鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的製備方法、應用及藥物組合物、製劑和試劑盒的製作方法

2023-06-20 07:48:56

專利名稱：鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的製備方法、應用及藥物組合物、製劑和試劑盒的製作方法
鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的製備方法、應用及藥物組合物、製劑和試劑盒技術領域
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的製備方法、應用及藥物組合物、製劑和試劑盒。
背景技術：
鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)為非發酵革蘭陰性桿菌,是不動桿菌中引起人類感染的主要菌群，主要引起呼吸道感染、菌血症、泌尿系統感染、傷口感染、腦膜炎等，亦可引起腹膜炎、心內膜炎、眼內炎等，最常見的感染部位為肺部，是醫院獲得性肺炎的重要致病原。
隨著臨床抗菌藥物的大量使用，鮑曼不動桿菌的耐藥性也越來越強，已對頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類等常用抗菌藥物出現多重耐藥性，甚至對碳青烯黴類藥物包括亞胺培南或美洛培南在內均出現耐藥性，這給臨床治療帶來極大困難。
卵黃免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin, IgY)是禽類B淋巴細胞在抗原物質刺激下所產生並沉積在卵黃中的能與抗原發生特異性反應的一種免疫球蛋白，是禽類在長期進化過程中形成的用於提高抵抗力的物質。IgY除具有特異性強、價廉易得、性質穩定等優點外，與化學藥物相比無毒副作用，與抗生素相比不易產生耐藥性，因而倍受青睞。美國 FDA已將特異性卵黃抗體視為替代抗生素的首要候選藥物，日本政府投入巨資扶持「禽源抗體產業」。
目前，多種特異性IgY已經在人類和動物疾病的預防和治療方面得到了應用。特異性IgY在人類疾病防治中的應用包括嬰兒輪狀病毒性腹瀉、幽門螺桿菌感染、齲齒等，但在鮑曼不動桿菌感染性疾病防治中的應用目前還未見報導。發明內容
本發明的目的是提供一種鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白(IgY)的製備方法及應用、以及由該IgY製備得到的藥物組合物、製劑和試劑盒。
具體而言，本發明的所述鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的製備方法包括如下步驟
(I)調製抗原液
將鮑曼不動桿菌菌種接種於TSB液體培養基中，37°C培養18_24h後，離心收集菌體，菌體以生理鹽水稀釋至108-101(lCfu/mL，向菌液中加入菌液體積O. 5%的甲醛，37°C滅活 24h，不時搖動，經無菌檢驗合格後分別加入等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，充分乳化後製成全菌滅活疫苗，4°C保存；
(2)免疫母雞
選用140-160日齡的產蛋母雞，於每隻雞胸肌注射2點、頸部皮下注射I點進行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗為加入弗氏完全佐劑的抗原液，加強免疫的疫苗為加入弗氏不完全佐劑的抗原液，三次免疫劑量遞增，分別為每隻雞I. OmLU. 5mL和2. OmL，每次免疫間隔14天，收集首次免疫後1-160天的雞蛋於4°C分類保存；(3)分離、純化卵黃免疫球蛋白取免疫雞蛋，擦洗消毒，去蛋殼，用蛋黃分離器去除蛋白，而後用無菌濾紙進一步吸取蛋白，刺破蛋黃膜收集蛋黃，卵黃液加6-10倍體積的去離子水稀釋，用鹽酸調pH至5. O,攪勻後4°C放置過夜,在4°C下IOOOOrpm離心25min,取上清液,進行鹽析後,鹽析溶液經超濾、冷凍乾燥得凍乾粉。其中，所述鮑曼不動桿菌菌種可以使用市售的鮑曼不動桿菌標準菌，也可以使用醫院分離獲得的多藥耐藥性鮑曼不動桿菌。本發明的所述應用包括上述製備的鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白在製備用於防治鮑曼不動桿菌感染性疾病的藥物中的應用和在製備用於分析診斷鮑曼不動桿菌感染性疾病的藥物中的應用。在上述應用中，所述鮑曼不動桿菌感染性疾病一般是指鮑曼不動桿菌感染性的呼吸道感染、菌血症、泌尿系統感染、傷□感染、腦膜炎、腹膜炎、心內膜炎、眼內炎中的一種或兩種以上，尤其是指鮑曼不動桿菌感染性肺炎或菌血症。本發明還提供一種藥物組合物及其製劑。所述藥物組合物包含上述製備的鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白和藥學上可接受的輔料。所述製劑是由上述藥物組合物製備得到的製劑，為口服製劑、注射製劑或外用製劑，包括片劑、膠囊劑、微囊劑、注射劑、輸液、
軟膏劑等。作為片劑，可根據治療劑量及效價，將適量上述鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白凍乾粉與填充劑(如可壓性澱粉)、崩解劑(如微晶纖維素)、潤滑劑(如微粉矽膠、滑石粉)混合，幹法制粒後壓片或直接壓片，然後根據需要進行包衣。作為膠囊劑，可根據治療劑量及效價，將適量上述鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白凍乾粉與填充劑(如糊精)混合均勻，填入膠囊。作為微囊劑，可根據治療劑量及效價，將適量上述鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的溶液與囊材(如氰基丙烯酸丁酯單體)按照乳化聚合兩步法，以泊洛沙姆188為穩定劑，製成納米囊或微囊，然後進一步製成其它劑型。作為注射劑，可將一定濃度的上述鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的溶液與等滲調節劑(如葡萄糖)、穩定劑(如半胱氨酸)混合，O. I μ m濾過除菌，根據治療劑量及效價分裝。作為軟膏劑，可根據治療劑量及效價，將適量上述鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白與空白軟膏劑基質(如由聚乙二醇4000及聚乙二醇400組成的混合物)及防腐劑(如對羥基苯甲酸乙酯)混合均勻進行製備。此外，本發明製備的鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白還可以試劑盒的形式提供，所述試劑盒中包括上述製備的鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白，還可以包括酶底物和穩定劑、緩衝劑等其他各種添加劑。體內體外實驗表明，本發明製備得到的特異性IgY與鮑曼不動桿菌具有特異結合活性，可以有效抑制鮑曼不動桿菌的生長及其產生的毒性效應，可用於鮑曼不動桿菌感染性疾病及其併發症的防治和診斷分析，具有廣闊的應用前景。


圖I為M組和Q組各步純化後的特異性IgY的電泳圖。圖中的條帶I. M組特異性IgY的超濾組分；2. M組特異性IgY的二次鹽析組分；3. IgY標準品；4. M組特異性IgY的一次鹽析組分；5. M組特異性IgY的水溶性組分；6. Q組特異性IgY的超濾組分；7. Q組特異性IgY的二次鹽析組分；8. Q組特異性IgY的一次鹽析組分；9. Q組特異性IgY的水溶性組分。
圖2表示用M組特異性IgY免疫後不同時間卵黃水溶性組分的抗體效價。
圖3表示用Q組特異性IgY免疫後不同時間卵黃水溶性組分的抗體效價。
圖4表示M組特異性IgY對M菌的生長抑制作用。
圖5表示Q組特異性IgY對M菌的生長抑制作用。
圖6表示M組特異性IgY對Q菌的生長抑制作用。
圖7表示Q組特異性IgY對Q菌的生長抑制作用。
具體實施方式
一、IgY 的製備
下面的實施例1、2中分別採用兩種不同來源的鮑曼不動桿菌作為抗原免疫母雞， 製備兩種鮑曼不動桿菌特異性IgY，分別命名為M組和Q組。
實施例I (M組特異性IgY)
(I)調製抗原液
將鮑曼不動桿菌標準菌(ATCC-BAA1605，購自美國標準生物品收藏中心(American type culture collection),大連辰IE生化試劑公司經銷)(簡稱M菌)接種於TSB液體培養基中，37°C培養20h後，於6000rpm離心15min收集菌體，菌體以生理鹽水稀釋至IO9Cfu/ ml，血球計數板計數。然後向菌液中加入菌液體積O. 5%的甲醛，37°C滅活24h，不時搖動。 經無菌檢驗合格後分別加入等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，充分乳化後製成全菌滅活疫苗，4°C保存。注射前疫苗如發生分層現象，則需充分混勻後使用。
(2)免疫母雞
選用140-160日齡的產蛋母雞(海藍蛋雞，購自大連洪家畜牧有限公司)，於每隻雞胸肌注射2點、頸部皮下注射I點進行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗為加入弗氏完全佐劑的抗原液，加強免疫的疫苗為加入弗氏不完全佐劑的抗原液，三次免疫劑量遞增，分別為每隻雞I. OmLU. 5mL和2. OmL，每次免疫間隔14天，收集首次免疫後1-160天的雞蛋於 4 °C分類保存。
(3)分離、純化卵黃免疫球蛋白
取分類後的免疫雞蛋，擦洗消毒，去蛋殼，用蛋黃分離器去除蛋白，而後用無菌濾紙進一步吸取蛋白，刺破蛋黃膜收集蛋黃。卵黃液加6倍體積的去離子水稀釋，用鹽酸調pH 至5. 0，攪勻後4°C放置過夜，在4°C下IOOOOrpm離心25min，取上清液即水溶性組分(WSF)。 再先後經50%飽和度的硫酸銨溶液、14wt%硫酸鈉溶液鹽析，鹽析溶液經超濾(VivafloW50 超濾系統，截留分子量為100KD)、冷凍乾燥得凍乾粉。
實施例2 (Q組特異性IgY)
將醫院分離獲得的多藥耐藥性鮑曼不動桿菌(簡稱Q菌)按同樣方法進行處理，調製抗原液。其他步驟與實施例I同樣，製備得到卵黃免疫球蛋白凍乾粉。
實施例3 (非特異性IgY)除了將菌液替換為生理鹽水外，按與實施例I同樣的方法，製備得到卵黃免疫球蛋白凍乾粉。二、純度檢測採用SDS-PAGE (緩衝液採用Tris-甘氨酸系統，分離膠濃度為7. 5%，濃縮膠濃度為4%)，在非還原條件下檢測各步純化後的特異性IgY純度(如圖I所示)。從圖I可以看出，經過水稀釋法分離得到卵黃抗體，再經硫酸銨和硫酸鈉兩次鹽析，最後超濾除鹽的純化過程，抗體純度逐步提高，超濾和二次鹽析組分的純度已超過IgY標準品(購自Promega公司)。三、效價檢測採用間接ELISA法測定免疫後不同時間卵黃水溶性組分(WSF)中的抗體效價，具體步驟如下用包被緩衝液(O. 05M碳酸鹽緩衝液，pH9. 6)稀釋抗原菌(Μ菌或Q菌)至濃度為109cfu/mL，包被酶標板(每孔100μ L)，37°C溫育2h，洗滌液(O. 05%Tween20的PBS溶液)洗板三次；封閉液(1%BSA的PBS溶液)封閉(每孔100 μ L)，37°C溫育lh，洗滌液洗板三次；分別加入以稀釋液(O. 1%BSA的PBS溶液)倍比稀釋的特異性IgY或非特異性IgY的WSF(每孔100 μ L)，以未免疫組雞蛋的WSF為陰性對照、以三次免疫的當日血清(取靜脈血，於5000rpm離心IOmin得到的血清)為陽性對照、以稀釋液為空白對照(陰性對照、陽性對照和空白對照分別為每孔100 μ L)，37°C溫育2h，洗滌液洗板三次；加入HRP標記兔抗雞IgG(購自Sigma公司)(每孔100μυ，37 溫育lh，洗滌液洗板三次；加入TMB工作液(購自華美生物工程公司)(每孔100 μ L)，陰暗處反應20min ;加2M H2SO4進行終止(每孔50 μ L)，酶標儀檢測OD值(檢測波長450nm)。OD值為陰性對照值的2. I倍所對應的最大稀釋倍數作為其效價值(M組特異性IgY的結果如圖2所示，Q組特異性IgY的結果如圖3所示)。從圖2可以看出，M組均從首次免疫後的10天效價開始升高，25天效價達到12800，30 55天達到峰值均為25600，高效價(6400以上)可持續至免疫後120天。由圖3可見，Q組也從首次免疫後的10天效價開始升高，25天效價達到12800，4(Γ60天達到峰值均為25600，高效價(6400以上)可持續至免疫後120天。而生理鹽水免疫組IgY (即非特異性IgY)的效價一直為200，說明沒有特異性IgY產生。四、抑菌實驗將特異性IgY凍乾粉(Μ組或Q組)溶於TSB液體培養基中至所需濃度5、10、20mg/mL,此外，將非特異性IgY凍乾粉溶於TSB液體培養基中至10mg/mL (陰性對照1)，將頭孢哌酮舒巴坦鈉溶於TSB液體培養基中至0. 2mg/mL (陽性對照)，另外取TSB液體培養基(陰性對照2)，分別將這些溶液經0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌。將M菌或Q菌分別加入到上述溶液中，使細菌終濃度為107cfu/mL，於37°C、80rpm震蕩速度下孵育，每隔2h取樣100 μ L，以TSB液體培養基為測定的空白對照，採用酶標儀測定吸光值(檢測波長600nm)，結果如圖4-7所示。圖4表示M組特異性IgY對M菌的生長抑制作用，圖5表示Q組特異性IgY對M菌的生長抑制作用。從圖4、5可以看出，M組和Q組的特異性IgY在濃度為5、10和20mg/mL時均能完全抑制M菌的生長，與陽性對照藥物抑菌作用基本相同，而非特異性IgY對M菌的生長沒有抑制作用。
圖6表示M組特異性IgY對Q菌的生長抑制作用，圖7表示Q組特異性IgY對Q 菌的生長抑制作用。從圖6、7可以看出，M組特異性IgY在濃度為5、10和20mg/mL時對Q 菌的生長抑制作用呈劑量依賴性；Q組特異性IgY在濃度為5、10和20mg/mL時對Q菌的生長抑制作用也呈劑量依賴性，在濃度為20mg/mL時能完全抑制Q菌的生長。
五、對小鼠肺炎的作用
取昆明種小鼠50隻(大連醫科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(遼)2008-0002)， 隨機分成5組，每組10隻。4組小鼠經鼻滴入鮑曼不動桿菌(Q菌)(2X10ncfU/mL， 50μ L/10g體重)建立小鼠肺炎模型；1組作為空白對照組，不感染鮑曼不動桿菌。
頭孢哌酮舒巴坦鈉、特異性IgY (M組或Q組)分別用生理鹽水溶解至所需濃度(頭孢哌酮舒巴坦鈉20mg/mL,特異性IgY20mg/mL),用O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌後備用。
各組小鼠分別於感染前24h腹腔注射給藥一次，每IOg體重150 μ L ;並在感染後每隔24h腹腔注射給藥一次，連續五天，每IOg體重250 μ L0各組給予的藥物如表I所示。
觀察各組小鼠的臨床表現、體重、體溫變化、白細胞(WBC)數變化、死亡率、肺組織細菌培養、肺組織外觀及肺病理切片。鮑曼不動桿菌感染後，除空白對照組外，各組小鼠體重、體溫、外周血中WBC數均有不同程度的下降，特異性IgY (Μ組和Q組)治療組的下降明顯低於陰性對照組，與陽性對照組相近；除空白對照組外，其餘各組小鼠肺組織細菌培養均呈陽性， 特異性IgY (Μ組和Q組)治療組和陽性對照組細菌計數低於陰性對照組；除空白對照組外， 其餘各組小鼠肺組織外觀有不同程度的損傷，肺病理切片顯示肺泡結構破壞，肺纖維化，但特異性IgY (Μ組和Q組)治療組和陽性對照組損傷程度低於陰性對照組；各組小鼠四天的死亡率分別為空白對照組為0，陰性對照組為90%，陽性對照組和特異性IgY治療組均為20%。
表I
權利要求
1.一種鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)調製抗原液 將鮑曼不動桿菌菌種接種於TSB液體培養基中，37°C培養18-24h後，離心收集菌體，菌體以生理鹽水稀釋至108-101Qcfu/mL，向菌液中加入菌液體積0. 5%的甲醛，37°C滅活24h，不時搖動，經無菌檢驗合格後分別加入等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，充分乳化後製成全菌滅活疫苗，4°C保存； (2)免疫母雞 選用140-160日齡的產蛋母雞，於每隻雞胸肌注射2點、頸部皮下注射I點進行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗為加入弗氏完全佐劑的抗原液，加強免疫的疫苗為加入弗氏不完全佐劑的抗原液，三次免疫劑量遞增，分別為每隻雞I. OmLU. 5mL和2. OmL，每次免疫間隔14天，收集首次免疫後1-160天的雞蛋於4°C分類保存； (3)分離、純化卵黃免疫球蛋白 取免疫雞蛋，擦洗消毒，去蛋殼，用蛋黃分離器去除蛋白，而後用無菌濾紙進一步吸取蛋白，刺破蛋黃膜收集蛋黃，卵黃液加6-10倍體積的去離子水稀釋，用鹽酸調pH至5. 0，攪勻後4°C放置過夜,在4°C下IOOOOrpm離心25min,取上清液,進行鹽析後,鹽析溶液經超濾、冷凍乾燥得凍乾粉。
2.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，所述鮑曼不動桿菌菌種為市售的鮑曼不動桿菌標準菌。
3.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，所述鮑曼不動桿菌菌種為醫院分離獲得的多藥耐藥性鮑曼不動桿菌。
4.權利要求1-3中任意一項製備的鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白在製備用於防治或分析診斷鮑曼不動桿菌感染性疾病的藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述鮑曼不動桿菌感染性疾病為鮑曼不動桿菌感染性的呼吸道感染、菌血症、泌尿系統感染、傷口感染、腦膜炎、腹膜炎、心內膜炎、眼內炎中的一種或兩種以上。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述鮑曼不動桿菌感染性疾病為鮑曼不動桿菌感染性肺炎或菌血症。
7.—種藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物包含權利要求1-3中任意一項製備的鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白和藥學上可接受的輔料。
8.一種由權利要求7所述的藥物組合物製備得到的製劑，其特徵在於，所述製劑為口服製劑、注射製劑或外用製劑。
9.一種試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括權利要求1-3中任意一項製備的鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白。
全文摘要
本發明提供了一種鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的製備方法、應用及藥物組合物、製劑和試劑盒。本發明的鮑曼不動桿菌特異性卵黃免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)調製抗原液、(2)免疫母雞、(3)分離、純化卵黃免疫球蛋白。體內體外實驗表明，本發明製備得到的特異性IgY與鮑曼不動桿菌具有特異結合活性，可以有效抑制鮑曼不動桿菌的生長及其產生的毒性效應，可用於鮑曼不動桿菌感染性疾病及其併發症的防治和診斷分析，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61P31/04GK102977208SQ201210536408
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者甄宇紅, 龍亞一, 侯源源, 孫麗丹, 廖瀚, 豐雪, 舒曉宏, 孫永, 韓文琦, 趙亞麗 申請人:大連醫科大學