Tsa305基因的製作方法

2023-06-20 20:56:11

專利名稱：Tsa305基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及命名為TSA305的基因，該基因編碼特異性地在胰腺中表達的蛋白質；更具體地說，涉及與線蟲sel-1基因具高水平同源性並且預計具有抗癌活性的上述胰腺特異性基因。本發明還涉及由這樣的基因編碼的新蛋白質和該蛋白質的特異性抗體。
同時，已有人報導說線蟲sel-1基因對Notch／lin-12具有抑制作用，該Notch／lin-12在線蟲神經發育過程中抑制了外胚層分化為成神經細胞(遺傳學，143(1)，237-247(1996)；發育，124(3)，637-644(1997))。當所述的Notch／lin-12被強制表達時，它引起乳腺癌或白血病並且因此被認為是癌症相關的基因。因此認為上述對所述的該癌症相關基因具有抑制作用的sel-1基因對癌症也具有抑制作用。但是目前，這些基因的作用還沒有被完全闡明。
對上述基因的生理學作用的闡明和由此獲得的信息對闡明疾病如惡性轉化和炎症的發病的機理具有重要的意義，不僅在基礎科學研究領域而且在藥物領域人們都在盼望著對上述基因生理學作用的闡明，以確定如癌症和炎症這樣的疾病的病因和研製出用於些疾病的治療方法。
基於上述目的，本發明人對來源於各種人組織的基因進行了努力的研究，結果，最近成功地分離出和鑑定了編碼特異性地在胰腺中表達的蛋白質的基因並且發現利用該基因可以實現上述目的。結果，現在完成了本發明。
因此，本發明提供了胰腺特異性基因TSA305，它包括編碼具有顯示於SEQ ID NO1的胺基酸序列的蛋白質的核苷酸序列，特別是TSA305是一個人基因。
本發明也提供了胰腺特異性蛋白質(TSA305蛋白質)，它包括顯示於SEQ ID NO1的胺基酸序列；本發明還提供了能與該蛋白質結合的抗體。
本發明進一步提供了胰腺特異性基因TSA305，它是下面的(a)或(b)中定義的多聚核苷酸，特別是作為人基因的TSA305(a)包括顯示於SEQ ID NO2的核苷酸序列的全部或一部分的多聚核苷酸；(b)在嚴謹條件下能夠與具有顯示於SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA雜交的多聚核苷酸。
另外，本發明提供了DNA片段形式的上述基因，它可用作為用於基因檢測的特異性探針或特異性引物。
在用下面的縮寫或標記表述胺基酸、肽、核苷酸、核酸等等時，其縮寫或標記使用或遵守了IUPAC-IUB(關於生物學命名的IUPAC-IUB通訊，歐洲生物化學雜誌，1389(1984))，「製作含有核苷酸序列或胺基酸序列的說明書的綱要」(由日本專利局編輯)和相關領域使用的常規標記。
作為本發明基因的具體例子，可以提到的是從命名為「TSA305」的PCR產物的DNA序列推導出的一個基因，它將在後面的實施例部分中被顯示。其核苷酸序列顯示於SEQ ID NO3。
所述的基因含有具有顯示於SEQ ID NO2的編碼區的人cDNA並且該cDNA編碼由顯示於SEQ ID NOl的794個胺基酸殘基組成的新的胰腺特異性蛋白質(下文稱之為TSA305蛋白質)，該基因全長由7885個核苷酸組成。
利用FASTA程序(Person，W．R．等人，美國科學院年報，85，2444-2448(1988))在GenBank／EMBL資料庫中檢索的結果，證實本發明的TSA305基因的表達產物，被命名為TSA305蛋白質，與線蟲sel-1基因(參見上文中記載的)具有非常高水平的同源性。根據該事實，認為本發明的基因如上文提到的sel-1基因一樣對Notch／lin-12應具有抑制作用，該Notch／lin-12被認為是參與胚胎形成的癌症相關基因。
本發明的基因座位是第14染色體的q24．3-q31．1，被認為第14號染色體上存在依賴於胰島素的糖尿病(IDDM)的致病基因。根據該事實，強烈地暗示本發明的基因與糖尿病有關。
進一步的研究表明本發明的基因的表達產物是含有纖維結合素Ⅱ型膠原結合域的蛋白質。這樣的膠原結合位點緊接N末端，這一點暗示該蛋白質參與纖維形成，並且基於這一點，強烈地暗示本發明的基因參與纖維變性。
另外，由於受測試的所有胰腺癌製劑均沒有顯示表達了本發明的基因並且該基因主要在正常胰腺中表達，這暗示本發明的基因可能對預測惡性轉化有極大的價值。
因此作為本發明提供TSA305基因和其表達產物的結果，本文亦給出了非常適用於闡明、了解、診斷、預防和治療各種疾病例如乳腺癌、白血病、纖維變性、糖尿病和胰腺癌症，特別是胰腺癌的信息和手段。本發明的基因亦可用於研製誘導本發明的基因表達的新的藥物，該藥物可用於治療上文提到的各種疾病。此外，據認為在單個動物或具體組織中，本發明基因的表達的檢測或所述基因表達產物的檢測或該基因突變(缺失或點突變)的檢測或其異常表達的檢測可適當地用於闡明或診斷上述疾病。
本發明的基因具體地用含有編碼顯示於SEQ ID NO1的胺基酸序列的蛋白質的核苷酸序列的基因或是作為含有顯示於SEQ ID NO2的核苷酸序列的多聚核苷酸的基因代表。但是，本發明的基因不特定地局限於此，例如可以是在上述特異性胺基酸序列導致某一修飾或具有與上述特異性核苷酸序列有一定水平的同源性的基因。
因此本發明的基因也包括含有編碼具有如下衍生的胺基酸序列的蛋白質的核苷酸序列的基因，所述衍生的胺基酸序列來源於通過將顯示於SEQ ID NO1的胺基酸序列缺失、取代或疊加一個或多個胺基酸殘基並且仍具有與TSA305同樣的活性。如果被修飾的蛋白質是具有與含有顯示於SEQ ID NO1的胺基酸序列的蛋白質的功能相同作用的產物，那麼對「缺失、取代或疊加一個胺基酸殘基或幾個胺基酸殘基」的程度和位點沒有特別的限制。上面使用的術語「多個」是指2或2個以上，通常是指幾個。
在上述胺基酸序列的修飾(突變)等等可天然發生的同時，例如通過突變或轉譯後的修飾，在天然衍生的基因(例如本發明基因的具體例子)的基礎上也可能進行人工修飾。本發明覆蓋了具有其它這樣的修飾或突變的具有上述特性的所有被修飾的基因，不管其原因和手段如何。
作為上述人工手段的例子，可以提及的有位點特異性誘變(酶學方法，154350，367-382(1987)；文獻同上，100468(1983)；核酸研究，129441(1984)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化學實驗，第二系列)1「Idensi Kenkyubo(基因研究方法)Ⅱ」，由日本生物化學協會編輯，第105頁(1986))和其它遺傳工程技術、化學合成手段例如磷酸三酯法或磷醯亞胺方法(美國化學協會雜誌894801(1967)文獻同上，913350(1969)；科學，150178(1968)；四面體通訊，221859(1981)；文獻同上，24245(1983))，和其結合。
對於本發明基因的體現方式，可以提到的基因包括含有顯示於SEQ ID NO3的全部或部分核苷酸序列的多聚核苷酸。該核苷酸序列所含的開放讀碼框(顯示於SEQ ID NO:2的核苷酸序列)也用作為在上述胺基酸序列(SEQ ID NO1)中限定各胺基酸殘基的密碼子集合體的實例。本發明的基因不限於這一實例，而可以具有其中選定密碼子的任意組合的核苷酸序列。可以以常規的方式進行密碼子的選擇，例如可以考慮在所使用的宿主中慣用的密碼子(核酸研究，943(1981))。
雖然本發明的基因是以單鏈DNA核苷酸表示的，例如如SEQ IDNO2所示，本發明也理所當然地包括具有與所述核苷酸序列互補的核苷酸序列的多聚核苷酸或含有它們兩者的成分。它不限於DNA例如cDNA。
此外，如上文提到的，本發明的基因不限於含有顯示於SEQ IDNO2的全部或部分核苷酸序列的多聚核苷酸，它還包括含有與所述的核苷酸具有一定水平的同源性的核苷酸序列的基因。對於這樣的基因，可以提到至少能夠與包括顯示於SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA在下文提到的嚴謹條件下雜交並且不能夠通過一定條件下的洗滌而從其釋放出來的那些。
因此，作為例子，可以提到的有，具有在下面雜交條件下與具有顯示於SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA雜交並且在下述洗滌條件下不從所述的DNA釋放的核苷酸序列的基因，雜交條件為在6×SSC中，65℃過夜，或在37℃在含有50％甲醯胺的4×SSC中過夜；洗滌條件為用2×SSC在65℃洗滌30分鐘。此處，「SSC」是指標準檸檬酸鹽水；1×SSC=0．15氯化鈉、0．015M檸檬酸鈉。
採用常規的遺傳工程技術，基於典型例子的序列的信息，可以很容易地生產和回收本發明的基因(參見，例如，分子克隆，第2版，冷泉港實驗室出版社(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化學實驗，第二系列)「Idensi Kenkyubo(基因研究方法)Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ」，由日本生物化學協會編輯)。
具體地講，通過以常規的方式，從表達本發明的基因的合適的來源構建cDNA文庫，利用合適的探針或與本發明基因特異性的抗體從所構建的cDNA文庫中選擇需要的克隆，可以進行上述的生產和／或回收(美國科學院年報，786613(1981)；科學，222778(1983))。
作為上面所述方法的cDNA的來源，可以提到的有表達本發明基因的各種細胞和組織，從其衍生的培養的細胞等等，特別是胰腺組織。其中從這些細胞或組織分離總的RNA，將mRNA分離和純化，以及cDNA的獲得和克隆等，都可以以常規方式進行。cDNA文庫也是可從商業途徑獲得的，這樣的cDNA文庫例如可從Clontech實驗室公司購買的各種cDNA文庫可用於實施本發明。
對用於篩選本發明基因的cDNA文庫的方法沒有特別的限制，它可以是常規的方法。作為具體的實例，可以提到的是包括通過利用對由cDNA產生的蛋白具特異性的抗體進行免疫學篩選來篩選相應cDNA克隆的方法，利用選擇性地與所需要的DNA序列結合的噬菌斑雜交或菌落雜交技術，和這些方法或技術的組合。
作為所使用的探針的例子，通常可以提到的是基於本發明基因的核苷酸信息而化學合成的DNA。當然，也可以成功地利用如此獲得的本發明的基因或其片段。
也可以利用TSA305蛋白質來替代上面的特異性抗體，通過蛋白質相互作用克隆步驟來進行本發明基因的篩選，並且也可以利用包括使用基於本發明基因的核苷酸序列的信息而設計的有義或反義引物作為篩選探針的篩選方法。
根據本發明，通過差異顯示技術可以直接比較和調查不同條件下或多個不同的細胞群的細胞中mRNA的表達水平(liand，P．，等人，科學，257967-971(1992))。
對於獲得本發明的基因，可以明智地利用採用PCR技術的DNA／RNA擴增(科學，2301350(1985))。特別是，當從文庫獲得全長cDNA是困難的時候，例如可以明智地使用RACE技術(cDNA末端的快速擴增；Jikken Igaku(實驗醫學)，12(6)35(1994))，特別是5』-RACE技術(美國科學院年報858998(1988))。當使用這樣的PCR技術時，可以基於由本發明提供的本發明基因的序列的信息適當地設計所使用的引物並且可以以常規方式合成這些引物。
可以以常規方式，如上文提到的，例如以凝膠電泳來分離和純化擴增出的DNA／RNA片段。
可以以常規的方式，例如以二脫氧方法(美國科學院年報745463(1977))或以Maxam-Gilbert方法(酶學方法，65499(1980))或以簡單和容易的方式利用商品測序試劑盒等等對以上述方式獲得的本發明的基因或各種DNA片段進行測序。
通過利用本發明的基因，採用一般的遺傳工程技術可以穩定地大量地生產相應的基因產物。因此，本發明也提供了含有本發明TSA305基因的載體(表達載體)，用所述載體轉化的宿主細胞和產生TSA305蛋白質的方法，該方法包括培養所述的宿主細胞。
根據一般的重組DNA技術可以實施上述生產方法(參見，例如，科學，2241431(1984)；生物化學和生物物理研究通訊，130692(1985)；美國科學院年報，805990(1983)，以及上面記載的文獻)。
原核生物和真核生物都可用作為上面提到宿主細胞。作為原核宿主細胞，可以提到的是常規使用的各種各樣的宿主例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等等，優選的實例包括大腸桿菌菌株，特別是大腸桿菌K12菌株。真核宿主細胞包括脊椎動物細胞和酵母細胞。關於前者，可以明智地使用例如COS細胞(它們是猴細胞)(細胞，23175(1981))、中國倉鼠卵細胞和其二氫葉酸還原酶-缺失的株系(美國科學院年報，774216(1980))；作為後者，可以明智地使用屬於酵母屬的酵母細胞等。當然，宿主細胞不限於這些。
當原核細胞用作為宿主時，可以明智地使用一表達質粒，該質粒是利用能夠在所述宿主細胞中複製的載體構建的，並且所述載體能夠在本發明的基因的上遊提供啟動子和SD序列(Shine和Dalgarno)並且進一步提供起始蛋白質合成所必須的起始密碼子(例如ATG)，以便可以表達本發明的基因。通常用作為上面所述載體的是大腸桿菌衍生的質粒，例如pBR322、pBR325、pUCl2和pUC13。但是載體不限於這些，可以使用各種已知的載體。作為可在使用大腸桿菌的表達系統中使用的如上述種類的商品載體，可以提到的是例如pGEX-4T(Amersham藥物生物技術)、pMAL-C2、pMAL-P2(新英國生物實驗室)、pET21、pET21／lacq(Invitrogen)和pBAD／His(Invitrogen)。
對於將脊椎動物細胞用作為宿主的情況下使用的表達載體，可以提到的是通常具有位於待表達的本發明基因上遊的啟動子、RNA拼接位點、多聚腺苷酸化位點和轉錄終止序列的載體。如果有必要，它可以進一步含有複製原點。作為所述表達載體的具體例子，可以提到的是具有SV40早期啟動子的pSV2dhfr(細胞分子生物學，1854(1981))等等。除了上面所述，也可以使用各種已知的商品載體。對於可在使用動物細胞的表達系統中使用的所述種類的商品載體，可以提到的載體有對於動物細胞，載體可以是例如pEGFP-N、p EGFP-C(Clontech)、pIND(Invitrogen)和pcDNA3．1／His(Invitrogen)，對於昆蟲細胞，載體可以是例如pFastBac HT(Gibco BRL)、pAcGHLT(PharMingen)、pAc5／V5-His、pMT／V5-His和pMT／Bip／V5-His(後三者Invitrogen)。
當以酵母細胞用作為宿主時，作為使用的表達載體的具體實例，可以提到的載體是具有酸性磷酸酶基因的啟動子的pAM82(美國科學院年報，801(1983))等等。用於酵母細胞的其它商品表達載體包括pPICZ(Invitrogen)和pPICZα(Invitrogen)。
對啟動子也沒有特別的限制。當以大腸桿菌用作為宿主時，明智的是使用色氨酸(trp)啟動子、lpp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、PL／PR啟動子等等。當宿主是芽孢桿菌種時，優選的是SP01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等等。當以酵母種為宿主時所用的啟動子，例如可以使用pH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子或ADH啟動子。當動物細胞用作為宿主時，優選的啟動子的例子是SV40衍生的啟動子、反錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、巨細胞病毒啟動子和SRα啟動子。
明智的是可以將常規的融合蛋白質表達載體用作為本發明基因的表達載體。對於所述載體的具體例子，可以提到的是用於表達與穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合的蛋白質的pGEX(Promega)等等。
對將需要的重組DNA(表達載體)導入到宿主細胞以便將其轉化的方法沒有特別的限制，可以使用各種常規的方法。可以常規的方法培養所獲得的轉化體，從而表達／產生由本發明基因編碼的需要的TSA305蛋白質並且該蛋白質在轉化體細胞內或外或在細胞膜上積累或分泌。
用於上述培養的培養基可根據使用的宿主細胞而從各種常規培養基中適當地選擇，並且在適用於宿主細胞生長的條件下進行培養。
如果需要，可採用利用其物理和／或化學特性的各種分離程序(參見，例如「seikagaku(生物化學)Data BookⅡ」，第1175-1259頁，第一版，第一次印刷，1980年6月23日由Tokyo Kagaku Dojin出版；生物化學，25(25)；8274(1986)；歐洲生物化學雜誌，163313(1987))來分離和純化由上獲得的重組蛋白質(TSA305蛋白)。對於所述的方法，可以具體特別提及的是例如普通的重構處理、用蛋白質沉澱劑的處理(鹽析)、離心、滲透休克處理程序、超聲處理、超濾、各種層析技術例如分子篩層析(凝膠過濾)、吸收層析、離子交換層析、親和層析和高效液相層析(HPLC)、透析和這些方法的結合。在上述方法中特別優選的是利用結合了特異性地與本發明的TSA305蛋白質結合的特異性抗體的柱的親和層析。
因此，本發明進一步提供了例如以上述方式獲得的新的TSA305蛋白質本身。如上文提到的方法，所述的蛋白質與線蟲的sel-1具有高水平的同源性並且能夠對各種癌症產生抑制作用，因此在藥物領域是有用的。
該TSA305蛋白質也可用作為生產對所述的蛋白質特異的抗體的免疫原。用作為抗原的成分可以是例如由上面介紹的遺傳工程技術產生的蛋白質或其片段。通過利用這樣的抗原，獲得所需要的抗血清(多克隆抗體)或單克隆抗體是可能的。生產所述抗體的方法本身是本領域內技術人員熟知的，在實施本發明時，也可以按照這些常規方法進行(參見，例如Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化學實驗，第二系列)「Men-eki Seikagaku kenkyuho(免疫生物化學方法)」，由日本生物化學協會編輯(1986))。
因此，例如用於免疫接種以獲得抗血清的動物可任意地選自於普通動物例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠和雞，並且可以以常規方法用上文提到的抗原進行免疫接種，收集血液和進行其它步驟。
通過從用上文提到的免疫原對動物的血漿細胞(免疫細胞)和漿細胞瘤細胞進行免疫而製備雜交瘤細胞，從其中選擇出所需要的產生抗體的克隆和培養所述的克隆，可以以常規的方法生產單克隆抗體。通常在選擇免疫接種的動物時考慮與用於細胞融合的漿細胞瘤細胞的相容性，並且通常優選地使用小鼠或大鼠。可以以類似於上文提到的抗血清的情況進行免疫接種，如果需要，也可以結合使用普通免疫佐劑等等。
對用於細胞融合的漿細胞瘤細胞沒有特別限制，但是例如可以使用各種骨髓瘤細胞例如p3(p3／x63-Ag8)(自然，256495-497(1975))、p3-U1(微生物學和免疫學的目前的課題，811-7(1978))、NS-1(歐洲免疫學雜誌，6511-519(1976))、MPC-11(細胞，8405-415(1976))、SP2／0(自然，276269-271(1978)等，大鼠中的R210(自然，277131-133(1979))等等以及從上述所有這些瘤細胞衍生的細胞。
在常規融合加速劑例如聚乙二醇(PEG)或仙臺病毒(HVJ)存在下，採用已知的方法可以進行上述免疫細胞和漿細胞瘤細胞的融合，並且也可以以常規的方式分離需要的雜交瘤(例如，酶學方法，733(1981)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化學實驗，第二系列)，參見上文)。
可以採用常規的方式尋找產生所需要的抗體的細胞系並且從其衍生單克隆抗體。因此，例如可以利用上面提到的本發明的抗原，採用通常用於檢測抗體的各種方法，例如ELISA技術(酶學方法，70419-439(1980))、噬菌斑技術、斑點試驗技術、凝結反應技術、烏赫特朗尼氏技術和放射性免疫測定等來完成產生抗體的細胞系的尋找。
例如，通過以常規方式培養所述的雜交瘤和收集培養上清液，或通過將雜交瘤施用到與其相容的哺乳動物，並且在雜交瘤生長之後，收集腹水液，可以從由此獲得的雜交瘤收集本發明的抗體。前一方法適用於獲得高純度的抗體，而後一方法適用於大量生產抗體。通過常規手段例如鹽析、凝膠過濾和親和層析可進一步將由此獲得的抗體純化。
根據其結合到本發明的TSA305蛋白質的能力對由此獲得的抗體進行定性，並且該抗體可優先地用於上面提到的TSA305蛋白質的純化以及通過免疫技術測試或區分該蛋白質。因此本發明也提供了這樣的新的抗體。
此外，基於本發明披露的本發明基因的序列的信息，例如通過利用所述基因的整個或部分核苷酸序列可以檢測單個或各種組織中本發明基因的表達。
例如，通過採用RT-PCR(反相轉錄聚合酶鏈反應；E．S．Kawasaki等人，RNA的擴增，PCR方案，方法和應用指南，學術出版社，SanDiego，21-27(1991))的RNA擴增、Northern印跡分析(分子克隆，冷泉港實驗室(1989))、原位RT-PCR(核酸研究，213159-3166(1993))、原位雜交等用於細胞水平測試的技術或通過NASBA技術(基於核酸序列的擴增；自然，35091-92(1991))或其它各種技術，可以常規方式進行上述的檢測。所有方式均獲得了好結果。
當使用RT-PCR技術時，不以任何方式限制使用的引物，只要它們特異於本發明的基因並且能夠僅僅特異性地擴增所述的基因就行。基於本發明的遺傳信息可以適當地設計其序列。通常，每個引物各具有包括20-30個核苷酸的部分序列。
以這種方式，本發明還提供了在本發明的TSA305基因的檢測中可用作為特異性引物和／或特異性探針的DNA片段。
附圖2是說明正常胰腺細胞和實施例1(4)獲得的四個細胞系的RT-PCR分析結果的照片圖。TSA305的結果顯示於上面部分，作為對照的β2-微球蛋白的結果顯示於底下部分。
附圖3是說明胰腺癌樣品和實施例1(5)獲得的其它樣品的RT-PCR分析結果的照片圖。TSA305的結果顯示於上面部分，作為對照的β2-微球蛋白的結果顯示於底下部分。實施本發明的最好方式下面的實施例用於更詳細地闡述本發明。
因此，將分別從13個人組織(成人腦、胎兒腦、肺、肝臟、胃、胰腺、脾臟、乳腺、膀胱、胎盤、睪丸、腎臟和心臟；Clontech的產物)中分離的polyA RNA(0．2微克)與25pmol的3』-錨定的寡聚-dT引物G(T)15MA(M是G、A和C的混合物)在8微升的焦碳酸二乙基酯處理的水中混合，將該混合物在65℃加熱5分鐘。向該溶液中加入4微升的5×第一鏈緩衝液(BRL的產物)、2微升的0．1M DTT(BRL的產物)、1微升的250mM DNTPs(BRL的產物)、1微升的核糖核酸酶抑制劑(40單位；Toyobo的產物)和1微升的SuperScriptⅡ逆轉錄酶(200單位；BRL的產物)。各個反應混合物的最終體積是20微升。將各個溶液在37℃保溫1小時，然後通過加入30微升的蒸餾水將其稀釋2．5倍，將稀釋液在-20℃儲藏直到使用。
通過在(α-33P)ATP-標記(Amersham的產品)的3』-錨定的引物存在下進行PCR擴增cDNA。以下述方式進行PCR以擴增該cDNA。因此，20微升的各個PCR混合物含有2微升的RT反應混合物、2微升的10×PCR緩衝液(Takara的產品)、4微升的2．5mM dNTPs、0．25微升的ExTaq DNA聚合酶(5單位／毫升；Takara的產品)、25pmol的(α-33P)ATP-標記的3』-錨定的寡聚-dT引物和25pmol的5』-引物(編號20，10聚體的脫氧寡聚核苷酸引物，具有任意序列，在本案情況下，顯示於SEQ IDNO4的核苷酸序列)。在下麵條件下進行PCR反應。因此，一個循環包括在95℃進行3分鐘，40℃進行5分鐘，和在72℃進行5分鐘；然後進行40個循環，各包括95℃進行0．5分鐘，40℃進行2分鐘和在72℃進行1分鐘，最後，允許反應在72℃進行5分鐘。
用乙醇提取各個PCR反應樣品，並且重懸浮於甲醯胺測序染料中，並且允許反應在6％丙烯醯胺-7．5M脲測序凝膠中進行。將凝膠不固定乾燥，並進行放射自顯影過夜。(1-2)擴增出的cDNA片段的亞克隆預先用放射性墨水標記放置了乾燥的凝膠的3MM濾紙。通過檢測針對該標記物的放射自顯影圖，將含有所需要的cDNA帶的凝膠與3MMM濾紙一起切下，與300微升的蒸餾水攪拌1小時。在去除聚丙烯醯胺凝膠和濾紙之後，在l微升的10毫克／毫升糖原和0．3M NaOAc作為載體存在下，通過乙醇沉澱回收cDNA，將之重新懸浮於10微升的蒸餾水中。對於再擴增，使用5微升的該溶液。PCR條件和引物與第一次PCR中的相同。回收具有合適尺寸的再擴增產物作為第一PCR產物，然後將該PCR產物克隆到pUC118載體(Takara產物)的HincⅡ位點。利用ABI 377自動測序儀(應用生物系統公司的產品)測定核苷酸序列。
將使用從13個人組織分離的mRNA產生的不同的圖譜模式進行比較，結果鑑定出了在胰腺中特異性表達的PCR產物。該產物被命名為TSA305。
該產物由371個核苷酸組成。利用FASTA程序(Person，W．R．，等人，美國科學院年報，85，2444-2448(1988))將該核苷酸的數據與在GenBank／EMBL資料庫中存在的DNA序列進行比較，表明該PCR產物與其它任何已知的DNA序列沒有同源性。(1-3)cDNA篩選利用寡聚(dT)+隨機6聚體-引導的人正常胰腺cDNA和Uni-ZAPTMXR(Stratagene的產品)構建人正常的胰腺cDNA文庫。採用上面提到的方法分離總的1×106克隆並且利用(α-33P)dCTP-標記的cDNA片段進行篩選。選擇陽性克隆並且在pBluescriptⅡSK(-)體內切下所插入的cDNA部分。
結果，將約100噬菌斑鑑定為相應的TSA305。基於該結果，計算出所有RNA的轉錄百分比為約0．01％。與TSA305同源的該裝配的cDNA序列(TSA305)包括含有2382核苷酸的開放讀碼框的7885核苷酸，它編碼由794胺基酸殘基組成的蛋白質，其分子量為88768道爾頓。
基於該一級序列，表明該基因產物(TSA305蛋白質)是含有纖維結合素Ⅱ型膠原結合域的蛋白質。
發現其座位是14號染色體上的q24．3-q31．1，其中認為該染色體上存在胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的致病基因。
本發明的TSA305基因顯示與線蟲sel-1具有高水平的同源性。(2)在組織中的表達為了檢測TSA305在組織中的表達概況，利用各種人組織進行northern印跡分析。
對於上述northern印跡分析，使用人MTN(多個組織Northern)印跡Ⅰ和Ⅱ(Clontech的產品)。利用具有T3和T7啟動子序列的一組引物通過PCR用(α-33P)dCTP標記cDNA片段。將含有擴增產物的膜進行預雜交(條件參見產物方案)，隨後根據產物方案進行雜交。
在雜交之後，洗滌膜並且在-80℃進行放射自顯影24小時。結果顯示於附

圖1。
在該附圖中，所使用的人組織是心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、脾臟、胰腺、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結腸和外周血液白細胞。
在該附圖中，在胰腺中觀察到與TSA305具有同源性的特異性的轉錄物。(3)FISH根據已知的方法，利用0．5微克的各個粘性DNA作為探針，實施FISH進行染色體排列(Takahashi，E．，等人，人類遺傳學，8614-16(1990))。用Provia 100膠片(富士的產品，ISO100)或CCD攝像機系統(應用成像公司，Sightvision的產品)檢測FISH。
結果，發現通過R顯帶法測試100個典型的(原)中期細胞獲得的信號定位於第14號染色體的q24．3-q31．1譜帶。因此，TSA305在染色體上的定位被鑑定為14 q24．3-q31．1。(4)由RT-PCR分析表明的在胰腺癌細胞系和胰腺癌組織中轉錄物的表達為了檢測在人胰腺癌細胞系和胰腺癌組織中TSA305基因是否表達，對四個細胞系(Aspcl(轉移性腺癌；國家癌症研究雜誌，67563-569(1981))、Bxpc3(腺癌，未分化的；癌症研究，415-23(1986))、MiaPaca2(腺癌；Int．J．Cancer，19128-135(1977))和PANC1(上皮樣的胰腺導管癌；Int．J．Cancer，15741-747(1975))和9個胰腺癌組織(東京大學醫學科學院的Nakamura博士惠贈)進行RT-PCR分析。
因此，用10單位的沒有RNA酶的DNA酶Ⅰ(Boehringer Mannheim的產品)處理利用ISOGEN(Wako的產品)從各個細胞系或胰腺癌組織分離的10微升總RNA，15分鐘，隨後用苯酚-氯仿重複提取兩次，並且用乙醇進行沉澱。利用SuperscriptITMRNA酶H逆轉錄酶(生命技術公司的產品)，用寡聚-d(T)和隨機引物合成單鏈cDNA。各個產物使用2微升進行PCR擴增。
在25個PCR擴增的循環中使用分別具有顯示於SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的核苷酸序列的引物P1和P2S。
在含有25納克的cDNA、10μM的各引物、2．5mM dNTP和0．25U的Extaq DNA聚合酶(Takara的產品)的20微升的溶液中進行PCR反應。將各個PCR產物溶解於1．5％瓊脂糖凝膠，用溴化乙錠染色。
以上述的方式將四個細胞系(泳道1=Aspc1；泳道2=Bxpc3；泳道3=MiaPaca2；泳道4=PANC1)和正常的胰腺組織(正常的胰腺，泳道5)進行RT-PCR分析。結果顯示於附圖2。TSA305的結果顯示於上面部分，作為對照的β2-微球蛋白的結果顯示於底下部分。
根據該附圖，發現在任何癌症組織中均沒有檢測到TSA305的表達，但是僅僅在正常胰腺組織檢測到(參見泳道5)。(5)TSA305基因在胰腺癌中的表達(RT-PCR)對來自胰腺癌患者的樣品(1T，2T，3T，5T，6T，7T，10T和11T)、胰腺癌(腫瘤胰腺)和正常的胰腺(Invitrogen；人正常的胰腺)以及相同患者的癌的部分(23T)和非癌的部分(23N)，採用RT-PCT技術檢測TSA305基因的表達。結果如下。
從各個樣品提取mRNA並且通過RT-PCR來擴增TSA305的1581-2382 bp(801個鹼基對)的片段，並進行測試是否有表達的實驗。作為濃度對照，使用β2-微球蛋白。結果顯示於附圖3。
根據該附圖，與正常胰腺相比，在所有胰腺癌樣品中觀察到TSA305基因的表達降低或者沒有表達。
工業實用性根據本發明，提供了新的胰腺特異性TSA305基因和由其編碼的蛋白質，並且通過利用這一基因或蛋白質，提供了可用於闡明、診斷、預防和治療癌症，例如胰腺癌或惡性轉化的技術。
序列表110大塚製藥株式會社120TSA305基因130P98-53150JP H9-3433789和H10-1268031511997-11-28和1998-4-201606170PatentIn 2．0版本2101211794212PRT213正常人胰腺cDNA文庫4001Met Arg Val Arg Ile Gly Leu Thr Leu Leu Leu Cys Ala Val Leu Leu1 5 10 15Ser Leu Ala Ser Ala Ser Ser Asp Glu Glu Gly Ser Gln Asp Glu Ser20 25 30Leu Asp Ser Lys Thr Thr Leu Thr Ser Asp Glu Ser Val Lys Asp His35 40 45Thr Thr Ala Gly Arg Val Val Ala Gly Gln Ile Phe Leu Asp Ser Glu50 55 60Glu Ser Glu Leu Glu Ser Ser Ile Gln Glu Glu Glu Asp Ser Leu Lys65 70 75 80Ser Gln Glu Gly Glu Ser Val Thr Glu Asp Ile Ser Phe Leu Glu Ser85 90 95Pro Asn Pro Glu Asn Lys Asp Tyr Glu Glu Pro Lys Lys Val Arg Lys100 105 110Pro Ala Leu Thr Ala Ile Glu Gly Thr Ala His Gly Glu Pro Cys His115 120 125Phe Pro Phe Leu Phe Leu Asp Lys Glu Tyr Asp Glu Cys Thr Ser Asp130 135 140Gly Arg Glu Asp Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Tyr Asp Tyr Lys145 150 155 160Ala Asp Glu Lys Trp Gly Phe Cys Glu Thr Glu Glu Glu Ala Ala Lys165 170 175Arg Arg Gln Met Gln Glu Ala Glu Met Met Tyr Gln Thr Gly 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權利要求
1．一種胰腺特異性基因，它包括編碼具有如SEQ ID NO1所示胺基酸序列的蛋白質的鹼基序列。
2．根據權利要求1所述的基因，它是人基因。
3．根據權利要求1所述的基因，它由SEQ ID NO2顯示的鹼基序列定義。
4．根據權利要求3所述的基因，它是人基因。
5．一種胰腺特異性基因，它是下面的(a)或(b)定義的多聚核苷酸(a)包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列的全部或一部分的多聚核苷酸；(b)在嚴謹條件下能夠與具有顯示於SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA雜交的多聚核苷酸。
6．根據權利要求5所述的基因，它是人基因。
7．根據權利要求5所述的基因，它是在檢測由權利要求1定義的胰腺特異性基因中可用作為特異性探針或特異性引物的DNA片段。
8．一種具有SEQ ID NO1所示的胺基酸序列的胰腺特異性蛋白質。
9．能夠與權利要求8定義的胰腺特異性蛋白質結合的抗體。
全文摘要
本發明提供了一種胰腺特異性基因,該基因包括編碼顯示於SEQIDNO:1的胺基酸序列的鹼基序列,該基因對於胰腺癌的研究、診斷和治療以及在其它領域是特別有效的。
文檔編號A61K38/00GK1280617SQ98811639
公開日2001年1月17日 申請日期1998年11月25日 優先權日1997年11月28日
發明者原田陽介, 尾崎浩一 申請人:大塚製藥株式會社