編碼高甜度莫奈靈的基因及其產物蛋白的應用的製作方法
2023-06-20 16:54:56 2
專利名稱：編碼高甜度莫奈靈的基因及其產物蛋白的應用的製作方法
技術領域：
本發明提供了採用基因工程技術提高莫奈靈(monellin)甜度和發酵生產高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)的方法及其應用。
本發明還提供了人工合成編碼高甜度莫奈靈的基因，以及攜帶該基因的表達載體和含有表達載體的重組細胞，及其由重組細胞高效生產的高甜度莫奈靈蛋白及其應用。
莫奈靈甜蛋白來源於西非一種熱帶植物(Dioscorephyllum cumminsii)的果實(Morris，.J.A.，Cagan，R.H.，Biochim.Biophys.Acta，261114-122，1972)，是一種天然蛋白質甜味劑。莫奈靈甜蛋白在許多方面優於蔗糖和其他甜味劑(1)莫奈靈不含碳水化合物(Morris，J.A.，The Journal of Biological Chemistry，241(2)534-539，1973)，代謝產生的熱量低。(2)莫奈靈甜度高，按重量比其甜度是蔗糖的3000倍，按分子比計算則為蔗糖的10萬倍(Kim，S.H.，deVos，A.M.，Trends in Biochem.Sci.1313-15，1988)，是現有甜味劑中甜度最高的一種。(3)莫奈靈是天然蛋白質，富含多種胺基酸(Morris，J.A.，TheJournal of Biological Chemistry，241(2)534-539，1973)，營養豐富，因對人體無任何毒副作用，不僅老幼正常人可直接食用，而且糖尿病人、肥胖病人、心腦血管病人和兒童齲齒病人皆可直接食用。(4)莫奈靈對細菌作用的穩定性高，不會導致齲齒。(5)莫奈靈是一種增香劑，尤其對天然香料，效果更明顯。在食品、飲料、醫療保健等方面有廣泛的應用前景，是一種很有前途的甜味劑。
但作為莫奈靈天然來源的植物正常結實所要求的生態環境非常苛刻，很難在其他地區引種成功另外，天然莫奈靈由A、B兩條多肽鏈組成，穩定性較差，低pH或高溫條件下，A、B兩條多肽鏈易分開，而失去甜味活性。生物工程技術的迅速發展啟發人們用基因工程的手段去改造和開發莫奈靈，實現其在生產和生活中的廣泛應用。
1989年，Kim等人用一小段DNA序列將編碼A、B鏈的基因連接起來，並使其成功的在大腸桿菌中表達，單鏈莫奈靈(single monellin)與天然莫奈靈相比，兩者甜度接近，但前者穩定性和復性能力較後者都有顯著提高(United States Patent 5264558)。1992年，Penanubia等得到轉單鏈莫奈靈基因的番茄和萵苣，但莫奈靈表達效率較低(Penarrubia，L.，Kim，R.，Giovannoni，J.，Bio/Technology 10561-564，1992)。1995年，郭三堆等採用原核生物偏愛密碼子合成單鏈莫奈靈基因，使其在大腸桿菌中得到高效表達，莫奈靈達菌體可溶性蛋白的20％，表達效率較低。1996年，Kondo.K.等使單鏈莫奈靈基因在酵母(Candida utilis)中表達，表達效率高達50％(Kondo，K.，Miura，Y.，Sone，H.，NatureBiotechnology 15453-457，1997)，為莫奈靈的規模生產和應用創造了條件。以上所涉及的人工改造的莫奈靈基因產物，甜度均為蔗糖重量甜度的3000倍。本發明人工合成的高甜度莫奈靈基因產物是蔗糖重量甜度的4500倍，在蛋白質結構上與上述人工改造的莫奈靈有所不同。
1990-1992年間，Kohmura對天然莫奈靈的結構和功能進行研究，用固定相合成法分別對莫奈靈分子中的Asp、Glu進行突變，將Asp變成Asn、Glu變成Gln。意外地發現AsnA16、Asn26monellin甜度與天然莫奈靈相比，分別由原來蔗糖重量甜度的3000倍提高到了5500倍和7500倍(Kohmura，M.，Nio，N.，Ariyoshi，Y.，BioSci.Biotech.Biochem.，56(3)472-476，1992)，由此可見，用固相合成法可以得到高甜度莫奈靈，但這種方法與本發明在細菌中生產高甜度莫奈靈的方法相比較成本太高。
本發明的目的是在前人工作的基礎上，不僅要提高莫奈靈蛋白的甜度，同時要建立一種簡便、快速、可大規模生產廉價高甜度莫奈靈的方法及其產物的應用。
本發明提供的高甜度莫奈靈蛋白，將天然莫奈靈的A鏈和B鏈合併成一條單鏈，其間加入了具有彈性彎曲特性的胺基酸，並將第66位Asp設計為Asn，從而既維持了與天然莫奈靈相似的空間結構，又提高了所表達甜蛋白的效率、穩定性和甜度。
本發明提供了高甜度莫奈靈的胺基酸序列SEQ ID No.1及其功能等同物，DNA序列SEQ IDNo.2及其功能等同物以及特別適於在大腸桿菌中高效表達的DNA序列SEQ ID No.3及其功能等同物。以SEQ ID No.2及其功能等同物為基礎，根據所選宿主細胞對密碼子的偏愛性，可以得到適於在真核和原核生物不同宿主中表達的高甜度莫奈靈DNA序列。本文所用的述語「功能等同物」指編碼具有甜度功能蛋白質的DNA序列。
本發明中人工合成的高甜度莫奈靈基因可以通過DNA重組技術，連接到適當的表達載體中，以構建本發明的重組表達載體。
在本發明的一個優選實施方案中，提供了適於在大腸桿菌中表達的高甜度莫奈靈的DNA序列，並藉助原核生物高效表達載體pBV221，構建了含有該序列的重組表達質粒pGB[Asn66]m.。含有該重組表達質粒的菌株已按照布達佩斯條約的規定，於1998年6月9日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏登記號為CGMCCNO.0352。
本發明提供了用於發酵的基因工程菌B121-GB[Asn66]m.，實現了高甜度莫奈靈在大腸桿菌中的高效表達，高甜度莫奈靈達菌體可溶性蛋白的40％以上，並建立了簡便有效分離純化表達產物高甜度莫奈靈的方法，因此本發明具有大規模生產的意義。
本發明的高甜度莫奈靈與天然莫奈靈相比，穩定性明顯提高，甜度由原來蔗糖重量甜度的3000倍提高到4500倍；相對蔗糖分子甜度由原來的10萬倍提高到15萬倍。
本發明提供的高甜度莫奈靈作為甜味劑可以代替蔗糖和其他甜味劑用於食品、飲料的生產，尤其適用於低卡保健食品、飲料、醫藥的生產，另外，還可以作為增香劑生產香菸、口香糖、飼料等，有十分廣闊的應用前景。
本發明中帶有SEQ ID No.2序列及其功能等同物的重組表達載體可使用任何已知的轉化方法轉化到相應的宿主細胞中，獲得帶有上述重組表達載體的重組細胞。可供選擇的宿主包括微生物、植物、動物。其中微生物包括大腸桿菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、鏈黴菌等各種革蘭氏陽性和陰性菌；靈芝、猴頭、食用黴菌等各種真菌；啤酒酵母、甲醇酵母等各種真核微生物。植物包括各種瓜、果、蔬菜、糧食作物等植物反應器。動物包括各種昆蟲，例如家蠶等昆蟲反應器。各種哺乳動物，例如小鼠、兔、豬、羊、牛等動物反應器。凡涉及本發明高甜度莫奈靈基因的各種生物，均屬本發明權利要求範圍之內。
本發明的
如下圖1適於在大腸桿菌中表達的高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因10個小片段的合
成序列。
圖2高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因的組裝示意圖。
圖3高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因克隆載體pG[Asn66]m.的構建。
圖4高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因表達質粒pGB[Asn66]m.的構建。
圖5高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)在大腸桿菌中的溫度誘導表達。
Lane1.GB[Asn66]m.42℃誘導表達的可溶性蛋白。
Lane2.GB[Asn66]m.30℃培養表達的可溶性蛋白。
Lane3.低分子量蛋白標準。
圖6高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)在優化發酵條件下的誘導表達。
Lane1.在優化發酵條件下GB[Asn66]m.誘導表達的可溶性蛋白。
Lane2.低分子量蛋白標準。
圖7在優化發酵條件下GB[Asn66]m.誘導表達可溶性蛋白的黑度掃描。
注PEAK No.18為高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)。
圖8高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)純化結果的SDS-PAGE檢測。
Lane1.低分子量蛋白標準。
Lane2.GB[Asn66]m.42℃誘導表達的可溶性蛋白。
Lane3.純化的高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)。
實施例1、高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因片段的合成及完整基因的組裝A、基因的設計高甜度莫奈靈由94個胺基酸組成(SEQ ID No.1)，為了得到甜度較天然莫奈靈(monellin)高的蛋白產物，將第66位的胺基酸設計為Asn(相應於天然莫奈靈A鏈第16位的Asp)，其基因有282bp，所有胺基酸的密碼子均選用大腸桿菌偏愛的密碼子，加上起始密碼子ATG、終止密碼子TAA及5′和3′末端克隆時用的限制性內切酶酶切點及保護鹼基共298bp。將它分為10個小片段來合成，10個片段的序列見圖1。
B、小片段的合成及完整高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因的組裝小片段的合成由北京賽百盛公司完成。
每個小片段取1nmol，用T4多核苷酸激酶分別加5′-P，然後混合加5′-P後的10個片段，進行退火反應100℃5min，然後緩慢冷卻至室溫。再用T4DNA連接酶連接成完整的高甜度莫奈靈基因([Asn66]monellin)(圖2)。
實施例2、高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因的克隆及鑑定克隆步驟按常規方法進行(Sambrook，J.et al，Molecular Cloning-A LaboratoryManual，2nd ed，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。
如圖3所示，先用限制性內切酶HincII水解克隆載體pUC19，並用小牛腸鹼性磷酸酶(CIAP)脫去其5′-P，然後用T4DNA連接酶將高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因(約0.3Kb)與脫磷的pUC19/HincII(約2.7Kb)載體相連接，連接後轉化Ecoli.DH5α受體菌。用NcoI和BamHI酶切克隆子質粒，篩選有外源DNA片斷插入的克隆子。鹼法提取重組克隆的質粒pG[Asn66]m.(約3.0Kb)，用Pharmacia公司的T7 Sequencing Kit測序(操作按Kit說明書進行)，證明高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)基因序列準確無誤。
實施例3、表達質粒pGB[Asn66]m的構建為了保證高甜度莫奈靈[Asn66]monellin基因在大腸桿菌中的高效表達，我們選擇了pBV221為表達載體。其技術特徵是串聯強啟動子PRPL，含有溫度敏感的PRPL啟動子阻礙蛋白基因CIts857，PMBI複製基因，rrnβ強轉錄終止信號，氨苄青黴素抗性基因等高效表達所需的調控元件。
用限制性內切酶NcoI和BamHI水解pG[Asn66]m.，電泳回收[Asn66]monellin基因片段(約0.3Kb)，與用同樣兩種限制性內切酶水解的pBV221大片段(約3.7Kb)連接並轉化大腸桿菌BL21感受態細胞。挑取單菌落提質粒，同樣用NcoI和BamHI進行雙酶切鑑定，得到已有[Asn66]monelliin基因插入的重組質粒pGB[Asn66]m.(約4.0Kb)(圖4)，含重組質粒的大腸桿菌BL21-GB[Asn66]m.即為[Asn66]monellin基因工程菌。
實施例4、[Asn66]monellin在大腸桿菌中的誘導表達基因工程菌GB[Asn66]m.在30℃，用加Amp100mg/L LB(1％胰蛋白腖、0.5％酵母提取物、1％氯化鈉，pH7.2)培養基振蕩培養過夜後，以1％比例接種於加Amp100mg/L LB培養基中，30℃培養約2小時後，將溫度升至42℃誘導培養5小時。以未經42℃誘導表達的培養物作對照，SDS-PAGE檢測結果如圖5所示，經高溫誘導的基因工程菌表達了分子量大小與[Asn66]monellin一致且有甜味活性的特異蛋白。
實施例5、[Asn66]monellin的發酵生產基因工程菌GB[Asn66]m.在30℃，用加Amp100mg/L LB(1％胰蛋白腖、0.5％酵母提取物、1％氯化鈉，pH7.2)培養基振蕩6小時培養後，以1％比例接種於補充0.1％葡萄糖，初始pH6.5的加Amp 100mg/L 2YT(1.6％胰蛋白腖、1％酵母提取物、0.5％氯化鈉)培養基中，30℃培養約2小時後，將溫度升至42℃誘導培養6小時。在上述優化發酵條件下，[Asn66]monellin表達的SDS-PAGE檢測結果如圖6所示。對圖6中的Lanel進行黑度掃描，PEAK No.18代表的[Asn66]monellin佔菌體可溶性蛋白的40％以上(圖7)，說明這一表達質粒的表達效率較高。
實施例6、基因工程菌的保存及穩定性基因工程菌BL21-GB[Asn66]m.保存於15％甘油中，-70℃。傳代培養基為固體LB培養基，固體平板菌在4℃保存。為檢查工程菌的穩定性，每傳10代作一次酶切圖譜分析，結果與原始菌種相同，在50代時進行的[Asn66]monellin基因序列分析與原始設計基因相同，證明本發明構建的基因工程菌是十分穩定的。
實施例7、[Asn66]monellin的分離純化發酵後，5000rpm離心10min收集菌體，用溶液A(0.01mol/L磷酸鈉緩衝液，PH7.2)洗滌後，以每克溼菌體用2ml溶液B(溶液A+2mmol/LEDTA)的比例懸浮菌體。用超聲波破碎菌體後，離心去除細胞碎片，然後用70％飽和度的硫酸鈉沉澱蛋白，離心收集蛋白用溶液B重新溶解後，用溶液A於4℃透析過夜，其間換3次透析液。透析後的蛋白溶液上用溶液A平衡的CM Sephadex C-25柱，用溶液C(溶液+0.1mmol/LNaCl)洗脫，收集與[Asn66]monellin蛋白相應位置的峰，所得產品用15％的SDS-PAGE(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，分子克隆-實驗指南第二版880-886，科學出版社，1995)檢測為單一條帶(圖8 Lane3)，證明本發明採用的純化方法十分可靠。
實施例8、[Asn66]monellin相對(蔗糖)甜度的測定首先配製0.02％(W/V)的[Asn66]monellin水溶液，然後將此溶液分別稀釋成10、15、20等不同稀釋倍數的溶液，通過品嘗確定甜度與2％(W/V)蔗糖溶液相當的稀釋溶液。相對甜度(W/W)＝100×稀釋倍數，稀釋45倍的0.02％(W/V)的[Asn66]monellin溶液甜度與2％(W/V)蔗糖溶液相當，因此[Asn66]monellin相對(蔗糖)甜度為4500倍，明顯高於天然莫奈靈(monellin)的甜度(3000倍)。
上面的實施例進一步舉例詳細說明了本發明，但不能認為是對本發明的限制。上面的許多實驗方法和步驟都可以用其他常規方法替代，這樣的替代和本領域技術人員所熟悉的改動和變化，應落入本發明權利要求範圍內。
序列表1、序列編號(SEQ ID No.)1(1)序列特徵A.序列長度94個胺基酸B.序列類型胺基酸C.拓撲學直鏈狀(2)分子類型蛋白質(3)假設序列是(4)反意序列不是(5)序列描述Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu15 10 15Gly Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly20 25 30Arg Leu Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr35 40 45Ile Tyr Glu Asn Glu Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu50 55 60Tyr Val Tyr Ala Ser Asn Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu65 70 75Asp Tyr Lys Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro80 85 90Val Pro Pro Pro2.序列編號(SEQ ID No.)2(1)序列特徵A.序列長度282個鹼基B.序列類型核酸C.拓撲學直鏈狀D.鏈數雙鏈(2)分子類型寡核苷酸(3)假設序列是(4)反意序列不是(5)序列描述GGN GAR TGG GAR ATH ATH GAY ATH GGN CCN TTY CAN CAR AAY YTN45GGN AAR TTY GCN GTN GAY GAR GAR AAY AAR ATH GGN CAR TAY GGN90MGN YTN CAN TTY AAT AAR GTN ATH MGN CCN TGY ATG AAR AAR CAN 135ATH TGG GAR AAY GAR MGN GAR ATH AAR GGN TAY GAR TAY CAR YTN180TAY GTN TAY GCN WSN AAY AAR YTN TTY MGN GCN GAY ATH WSN GAR225GAY TAY AAR CAN MGN GGN MGN AAR YTN YTN MGN TTY AAY GGN CCN270GTN CCN CCN CCN282R＝A or G Y＝C or T M＝A or C K＝G or T S＝C or G W＝A or TH＝A or C or T V＝A or C or G D-A or G or T N＝A or C or G or T3.序列編號(SEQ ID No.)3(1)序列特徵A.序列長度282個鹼基B.序列類型核酸C.拓撲學直鏈狀D.鏈數雙鏈(2)分子類型寡核苷酸(3)假設序列是(4)反意序列不是(5)序列描述GGT GAA TGG GAA ATC ATC GAC ATC GGT CCG TTC ACC CAG AAC CTG45GGC AAA TTC GCT GTT GAC GAA GAA AAC AAA ATC GGT CAG TAC GGT90CGT CTG ACC TTC AAC AAA GTT ATC CGT CCG TGC ATG AAG AAA ACC 135ATC TAC GAA AAC GAA CGT GAA ATC AAA GGT TAC GAA TAC CAG CTG 180TAC GGT TAC GCT TCC AAC AAA CTG TTC CGT GCT GAC ATC TCC GAA 225GAC TAC AAA ACC CGA GGT CGT AAA CTG CTG CGT TTC AAC GGT CCG 270GTT CCG CCG CCG 28權利要求
1.一種蛋白質，它包含胺基酸序列SEQ ID No.1及其功能等同物。
2.一種編碼權利要求1的蛋白質的核苷酸序列。
3.根據權利要求2的核苷酸序列，其中所述序列是DNA序列。
4.根據權利要求3的DNA序列，包含SEQ ID No.2及其功能等同物。
5.根據權利要求4的DNA序列，適用於各種原核和真核生物。
6.根據權利要求3的DNA序列，所述序列包含適於在原核細胞中高效表達的高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)的DNA序列SEQ ID No.3及其功能等同物。
7.根據權利要求6的DNA序列及功能等同物，其基本上由原核生物偏愛密碼子組成。
8.根據權利要求7的DNA序列及其功能等同物，其中所說的原核生物偏愛密碼子選自大腸桿菌，並適用於各種原核生物。
9.根據權利要求8的DNA序列及其功能等同物，其中所說的原核生物是大腸桿菌。
10.包含根據權利要求1至7中任一項的DNA序列的重組表達載體。
11.由根據權利要求10的重組表達載體轉化的重組細胞。
12.根據權利要求11的重組細胞，其為重組原核細胞。
13.根據權利要求12的重組細胞，其為重組大腸桿菌。
14.根據權利要求13的重組細胞，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCC NO.0352。
15.一種製備高甜度莫奈靈([Asn66]monellin)蛋白的方法，包括從重組細胞培養物中分離該甜蛋白。
16.根據權利要求15的方法，其中所說的高甜度莫奈靈蛋白([Asn66]monellin)是由權利要求6中DNA序列所編碼。
17.根據權利要求15的方法，其中所說的重組細胞是重組大腸桿菌。
18.根據權利要求15的方法，其中所說的重組細胞是大腸桿菌BL21-GB[Asn66]m.。
全文摘要
本發明提供了人工合成編碼高甜度莫奈靈([Asn
文檔編號C12N15/70GK1202495SQ98102420
公開日1998年12月23日 申請日期1998年6月12日 優先權日1998年6月12日
發明者郭三堆, 李敏 申請人:中國農業科學院生物技術研究中心