一株高效降解甲氧咪草煙的鮑曼不動桿菌的製作方法

2023-06-20 07:59:21

專利名稱：一株高效降解甲氧咪草煙的鮑曼不動桿菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株鮑曼不動桿菌。
背景技術：
甲氧咪草煙(Imazamox)是德國BASF公司(原美國氰胺公司)20世紀80年代初研製開發的咪唑啉酮類大豆田專用除草劑，它對一年生和多年生的禾本科、闊葉科、莎草科雜草及多種灌木和落葉樹有活性。由於該產品比其他滅生性除草劑具有較長的持效期，可控制雜草4 6個月，故20世紀90年代初期在北美、歐洲、東南亞等國家已得到大面積推廣使用，是目前國內外使用量較大的一種滅生性除草劑品種，但這類除草劑在土壤中殘留時間較長，容易對後茬作物正常生長造成影響。目前國內外對甲氧咪草煙的研究報導主要集中在使用情況和藥害方面，而關於降解菌株的篩選以及應用方面較少。

發明內容
本發明提供了一株鮑曼不動桿菌(AcinetcAacter baumannii)菌株，可高效降解甲氧咪草煙，為甲氧咪草煙除草劑的環境修復和降解機制研究提供理論和微生物資源基石出。本發明高效降解甲氧咪草煙菌株的鮑曼不動桿菌為鮑曼不動桿菌 IB5 (Acinetobacterbaumannii IB5)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年04月01 日，保藏編號為CGMCC No. 4728 ；本發明鮑曼不動桿菌IB5為革蘭氏陰性菌，杆狀，細胞大小為(0. 3μπι 0. 5μ )Χ(0. 8μπι 2. 2μ )，無鞭毛(如圖1所示)，產生菌膜，在無機鹽固體培養基上培養，菌落呈圓形，顏色為乳白色。本發明鮑曼不動桿菌ΙΒ5氧化酶反應呈陰性，接觸酶反應呈陰性。鮑曼不動桿菌 ΙΒ5能夠水解澱粉，氧化乳糖，不氧化山梨醇或蔗糖。本發明鮑曼不動桿菌ΙΒ5 (Acinetobacter baumannii IB5)通過 16S rDNA序列比對分析，與不動桿菌屬(Acinetobacter)的鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)的 16S rDNA序列的同源性最高，保守區相似性為99%，通過結合菌體形態特徵、生長條件、生理生化鑑定結果確定鮑曼不動桿菌IB5屬於不動桿菌屬(AcinetcAacter)，為鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)菌株。本發明鮑曼不動桿菌IB5可在添加了甲氧咪草煙的LB培養基和無機鹽培養基上生長，培養基中甲氧咪草煙的最佳終濃度為800mg/L。鮑曼不動桿菌IB5的最適生長溫度為 37°C，最適合生長環境的pH值為6 7。本發明鮑曼不動桿菌IB5能夠高效降解甲氧咪草煙，鮑曼不動桿菌IB5在甲氧咪草煙濃度為800mg/L的無機鹽培養基中，在37°C、pH值為7的條件下，培養48h，對甲氧咪草煙的降解率達到92. 46%。本發明鮑曼不動桿菌IB5對甲氧咪草煙殘留具有修復作用。
本發明鮑曼不動桿菌IB5 (Acinetobacter baumannii IB5)屬於不動桿菌屬 (AcinetcAacter)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年04月01日，保藏編號為 CGMCC No. 4728 ο


圖1為本發明鮑曼不動桿菌ΙΒ5的電子顯微鏡照片；圖2為通過鮑曼不動桿菌ΙΒ5 和相近菌株的16S rDNA序列進行同源性比對構建的系統發育樹圖；圖3為具體實施方式
二中甲氧咪草煙濃度和鮑曼不動桿菌IB5的菌體數量隨時間的變化關係曲線，-■-為鮑曼不動桿菌IB5菌體數量變化曲線，-▲-為甲氧咪草煙濃度的變化曲線。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式高效降解甲氧咪草煙菌株的鮑曼不動桿菌為鮑曼不動桿菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年 04月01日，保藏編號為CGMCC No. 47280本實施方式鮑曼不動桿菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)為革蘭氏陰性菌， 杆狀，細胞大小為(0. 3 μ m 0. 5 μ m) X (0. 8 μ m 2. 2 μ m)，無鞭毛，產生菌膜，在無機鹽固
體培養基上培養，菌落呈圓形，顏色為乳白色。參照《伯傑細菌鑑定手冊》第八版和《常見細菌系統鑑定手冊》對鮑曼不動桿菌 IB5 (Acinetobacter baumannii IB5)進行生理生化鑑定鮑曼不動桿菌IB5氧化酶反應呈陰性，接觸酶反應呈陰性。鮑曼不動桿菌IB5能夠水解澱粉，氧化乳糖，不氧化山梨醇或蔗糖。本實施方式鮑曼不動桿菌IB5可在添加了甲氧咪草煙的LB培養基和無機鹽培養基上生長，培養基中甲氧咪草煙的最佳終濃度為800mg/L。其中無機鹽培養基(IOOOmL)由 1. Og 的 NaCl、l. Og 的 NH4NO3U. 5g 的 K2HP04、0. 5g 的 KH2P04、0. Ig 的 MgSO4 · 7H20 和餘量的蒸餾水組成。無機鹽培養基加熱充分溶解後於121°C高壓滅菌15min，冷卻至50 60°C後向其中加入甲氧咪草煙至終濃度為500mg/L。本實施方式鮑曼不動桿菌IB5的最適生長溫度為37°C，最適合生長環境的pH值為 6 7。
具體實施方式
二 本實施方式鮑曼不動桿菌IB5 (Acinetobacter baumannii IB5) 由中國黑龍江省訥河市受除草劑汙染的土壤中篩選得到。篩選按以下步驟進行取黑龍江省訥河市長期施用甲氧咪草煙藥害農田土壤5g於滅菌的廣口瓶中，加入50mL的生理鹽水， 振蕩30s，用8層紗布過濾，取過濾液ImL加入到無機鹽培養基中，於30°C、180r/min條件下培養7 10天，期間不斷補充甲氧咪草煙，使甲氧咪草煙的濃度提高至800mg/L，得富集培養液；將無機鹽固體培養基(IOOOmL無機鹽固體培養基由1. Og的NaCl、l. Og的NH4NO3U. 5g 的K2HP04、0. 5g的KH2P04、0. Ig的MgSO4 · 7H20、20g的瓊脂和餘量的蒸餾水組成)滅菌後冷卻到50 60°C，加入甲氧醚草煙使其終濃度至800mg/L，製作平板，取富集培養液IOOyL 均勻塗布在平板上，於30°C培養24h後挑取生長較好的菌落進行三區劃線以獲得純培養上述優選菌株經初篩、復篩和純化，即可得到鮑曼不動桿菌IB5。對篩選得到的鮑曼不動桿菌IB5進行分子鑑定，按以下步驟進行用熱破壁法提取篩選得到的菌株的總DNA，採用細菌的16S rDNA通用引物，以基因組DNA為模板進行PCR 擴增，然後利用膠回收試劑盒(購自於大連寶生物工程有限公司)回收純化PCR產物，之後進行克隆、轉化，篩選陽性克隆子菌落，經擴大培養後委託上海生工生物技術有限公司測序。鮑曼不動桿菌IB5的16S rDNA序列長度為1524bp，其序列提交至GenBank獲得的登錄號為FJ550344。測序結果通過在線分析與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性比對，然後用軟體Mega4. 0的Neibour-Joining進行系統發育樹的構建(如圖2所示)，以確定菌株的種屬關係。同源性分析結果表明，該序列與不動桿菌屬(AcinetcAacter)的鮑曼不動桿菌(AcinetcAacter baumannii)的16S rDNA序列的同源性最高，保守區相似性為 99%，通過結合菌體形態特徵、生長條件、生理生化鑑定結果確定鮑曼不動桿菌IB5屬於不動桿菌屬(Acinetobacter)，為鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)。PCR引物購買自上海生工生物技術有限公司，其他試劑購自於大連寶生物工程有限公司。對本實施方式鮑曼不動桿菌IB5降解甲氧咪草煙的降解率進行測定，具體方法如下將鮑曼不動桿菌IB5接入含有800mg/L甲氧咪草煙的無機鹽培養基中，於37°C、 PH值為7. O的條件下培養，設置不接菌的無機鹽培養基為對照，做三個重複，每隔3小時取待測樣品l.OmL，按1 5的比例加入二氯甲烷，劇烈振蕩5min，靜置分層，取下層有機相， 於45°C旋轉蒸發至二氯甲烷完全揮發；流動相定容後，取10μ L進樣檢測。檢測條件檢測波長252nm;色譜柱ODS C18規格4. 6nmX 150nm ；流動相色譜甲醇1.0%乙酸(7 3)； 流速1. OmL/min ；進樣量10μ L。根據甲氧咪草煙標準品的標準曲線計算出待測樣品中甲氧咪草煙的殘留量，根據以下公式求出其降解率甲氧咪草煙降解率(％) = [1_(實測殘留量/對照實測殘留量)]X 100。在甲氧咪草煙濃度為800mg/L、37°C、pH = 7. 0的最適生長條件下，菌株生長狀況良好。培養液中甲氧咪草煙濃度和鮑曼不動桿菌IB5的菌體數量隨時間的變化關係曲線如圖3所示，隨著菌體數量的增加，培養液中的甲氧咪草煙殘留量逐漸減少，培養48h以後培養液中的甲氧咪草煙含量從800mg/L降低到60. 32mg/L,降解效率達到92. 46%，說明鮑曼不動桿菌IB5對甲氧咪草菸具有較高的降解效率。利用敏感作物檢測本實施方式鮑曼不動桿菌IB5對甲氧咪草煙殘留的修復作用， 具體方法如下將鮑曼不動桿菌IB5接入含有800mg/L甲氧咪草煙的無機鹽培養基(以甲氧咪草煙為唯一碳源)中，於37 °C、pH值為7. 0的條件下培養4 後，取發酵液經過0. 02 μ m 的細菌濾器過濾，分別取5mL無菌的發酵液加入帶有雙層濾紙的滅過菌的2個平皿中，分別均勻地加入50粒油菜種子和50粒穀子種子，作為實驗組；分別取5mL未接鮑曼不動桿菌 IB5的含有800mg/L甲氧咪草煙的無機鹽培養基，分別加入帶有雙層濾紙的滅過菌的2個平皿中，分別均勻地加入50粒油菜種子和50粒穀子種子，作為對照組1 ；將鮑曼不動桿菌IB5 接入不含有甲氧咪草煙的無機鹽培養基中，於37°C、pH值為7. 0的條件下培養4 後，取發酵液經過0. 02 μ m的細菌濾器過濾，分別取5mL無菌的發酵液加入帶有雙層濾紙的滅過菌的2個平皿中，分別均勻地加入50粒油菜種子和50粒穀子種子，作為對照組2，每組處理重複3次。然後於25°C培養2 3天，培養要保持通風和適宜的溼度。觀察種子發芽情況後統計種子的發芽率，比較甲氧咪草煙對種子發芽率的抑制情況，結果如表1所示。(對照組 1表示甲氧咪草煙未降解的條件下種子的發芽情況，對照組2中不加甲氧咪草煙，可以檢測種子本身的發芽情況)表 權利要求
1. 一株高效降解甲氧咪草煙的鮑曼不動桿菌，其特徵在於高效降解甲氧咪草煙菌株的鮑曼不動桿菌為鮑曼不動桿菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年04月01日，保藏編號為CGMCC No. 4728。
全文摘要
一株高效降解甲氧咪草煙的鮑曼不動桿菌，它涉及一株鮑曼不動桿菌。本發明提供了一株鮑曼不動桿菌菌株，可高效降解甲氧咪草煙，為甲氧咪草煙除草劑的環境修復和降解機制研究提供理論和微生物資源基礎。本發明高效降解甲氧咪草煙菌株的鮑曼不動桿菌為鮑曼不動桿菌IB5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年04月01日，保藏編號為CGMCCNo.4728。本發明鮑曼不動桿菌IB5能夠高效降解甲氧咪草煙。
文檔編號C12N1/20GK102250789SQ20111014502
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月31日 優先權日2011年5月31日
發明者劉麗萍, 劉春光, 張爽, 楊峰山, 楊鑫, 黃英澤 申請人:黑龍江大學