有骨髓細胞中，在 10, 000個中或許有1個。在不同的假定器官特異性幹細胞的基因表達譜之間存在可觀的重 疊，這經常與自我更新、細胞存活和細胞粘附有關。將幹細胞常規地用於修復由損傷或疾病 損害的幾種易對這樣的方法做出響應的組織和器官已有三十多年，所述組織和器官最值得 注意地包括骨髓（Fernand等，1989)和皮膚（Green等，1989)。成體幹細胞對於組織內穩 態和創傷修復是重要的，並且存在於保持增殖和再生潛能的具體的小生態環境中，並因此 用作旨在體內提高再生潛能的小分子或生物治療劑的有前途的目標。
[0003] 本發明人先前已經在針對早期肌肉乾細胞的假定調節子的篩選中分離了PW1。他 們發現PWl是在早期胚胎形成期間表達，並且在所有早期譜系中都會強烈地表達，在後來 的胎兒發育期間衰退，並且限於成體的肌肉乾細胞。此外，用PWl進行的研究闡明了成體骨 骼肌中駐留幹細胞的新型群體。PWl報告小鼠的產生已經允許容易地追蹤內源PWl表達，導 致觀察到在所有成體幹細胞中都表達PWl。


【發明內容】

[0004] 本發明提供沉默PW1/PEG3的用於體內或體外活化成體幹細胞的幹擾 RNA(interferentRNA)〇
[0005] 具體地，幹擾RNA可以選自siRNA、shRNA、反義RNA和miRNA。
[0006] 在【具體實施方式】中，幹擾RNA是siRNA，其包含一起形成RNA雙鏈體的有義RNA鏈 和互補性反義RNA鏈，其中所述有義RNA鏈包含序列SEQIDNO: 3或由序列SEQIDNO: 3 組成。
[0007] 在另一【具體實施方式】中，幹擾RNA是優選地由慢病毒載體攜帶的shRNA，所述 shRNA包含SEQIDNO: 14 或由SEQIDNO: 14 組成。
[0008] 本發明提供沉默PW1/PEG3的幹擾RNA，其用於治療罹患可由再生醫學治療的疾病 的患者，所述疾病包括心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷、退行性疾病如糖尿病、阿茲海默 氏病、帕金森氏病，以及癌症。
[0009] 本發明進一步提供一種在對象中對抗皮膚衰老的方法，所述方法包括向對象施用 如本文定義的沉默PW1/PEG3的幹擾RNA。
[0010] 本發明的另一主題是一種在對象中預防脫髮或促進毛髮生長的方法，所述方法包 括向對象施用如本文定義的沉默PW1/PEG3的幹擾RNA。 toon] 本發明進一步提供一種活化成體幹細胞的體外方法，所述方法包括使成體幹細胞 或包含成體幹細胞的組織與如本文定義的沉默PW1/PEG3的幹擾RNA接觸。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1示出了在沉默PWl的、Hl的人啟動子的控制下表達shRNA(SEQIDN0:12,對 應於以下來自Sigma的參考：TRCN0000075397NM_008817. 2-4305slcl，圖中名為shPWl)的 慢病毒載體（名為PwlshRNA)的圖譜。
[0013] 圖2示出了感染PWlshRNA(下圖）或感染GFP對照慢病毒（上圖）的表皮幹細胞的 免疫螢光。BF:明視場，用DAPI(藍色）對細胞核進行復染色，抗PWl抗體（Relaix等，1998) 免疫染色的細胞呈紅色，GFP發出綠色。
[0014] 圖 3 是示出用 20nM或 50nM雜亂siRNA(Ambion)或用PWlsiRNA(Ambion，siRNAID 號S71469)轉染的神經幹細胞上的免疫螢光結果的圖。使用Relaix等，1998中所述的抗 PWl抗體並且用DAPI對細胞核進行復染色。
[0015] 圖4示出了通過特異性靶向幹細胞來激活毛髮生長周期。在對照shRNA或 PwlshRNA注射後4周獲取皮膚的組織切片。
[0016] 圖5示出了使用PwlshRNA、通過使用對照慢病毒或PwlshRNA對皮膚切片進行免疫 螢光染色以激活細胞周期。使用K15標記（紅色）對幹細胞免疫染色，使用Ki67 (綠色） 揭露增殖。用DAPI(藍色）對細胞核復染色。
[0017] 圖6示出了？118丨1?隱(41111^〇11，8丨1?隱10號871469)誘導肌肉乾細胞增殖的增加。 以相同的原始密度塗鋪細胞並且如通過DAPI染色（細胞核）示出。

【具體實施方式】
[0018] 本發明人現已示出幹擾PWl功能會引起幹細胞增殖。
[0019] 本發明因此提供沉默PWl的用於活化幹細胞的幹擾RNA。
[0020] Pwl/Peg3
[0021]Pwl/Peg3( "父本表達的基因3"）在本文中指定為"Pwl"，是母本印記基因，其主 要在胚胎形成期間並且在小鼠的成體卵巢、睪丸、肌肉和腦部表達。在本發明中，術語"Pwl" 或"Peg3"是指小鼠Pwl基因或在任何其它動物物種、具體地在人中的直系同源基因。
[0022] 哺乳動物印記調節生長和親本培育行為的建立，但是其出現的詳細分子機制還不 完全知道。Pwl會介導體外細胞應激和促存活（pro-survival)路徑，以及體內肌肉萎縮和 幹細胞數目。Kim等，（2000)將小鼠Pwl/Peg3基因繪圖到近端染色體7,並且確定所述基因 含有13個外顯子，其中最後4個來源於祖先的ZM2基因（Kim等，2000)。起始密碼子位於 外顯子3中。因為在哺乳動物中印記通常是保守的，並且印記域通常涵蓋幾個鄰接基因，所 以Peg3的人對應物的表達模式和染色體環境受到關注。Kim等，（1997)將人PW1/PEG3基 因定位在19q的端粒近端的約2Mb處，在已知攜帶大量串聯集簇的含Kruppel型鋅指（ZNF) 的基因的區域內（Kim等，1997)。
[0023] 將由Pwl基因編碼的蛋白質命名為"PW1蛋白"。這種蛋白質在進化期間一直是保 守的。估計在人和小鼠之間，PWl蛋白的序列同一性為63. 9%。在本發明中，術語"PW1"是 指小鼠Pwl蛋白或在任何其它動物物種、具體地在人中的直系同源基因。
[0024] 將小鼠PWl蛋白序列示為SEQIDNO: 1 (也可作為NP_032843. 2得到），並且 將人PWl蛋白序列示為SEQIDN0:2(也可作為NP_001139656. 1、NP_001139658. 1、 ΝΡ_001139659· 1、ΝΡ_006201· 1 得到）。
[0025]RNA幹擾：
[0026] 可以使用各種RNA幹擾手段。在本發明的上下文中，RNA幹擾（RNAi)包括小核酸 分子，如微RNA(miRNA)、短髮夾RNA(shRNA)和/或短或小的幹擾性RNA(siRNA)。進一步涵 蓋反義RNA。
[0027] 能夠介導RNA幹擾的優選分子將目標蛋白質表達有利地下調至少60%、優選地至 少70%、優選地至少80%、甚至更優選至少90%。
[0028] 優選地，以合成RNA雙鏈體（ds-siRNA)的形式使用siRNA，即siRNA是包含與目標 同源的有義鏈以及結合於目標mRN的反義鏈的siRNA雙鏈體。然而，單鏈siRNA(ss-siRNA) 也有用。
[0029] 根據本發明的siRNA是具有通過沃森-克裡克鍵成對的有義和反義鏈的小的雙鏈 RNA，並且其中有義鏈的序列是由PW1/PEG3的核苷酸序列的14至30個、有利地15至29個、 16至28個、17至27個、18至25個、18至23個、或18至21個鄰接核苷酸的片段組成，或 包含所述片段。
[0030] 已知具有由30 %至50%鳥嘌呤和胞嘧啶組成的序列的SiRNA比具有較高比例的 鳥嘌呤和胞嘧啶的序列更有效。因此，根據本發明的siRNA有利地具有由30%至50%鳥嘌 呤和胞嘧啶組成的序列。
[0031] 應了解，根據本發明的siRNA可同等地包含兩個互補性單鏈RNA分子，或其中兩個 互補性部分通過沃森-克裡克鍵而成對並且在一側通過髮夾型結構共價連接的單鏈RNA分 子（其是更具體地稱為"短髮夾RNA"的shRNA)，可將其視為siRNA的子類。在整個說明書 中，除非另有規定，否則術語siRNA應以廣義理解，包括shRNA。在一個有利的實施方式中， 根據本發明的siRNA包含兩個互補性單鏈RNA分子。在另一有利的實施方式中，根據本發明 的siRNA包含以下或由以下組成：單鏈RNA的單個分子，其中兩個互補性部分通過沃森-克 裡克鍵成對並且在一側通過髮夾型結構共價連接，也就是說，其為shRNA。
[0032]siRNA中所含的目標核苷酸序列和與其互補的序列優選地彼此完全互補。然而， 在除siRNA中央以外的位置存在鹼基突變下，RNA幹擾的裂解活性不會完全損失，而可保持 部分活性。另一方面，在siRNA中心的鹼基突變具有重要影響，其重要程度為可極端地降低 RNA幹擾的mRNA裂解活性。
[0033] 此外，具體地當根據本發明的siRNA包含兩個互補性單鏈RNA分子時，有義和/或 反義RNA鏈可進一步包含2至4個核苷酸的3'懸垂片段。將本文所用的表述"2至4個核 苷酸的3'懸垂片段"理解為意指在RNA雙鏈體的至少一鏈中存在不與在所述鏈的3'遠端 的互補鏈成對的2至4個核苷酸。3'懸垂片段中使用的核苷酸可為天然核苷酸（核糖核苷 酸或脫氧核糖核苷酸），或修飾的核苷酸如LNA(鎖核酸），其在核糖的2'和4'位置之間包 含亞甲基橋（Soutschek等，2004)。3'懸垂片段還可經歷以下段落中所述的、用於根據本 發明的siRNA的有義RNA鏈和/或反義RNA鏈的所有類型的化學修飾。有利地，3'懸垂片 段是由2個核苷酸組成。在這種情況下，3'懸垂片段的優選序列是"TT(其中T表示脫氧胸 苷）"或"UU(其中U表示尿嘧啶）"。同樣有利地，根據本發明的SiRNA的兩個互補鏈都包 含3'懸垂片段。在這種情況下，兩個3'懸垂片段的長度和序列可相同或不同。有利地，根 據本發明的siRNA的兩個互補鏈各自都包含相同的具有序列"TT"的、2個核苷酸的3'懸垂 片段。
[0034] 能夠特異性抑制PWl表達的反義核酸的實例包括:A)核酸，其包含：與編碼PWl的 mRNA(成熟mRNA或初始轉錄產物）的核苷酸序列互補的核苷酸序列或其具有12個鹼基以 上長度的部分序列；(B)包含滿足以下各項的核苷酸序列的核酸：具有12個鹼基以上的長 度、可與作為治療對象的動物（優選為人）的細胞中編碼PWl的mRNA(成熟mRNA或初始轉 錄產物）特異性雜交，並且在雜交狀態下能夠抑制向PWl多肽的轉譯；等。
[0035] 與反義核酸中的目標mRNA雜交的部分的長度不受特別限制，只要可特異性抑制 PWl表達即可；長度通常是約12個鹼基以上，並且最多與mRNA(成熟mRNA或初始轉錄產物） 的全長序列具有相同長度。考慮到雜交特異性，長度優選是約15個鹼基以上、更優選地18 個鹼基以上。考慮到合成容易性、抗原性問題等，與目標mRNA雜交的部分的長度通常是約 200個鹼基以下、優選地約50個鹼基以下、更優選地約30個鹼基以下。因此，與目標mRNA 雜交的部分的長度是例如約12至約200個鹼基、優選地約15至約50個鹼基、更優選地約 18至約30個鹼基。
[0036] 反義核酸的目標核苷酸序列不受特別限制，只要可特異性阻遏或抑制PWl表達即 可；序列可為PWl的mRNA(成熟mRNA或初始轉錄產物）的全長序列或其部分序列（例如約 12個鹼基以上、優選地約15個鹼基以上、更優選地約18個鹼基以上），或初始轉錄產物的 內含子部分。
[0037] 與反義核酸中的目標mRNA雜交的部分的核苷酸序列根據目標序列的鹼基組成而 變化，並且對目標序列的互補序列具有通常為約90%以上（優選地95%以上、最優選地 100% )的同一性，以便能夠在生理條件下與PWl的mRNA雜交。
[0038] 此外，反義核酸可以不僅能夠與PWl的mRNA或初始轉錄產物雜化以抑制轉譯，而 且能夠結合於作為雙鏈DNA的PWl基因以形成三鏈體並且抑制向mRNA的轉錄。
[0039] 此外，根據本發明的幹擾RNA如siRNA或反義RNA，有義RNA鏈和/或反義RNA鏈 還可在其糖部分、其核鹼基部分或其核苷酸間骨架中包含至少一種化學修飾。這些修飾可 值得注意地使得能夠抑制體內核酸酶對siRNA的分解。將可提高根據本發明的siRNA的穩 定性和體內生物利用率的所有化學修飾都因此包括在本發明的範圍中。在對糖部分的有利 修飾中，尤其可提及在以下位置進行的修飾：核糖的2'位置，如2' -脫氧、2' -氟代、2' -氨 基、2' -硫基或2' -0-烷基，以及特別地2' -0-甲基，置換核糖核苷酸上的正常2' -OH基團， 或在核糖的2'和4'位置之間存在亞甲基橋（LNA)。對於核鹼基，可能使用修飾鹼基，尤 其如5-溴代-尿苷、5-碘代-尿苷、N.sup. 3-甲基-尿苷、2, 6-二氨基嘌呤（DAP)、5-甲 基_2' -脫氧胞苷、5_(1_丙塊基）-2' -脫氧-尿苷（pdU)、5-(1-丙塊基）-2' -脫氧胞苷 (PdC)或與膽固醇連接的鹼基。最後，核苷酸間骨架的有利修飾包括由硫代磷酸酯、甲基膦 酸酯、磷二醯胺（phosphorodiamidate)基置換骨架中的磷酸二酯基，或使用由用肽鍵連接 的N-(2-氨基乙基）-甘氨酸單元組成的骨架（PNA，肽核酸）。明顯可將各種修飾（鹼基、 糖、骨架）組合得到修飾的嗎啉代型核酸（鹼基固定於嗎啉環並且通過磷二醯胺基連接） 或修飾的PNA(鹼基固定於用肽鍵連接的N-(2-氨基乙基）-甘氨酸單元）。
[0040] 幹擾RNA如siRNA根據本發明是"分離的"，這是指其不處於天然狀態，而是已經 通過涉及人幹預的任何手段而獲得。值得注意地，可能已經通過純化已經存在的SiRNA、通 過化學合成、通過聚合酶鏈反應（PCR)擴增期望的核苷酸序列，或通過重組合成獲得了根 據本發明的siRNA。許多公司也提供定製的siRNA合成，值得注意的公司如Eurogentec、 Ambion、Dharmacon或Qiagen0
[0041] 可通過以下步驟製備能夠特異性抑制PWl表達的siRNA和反義核酸：根據PWl的 mRNA序列或染色體DNA序列確定目標序列，並且使用可商購獲得的自動化DNA/RNA合成儀 (AppliedBiosystems、Beckman等）合成與其與互補的核苷酸序列。可通過以下步驟製備 siRNA:使用自動化DNA/RNA合成儀分別合成有義鏈和反義鏈，並且在適當的退火緩衝液中 在約90°C至約95°C下使所述鏈變性約1分鐘，並然後在約30°C至70°C下進行退火約1至 約8小時。可通過以下步驟製備更長的雙鏈聚核苷酸：以彼此重疊的方式合成互補性寡核 苷酸鏈、將所述鏈退火，並然後用連接酶進行連接。可例如從Ambion商購獲得設計成沉默 PWl基因的siRNA寡核苷酸。
[0042] 在一個優選實施方式中，本發明利用了示出選自SEQIDNO:3至SEQIDNO:8的 核苷酸序列的優選地呈雙鏈體形式的siRNA。
[0043] 可通過DICER將相應的shRNA裂解以合成或製造siRNA分子。可從包含相應核酸 序列的載體製造這些shRNA。
[0044] 本領域任何技術人員可容易地設計沉默PWl的其它siRNA序列。
[0045] 下文示出感興趣的siRNA的實例：
[0046] siRNA 有義反義 Ambion, siRNA ID兮s71469 5' GAG UCG CAG UCA 5'AAU CGA UUG ACU AUC GAU Utt 31 (SEQ丨D GCG ACU Cag 3' (SEQ ID NO:3) NO:4) 、 Amblon, siRNAID'4s714685'CCA UGG UAG AGO CAA 5'UGA GUU GCC UCU ACC CUC Att 3* (SEQ ID NO: 5) AUG Gat 3' (SEQ ID NO: 6) AmMon5 siRNA ID 9 s71467 5'GAC CAG CUG UAU UCC 5' UUA CGG AAU ACA GUA Att 3'(SEQ ID NO: 7) GCU GGU Ctt 3* (SEQ ID NO: 8)
[0047] 下文示出感興趣的shRNA的實例：
[0048] SIGMA
[0049]shRNA3'utr
[0050]TRCN0000075393 CCGGCCTCTTAGATAGTCCTGTGAACTCGAGTTCACAGGACTATC
[0051]TAAGAGGTTTTTG(SEQIDNO:9)
[0052]TRCN0000075395 CCGGCCCTAATGACAAGCTGAAATTCTCGAGAATTTCAGCTTGTC
[0053]ATTAGGGTTTTTG(SEQIDNO:10)
[0054]TRCN0000075396 CCGGGCCGAGTCATACCAGAATGTTCTCGAGAACATTCTGGTATG
[0055] ACTCGGCTTTTTG(SEQ ID NO:11)
[0056]TRCN0000075397 CCGGCCACTGTACGAATGCAAAGATCTCGAGATCTTTGCATTCG
[0057]TACAGTGGTTTTTG(SEQIDNO:12)
[0058]TRCN0000075394CCGGCCTCCATTTATATCCCAGATACTCGAGTATCTGGGATATAA
[0059]ATGGAGGTTTTTG(SEQIDNO:13)
[0060]序列CTGTACGAATGCAAAGAT(SEQIDN0:14)是SEQIDN0:12 內對PWl具有特異性 的部分。
[0061]載體：
[0062] 在優選實施方式中，由表達載體攜帶幹擾RNA。在表達載體中，上述siRNA或反義 核酸或編碼其的核酸（優選為DNA)已經被可操作連接到能夠在哺乳動物（優選為人）的 細胞中顯示啟動子活性的啟動子。
[0063]可使用能夠在作為施用對象的哺乳動物的細胞中起作用的任何啟動子。適用的 啟動子包括poiI啟動子、ρο?π啟動子、poiin啟動子等。具體地，使用病毒啟動子如 SV40源性初始啟動子和巨細胞病毒LTR、哺乳動物結構蛋白基因啟動子如β-肌動蛋白基 因啟動子、RNA啟動子如tRNA啟動子等。更具體地，可以使用Hl的人啟動子，具體地用於 控制shRNA表達。
[0064] 當意圖表達siRNA時，優選將poiIII啟動子用作啟動子。poiIII啟動子的實例 包括U6啟動子、Hl啟動子、tRNA啟動子等。
[0065] 已知至少三種體內產生RNAi介導性基因沉默的方法，並且其可用於本發明的情 形中（Dykxhoorn等，2003中有回顧）：
[0066] 可從質粒或病毒載體使用以下各項以體內表達具有單一序列特異性的siRNA:
[0067]-表達單個的siRNA有義鏈和反義鏈的串聯聚合酶III啟動子，所述siRNA有義鏈 和反義鏈以反式結合；
[0068]-表達短髮夾RNA(shRNA)的單個聚合酶III啟動子；
[0069] -表達由DICER處理而得到成熟miRNA的不完全雙鏈體髮夾RNA(前miRNA)的單 個聚合酶II啟動子。
[0070] 表達載體優選含有轉錄終止信號，即終止子區域，位於上述聚核苷酸或其編碼核 酸的下遊。此外，可進一步包括用於選擇轉化細胞的選擇標記基因（例如賦予對藥物如四 環素、氨苄西林和卡那黴素的抗性的基因、補償營養缺陷型突變的基因，等）。雖然對適用於 本發明的表達載體的選擇沒有限制，但是適用於向哺乳動物如人施用的載體包括病毒載體 如逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關病毒。腺病毒特別地具有如基因轉移效率極高並且 可轉移到非分裂細胞的優勢。因為將轉基因整合到宿主染色體中是極罕見的，所以基因表 達然而是暫時的並且通常僅持續約4周。
[0071] 考慮到治療效果的持久性，使用腺相關病毒也是優選的，所述腺相關病毒提供相 對高的基因轉移效率，其也可轉移到非分裂細胞，並且其可通過反向末端重複序列（ITR) 整合到染色體中。
[0072] 在優選實施方式中，幹擾RNA優選是由在包裝細胞系中產生慢病毒轉導顆粒的慢 病毒載體攜帶的shRNA。
[0073] 活化幹細胞
[0074] 本發明的幹擾RNA適用於活化成體幹細胞，即引發或增強其增殖。
[0075] 在本發明的上下文中，術語"成體幹細胞"包括誘導型多能幹細胞，其以人工方式 來源於非多能細胞，典型地成體體細胞。
[0076] 細胞可以屬於任何組織，包括血液、骨髓、造血系統、皮膚、毛囊、肌肉、神經系統、 心臟、腸、胸腺、胰腺、睪丸、眼睛、腎、肝、肺、脾、舌、骨、牙髓、乳房、卵巢、子宮和胎盤。
[0077] 可以體外或體內使用本發明的幹擾RNA。
[0078] 在一個實施方式中，可以體外使用所述RNA以繁殖幹細胞用於再生療法。幹細胞 可以體外擴增並然後直接施用於患者。
[0079] 在另一實施方式中，可以將幹擾RNA施用於患者以體內繁殖幹細胞。
[0080] 在組織修複方面，本發明的幹擾RNA受到關注，其可適合用於治療神經退化性疾 病，包括中風和阿茲海默氏病，用於脊髓損傷以及心血管疾病，具體地心肌梗塞。再生醫學 的另一領域是皮膚修復，具體地燒傷或遺傳性疾病的皮膚修復。其可能特別地用於預防衰 老或減緩細胞衰老，特別是皮膚衰老。本發明的幹擾RNA還可能適用於促進毛髮生長。
[0081] 患者或對象可為任何人或非人動物、優選地哺乳動物，包括哨齒動物、綿羊、山羊、 牛、馬、狗、貓、靈長類動物。
[0082] 藥物組合物或美容組合物：
[0083] 本發明進一步涉及用作藥物或化妝品的根據本發明的幹擾RNA。
[0084] 本發明的另一目的是包含至少一種根據本發明的幹擾RNA以及可接受的載體的 組合物。將本文所用的術語"可接受的載體"理解為指本領域技術人員已知的在美容術領 域或藥理學上可接受的載體。
[0085] 涵蓋任何常規的施用途徑，包括經口、經肺、腹膜內（ip)、靜脈內（iv)、肌肉內 (im)、皮下（sc)、透皮、經口腔、經鼻、舌下、經眼、經直腸和經陰道。另外，可以設想向期 望成體幹細胞在那裡增殖的組織進行直接施用。通過本領域已知方法配製幹擾RNA。可 將用於經口、經直腸、胃腸外或局部應用的組合物製備成片劑、囊劑、顆粒、栓劑、植入物 (implantage)、無菌可注射水性或油性溶液、懸液或乳液、氣霧劑、油膏、乳膏或凝膠、緩釋 製劑或緩釋植入物（implantate)的形式。還可以通過可植入計量系統或通過輸注施用幹 擾RNA。
[0086] 在【具體實施方式】中，根據本發明的組合物意圖用於皮膚或毛髮的美容性處理和/ 或治療性治療，因此有利地進行局部施用。
[0087]可以將根據本發明的用於局部施用的組合物配製成慣用於局部施用的任何格林 製劑形式（galenicform)，如水溶液、白色或著色乳膏、軟膏劑、乳劑、洗劑、凝膠、油膏、精 華、糊劑、水包油或油包水乳液，或泡沫的形式。可能將其以氣霧劑形式施用於皮膚。其還 可能以粉狀或非粉狀的固體形式，例如以條狀物的形式存在。當意圖施用於毛髮或頭皮時， 組合物可以呈例如洗髮精、洗劑、凝膠或泡沫的形式。
[0088] 對本領域技術人員顯而易見的是，提供治療效果的任何施用劑量或頻率都適用 於本發明。例如，治療有效量可為體外約IOnM至IOOnM以及體內約0. 01μg/g組織至約 25μg/g組織。
[0089]另外，可採用標準的藥物方法以控制作用持續時間。其為本領域所熟知並且包括 控制釋放製劑並且可包括適當的大分子，例如聚合物、聚酯、聚胺基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、 乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白。
[0090] 藥物組合物可以進一步含有用於核酸轉移以促進核酸轉移到細胞中的試劑。
[0091] 適用的核酸轉移試劑包括陽離子脂質如Lipofectin、Lipofectamine、 LipofectamineRNAiMAX、Invivofectamine、DOGS(Transfectam)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、聚凝胺和聚（乙烯亞胺）（PEI)。當將逆轉錄病毒用作表達載體時，可將重 組人纖維連接蛋白（retronectin)、纖連蛋白、聚凝胺等用作轉移試劑。
[0092] 使用電穿孔、壓力、機械按摩等，物理技術也可增加特定組織位點處的RNA攝取。 RNA的末端修飾可提升其對血清和組織中核酸外切酶降解的抗性。此外，用合適的配體修 飾可實現靶向遞送。除傳統的陽離子脂質體和陽離子聚合物系統以外，已經為RNA開發出 幾種類型的用於藥物遞送的載體。還與RNA遞送用載體組合使用超聲波和微泡或脂質體氣 泡。具有獨特特性的新型材料如碳納米管、金納米粒子和金納米棒已經引起關注以作為RNA 的創新性載體。關於最新的回顧，參見Higuchi等，2010。
[0093] 根據本發明的組合物可進一步包含任何種類的本領域技術人員已知的媒介物，從 而使得可能改善根據本發明的幹擾RNA的遞送和生物利用率。
[0094] 可與幹擾RNA-起使用的具體媒介物尤其包含能夠穿過細胞膜的脂質體和肽（稱 為CPP，即"細胞滲透性肽")。將本文所用的表述CPP理解成指能夠內在化並然後到達活細 胞的細胞質和/或核區室的肽。這些CPP的實例包括肽Penetratine、Transportan、Tat、 MAP和SynBl。其它載體可以用聚合納米粒子或微粒、脂質體和膠束的形式使用（Allen 等，2004;Farokhzad等，2009)。
[0095] 在【具體實施方式】中，將RNA配製於納米粒子中。一般地說，基於納米粒子的遞送系 統是將siRNA壓縮到質量為大約100, 000, 000道爾頓的最優尺寸範圍為數百納米的粒子中 的遞送試劑。主要的包裝策略在於利用siRNA骨架的陰離子電荷作為與遞送試劑的靜電相 互作用的支架。在體外細胞處理或體內全身性施用之前，將可有利地與膽固醇組合的陽離 子脂質、陽離子聚合物和陽離子肽用於接合帶負電的磷酸二酯骨架並且將大量的RNA分子 組織成納米顆粒結構（Whitehead等，2009。也參見例如W02010/080724 ;US2006/0240554 和US2008/0020058)。
[0096] 除形成幹擾RNA納米粒子需要的陽離子模體以外，將附加模體應用於遞送試劑。 可使多種脂質、細胞靶向配體、抗體和細胞穿透肽等共價連接於陽離子包裝模體，因此所形 成的所得納米粒子將具有細胞遞送性質（Whitehead等，2009)。
[0097] 也可將天然微粒如病原體（細菌、病毒載體系統）和人細胞用於遞送核酸片段 (關於回顧，參見Yoo等，2011)。
[0098] 其它團隊已經開發出適用的聚合物藥物偶聯物，其允許特異性細胞靶向並且提 供劑量控制、高的釋放效率和低的毒性，如基於透明質酸（HA)的可注射水凝膠（Oommen等，2009)。
[0099] 本發明還涉及根據本發明的至少一種幹擾RNA或組合物作為活化成體幹細胞的 美容試劑或藥物試劑的用途。
[0100] 可使用幹擾RNA以體內或體外成體活化幹細胞。
[0101] 當治療具體疾病時，當期望幹細胞活化或擴增時，幹擾RNA可能適用。這些疾病可 以含可由再生療法治療的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷、退行性疾病如糖尿 病、阿茲海默氏病、帕金森氏病等以及癌症。
[0102] 因此描述了一種通過施用至少一種本文所述的幹擾RNA以活化成體幹細胞來治 療這些疾病的方法。
[0103] 本發明還涉及一種用於對抗皮膚衰老或脫髮的美容處理方法，其包括優選地局部 施用根據本發明的組合物。
[0104] 實施例和圖說明本發明，而不限制其範圍。
[0105]實施例
[0106] 實施例1 :使用幹擾RNA減少PWl蛋白
[0107]I. 1.使用表達shRNA的慢病毒減少PWl蛋白
[0108] 本發明人已經使用由Vectalys提供，並且表達shRNA(SEQIDNO: 12,對應於以下 來自Sigma的參考：TRCN0000075397NM_008817. 2-4305slcl)的慢病毒顆粒，所述shRNA有 效沉默PWl蛋白表達。圖1中示出慢病毒顆粒的圖譜。
[0109] 已經用成體突起源性皮膚幹細胞獲得結果。對感染這種PwlshRNA慢病毒或GFP 對照慢病毒的這些表皮幹細胞進行免疫螢光實驗（圖2)。在37°C下在50μ1去除血清的 生長培養基中，用PwlshRNA(Μ0Ι200)感染20, 000個新鮮分離的來源於成體突起的皮膚幹 細胞，持續30分鐘。將細胞塗鋪在含有血清的生長培養基中並且進行免疫螢光實驗。
[0110] 新鮮收集的皮膚幹細胞的PwlshRNA慢病毒感染實現了較高頻率的無性系群落形 成並且所得的群落較大。當直接分析群落時，觀察到PWl的表達水平降低。
[0111] 這些結果證明幹擾RNA造成的PWl表達減小會通過刺激細胞增殖'動員'幹細胞。
[0112] 1. 2.使用siRNA以減少PWl蛋白
[0113] 圖3示出了用顯示SEQIDNO: 3作為有義序列的siRNAs71469 (Ambion)轉染的 神經幹細胞中PWl蛋白的減少。
[0114] 在第0天以20000個細胞/500μ1的密度，在由invitrogen提供的沒有抗生 素的0Ρ--ΜΕΜ1培養基中塗鋪細胞。在第1天，使用正向轉染：LipofectamineRNAiMX invitrogen,按照製造商說明書轉染細胞。使用20nM或50nMsiRNA。50nM允許在轉染3 天之後下調60 。
[0115] 實施例2 :激活毛髮生長周期
[0116] 通過在真皮和表皮之間局部注射PwlshRNA(100μ1含病毒400M0I的PBS)，在出生 後（Ρ21)的野生型小鼠的背部下調PW1。在感染之後7天，收集在注射點周圍的2cm2並且 通過組織學進行分析。用慢病毒對照物（雜亂）進行相同的實驗。注射PWlshRNA使得毛 囊幹細胞得到明顯的活化（參見圖4)。效果具有高度特異性，以使構成組織的大部分的非 幹細胞不受影響。
[0117] 實施例3 :活化皮膚幹細胞
[0118] 本發明人然後體內試驗了PwlshRNA慢病毒直接對小鼠皮膚的影響。在21天齡野 生型小鼠的背部進行PWlshRNA(在PBS中M0I300)的皮內感染。在4周之後，觀察到小囊 的明顯活化，其對應於如通過使分裂中細胞變亮的ki67檢測的細胞周期的特異性激活（圖 5)。效果具有高度特異性並且僅幹細胞（表達PW1)和其直接的子代得到動員。
[0119] 實施例4 :肌肉乾細胞增的增殖
[0120] 本發明人已經進一步示出了針對PWl的siRNA使得用PWlsiRNA轉染的小鼠肌肉 幹細胞中的PWl明顯下調，如在圖6中通過使用免疫螢光（PW1抗體）檢測不到的信號所證 明。用PWlsiRNA轉染導致增殖水平提高，從而引起細胞密度增大。
[0121] 參考文獻
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【權利要求】
1. 一種沉默PW1/PEG3的用於體內活化成體幹細胞的幹擾RNA。
2. 根據權利要求1所述的沉默PW1/PEG3的用於活化成體幹細胞的幹擾RNA，其中所述 幹擾 RNA 選自 siRNA、shRNA、反義 RNA 和 miRNA。
3. 根據權利要求1或2所述的用於活化成體幹細胞的幹擾RNA，其為siRNA，所述siRNA 包含一起形成RNA雙鏈體的有義RNA鏈和互補性反義RNA鏈，其中所述有義RNA鏈包含序 列SEQ ID NO:3或由序列SEQ ID NO:3組成。
4. 根據權利要求1或2所述的用於活化成體幹細胞的幹擾RNA，其為shRNA。
5. 根據權利要求4所述的用於活化成體幹細胞的幹擾RNA，其為包含序列SEQ ID NO: 14或由序列SEQ ID NO: 14組成的shRNA。
6. 根據權利要求1至5中任一項所述的用於活化成體幹細胞的幹擾RNA，其用於治療 罹患心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷、退行性疾病如糖尿病、阿茲海默氏病、帕金森氏病 以及癌症的患者。
7. -種在對象中對抗皮膚衰老的方法，所述方法包括向所述對象施用如權利要求1至 5中任一項所述的沉默PW1/PEG3的幹擾RNA。
8. -種在對象中預防脫髮或促進毛髮生長的方法，所述方法包括向所述對象施用如權 利要求1至5中任一項所述的沉默PW1/PEG3的幹擾RNA。
9. 一種活化成體幹細胞的體外方法，所述方法包括使成體幹細胞或包含成體幹細胞的 組織與如權利要求1至5中任一項所述的沉默PW1/PEG3的幹擾RNA接觸。
【文檔編號】A61K31/713GK104302299SQ201280065442
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2011年12月28日
【發明者】大衛·沙遜, 焦萬納·馬拉齊, 瓦納薩·貝松 申請人:巴黎第六大學