一種新的脫氨基神經氨酸酶及其製備方法

2023-06-20 12:25:46 4

專利名稱：一種新的脫氨基神經氨酸酶及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種新的脫氨基神經氨酸酶(deaminoneuraminidase)。本發明特別涉及一種無唾液酸酶(sialidase)活性的脫氨基神經氨酸酶。
背景技術：
脫氨基神經氨酸(deaminoneuraminic acid)(3-脫氧-D-甘油-D-半乳糖-nonulosonic acid或者2-酮-3-脫氧-D-甘油-D-半乳糖-nononic acid，下文中稱做「KDN」)具有與唾液酸(sialic acid)相似的結構，僅在唾液酸5位碳上所連接的N-醯基被羥基取代。因此，迄今已發現KDN廣泛地存在於生物界，是複合多糖的一種組份，並具有多種多樣的存在形式，這點與唾液酸一致。另一方面，KDN具有與唾液酸不同的特性，例如，現已闡明含有KDN的複合多糖在受精過程中卵子和精子的相互作用中起著重要的作用。人們對於含有KDN的糖蛋白和糖脂結構和功能的解析產生了極大的興趣。
另外，那些已知的可裂解含KDN複合多糖中KDN酮苷鍵(ketosidiclinkage)的酶(脫氨基神經氨酸酶，deaminoneuraminidase，如果需要的話在下文中稱為KDNase)，其中包括存在於泥鰍肝臟中的KDN-唾液酸酶(Li，Y.-T.etal.Archives of Biochemistry and Biophysics Vol.310，No.1，pp.243-246(1994))。而本發明者曾經發現一種存在於某類組織中如虹鱒魚卵巢中、同時具有唾液酸酶活性和脫氨基神經氨酸酶活性的酶(Angata，T.et al.，Glycobiology，Vol.4，pp.517-523(1994))。
然而，上述的任何一種酶並非特異地裂解KDN酮苷鍵。其中一些酶所具有的唾液酸酶活性與裂解KDN酮苷鍵的活性大小几乎相同(例如前述的來自泥鰍中的酶)，而且其它一些酶具有的唾液酸酶活性強於裂解KDN酮苷鍵的活性(例如前述的來自虹鱒魚中的酶)。沒有發現特異性作用於KDN的酶已知來自泥鰍酶的最適pH值約為4.5。而本發明者所發現的來自虹鱒魚酶的最適pH值約為4.4。
已知，在pH6附近，來自泥鰍的酶的脫氨基神經氨酸酶活性值為最適pH時脫氨基神經氨酸酶活性的65％。另外，本發明者發現的來自虹鱒魚的酶在pH6.5附近無脫氨基神經氨酸酶的活性。因此，在中性pH條件下，很難獲得脫氨基神經氨酸酶的反應。另外，上述的任何一種脫氨基神經氨酸酶均來自動物，所有已知的脫氨基神經氨酸酶無一來自微生物。因此，可獲得的酶數量是有限的。
本發明說明人們希望有一種脫氨基神經氨酸酶，如果有的話，具有高的活性，並且在中性pH範圍內具有活性，這對於分析諸如脫氨基神經氨酸的結構和功能非常有用。如果能得到某種高活性的脫氨基神經氨酸酶，就有希望通過該酶實現催化KDN酮苷鍵水解作用的逆反應，從而生成諸如新的、含有脫氨基神經氨酸的複合多糖或者糖類。
本發明已將上述的觀點考慮在內，即目的是提供一種KDNase，該酶對於KDN的酮苷鍵具有很強的特異性，並且甚至在中性pH範圍內具有高的KDNase活性，對任何一種N-醯基神經氨酸殘基均無作用，而非迄今已知的、具有一定KDNase活性的唾液酸酶。
為了實現上述的目的，本發明者努力地篩選出生產KDNase的微生物物種。作為結果，本發明者已發現一種屬於Sphingobacterium類(神經鞘菌類)的細菌種屬可產生一種KDNase。本發明者進一步發現該KDNase在中性pH範圍內具有高的活性，並且不存在唾液酸酶活性。因此實現了本發明的目標。
在此，本發明的脫氨基神經氨酸酶具有以下的酶學特徵(1)作用該脫氨基神經氨酸酶作用於含有脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類，它水解由脫氨基神經氨酸形成的酮苷鍵，以生成游離的脫氨基神經氨酸和完全不含有脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類，以及部分失去脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類。
(2)底物的特異性該脫氨基神經氨酸酶作用於含有脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類，但不作用於含有N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸(N-acetylneuraminic acid or N-glycolylneuraminic acid)的複合多糖或糖類中的由N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸形成的酮苷鍵。
在本發明具體的實施方案中，本發明的脫氨基神經氨酸酶還具有以下的理化性質(I)最適反應pH值該脫氨基神經氨酸酶的最適反應pH值在pH6左右；(II)穩定的pH範圍在25℃下，該脫氨基神經氨酸酶pH4至9的範圍內穩定；(III)最適反應溫度該脫氨基神經氨酸酶的最適反應溫度在25℃左右；(IV)熱穩定性在25℃下，該脫氨基神經氨酸酶至少在48小時內不會失活；(V)活性抑制和穩定化該酶可被游離的脫氨基神經氨酸抑制，而該酶在存在有小牛血清白蛋白時可被穩定。
在優選的實施方案中，由Sphingobacterium mOL12-4s產生的本發明脫氨基神經氨酸酶具有上述的性質。
另外，本發明提供了一種生產脫氨基神經氨酸酶的方法，包括培養屬於Sphingobacterium類的並具有脫氨基神經氨酸酶生產能力的細菌，以及從所獲得的培養物中收集具有上述性質脫氨基神經氨酸酶的步驟。還有，本發明提供具有脫氨基神經氨酸酶生產能力的SphingobacteriummOL12-4s菌。
還有，本發明提供了一種方法，用於生產含有脫氨基神經氨酸的糖類和/或複合多糖，包括使得具有上述性質的脫氨基神經氨酸酶與脫氨基神經氨酸、糖和/或複合多糖共存的步驟。
如果需要的話，本發明的KDNase偶爾被稱為「本發明的酶」。術語「含有KDN的複合多糖或糖」(「complex carbohydrate orcarbohydrate containing KDN」)指的是KDN經酮苷鍵與諸如糖蛋白和糖脂的複合多糖，或者與單糖、寡糖或聚糖的糖類連接。術語「含有唾液酸的複合多糖或糖(包括N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸)」指的是唾液酸通過酮苷鍵與複合多糖或糖類連接。術語「唾液酸酶的活性」在此所指的是降解含有唾液酸的複合多糖或糖中、由唾液酸形成的酮苷鍵的活性，而該活性不包括已知的唾液酸酶所具有的KDNase活性。
下面，將對本發明加以詳細的說明。1本發明的KDNase(1)製備本發明酶的方法本發明的脫氨基神經氨酸酶是一種新的、具有上述性質的酶。本發明的脫氨基神經氨酸酶可通過，例如，培養屬於Sphingobactcrium類的細菌而加以製備，並從所獲得的細菌培養物中可收集該酶。該細菌屬於Sphingobacterium類，例如Sphingobacterium multivorum，其中特別的例子是本發明中分離出的Sphingobacterium mOL12-4s菌。
特別是，可通過下面所述的方法收集所需純度的酶樣品。即，一種生產本發明脫氨基神經氨酸酶的微生物被接種於合適的培養基內，進行培養。經過培養後的微生物細胞(或者是液體培養物的培養液)可通過諸如離心的方法從培養物中加以收集。然後可通過諸如超聲處理的方法裂解微生物細胞，以獲得細胞溶液。還可以通過諸如滲透休克(osmoticshock)的方法從微生物細胞中獲得所需的成份，具有酶活性的成份釋放到微生物細胞外。之後，細胞裂解液或是滲透休克處理法所得的成份被當做初料，並以KDNase活性作為指標，用於普通方法分離酶。
將可生產本發明脫氨基神經氨酸酶的微生物，使用有氧培氧的方法，例如振搖培養，通氧和搖動培養，在適合該微生物生長的溫度下，培養幾個小時或幾天，所用的培養基包括，例如，碳源(包括諸如含有KDN的寡糖和葡萄糖)，它們可被微生物吸收，氮源(包括諸如酵母提取物、蛋白腖、肉汁提取物、穀物浸出物、豆粉和酪蛋白水解物(casaminoacids)；以及無機氮源，(如氯化銨、硫酸銨、尿素和硝酸銨)，和無機鹽類(例如，包括硫酸鹽、磷酸鹽和鈣、鎂、鉀和鈉的鹽酸鹽)。
在培養基中加入KDN或含有KDN酮苷鍵的物質，如含KDN的寡糖醇後(如果需要的話，下文中稱為「KDN寡糖醇」)，KDNase被誘導，每個單位數量的微生物細胞內酶的活性得以增加。因此，可以通過能夠產生該酶的微生物有效地生產本發明的酶。當培養基中加入的是含KDN酮苷鍵的物質如寡糖醇時，與加入KDN相比將可獲得更明顯的酶誘導作用。加入培養基的含KDN酮苷鍵的物質如寡糖醇沒有必要一定是純品，例如，同樣允許使用經初步純化製得的上述物質。
從培養物中收集的微生物細胞可通過如超聲處理的方法加以裂解，或者通過適當的方法如滲透休克的方法製備含有釋放酶的組份，從中可通過已知的純化酶的方法而需得所需純度酶的樣品，其中包括如使用鹽析法，如使用硫酸銨((NH4)2SO4)或硫酸鈉；透析法；超濾法；吸附色譜法；陰離子交換色譜法；陽離子交換色譜法；疏水色譜法；凝膠過濾法和電泳法；以及使用，如連接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的瓊脂糖的親合層析法。
可通過將本發明的KDNase作用於如含有KDN的複合多糖或糖，通過水解由KDN形成的酮苷鍵、並定量測定釋放的KDN，從而測定該酶的活性。下面的方法是特別的例子，即將本發明的脫氨基神經氨酸酶作用於4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)，以測定經酶催化水解酮苷鍵所釋放的4-甲基饊形酮的螢光。
另外，KDNase的活性也可使用含有KDN糖蛋白的底物加以測定，該糖蛋白來自虹鱒魚的卵巢液，加入本發明的脫氨基神經氨酸酶進行反應，再加入cetylpyridinium chloride(CPC)以獲得反應液，經離心後獲得上清，並以硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid)的方法定量測定上清液中KDN的含量(Analytical Biochemistrv，Vol.205，pp.244-250(1992))。在CPC存在下，含有KDN的糖蛋白形成複合物，可被沉澱，而經酶作用釋放的KDN不會被沉澱。因此，未反應的含KDN的糖蛋白可通過離心的方法從反應體系中除去。上述的方法將在後面的實施例中加以專門的說明。(2)本發明脫氨基神經氨酸酶的理化性質用KDNase代表的本發明脫氨基神經氨酸酶由SphingobacteriummOLl2-4s菌產生，並具有以下的理化性質。1)作用本發明的脫氨基神經氨酸酶作用於含有KDN的複合多糖或糖，水解連接KDN與複合多糖或糖之間的酮苷鍵，生成游離的KDN和無KDN的複合多糖或糖，或者部分失去KDN的複合多糖或糖。已證明，本發明的脫氨基神經氨酸酶亦作用於KDN與其它非複合多糖或糖的化合物間的酮苷鍵，例如4-methylumbelliferyl KDN的酮苷鍵。
做為本發明脫氨基神經氨酸酶作用於KDN和乳糖混合液的結果之一，發現反應液中存在有含KDN的寡糖鏈。因此，這表明本發明的脫氨基神經氨酸酶同樣催化上述水解反應的逆反應。使用這一逆反應，可通過將本發明的脫氨基神經氨酸酶、KDN和糖和/或多糖及其類似物的共同混合而有可能生成含有KDN的糖和/或多糖及其類似物。2)底物特異性本發明的脫氨基神經氨酸酶作用於和裂解由脫氨基神經氨酸(KDN)形成的酮苷鍵，但對N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸形成的酮苷鍵無作用。
本發明的脫氨基神經氨酸酶裂解存在於下列含有KDN的複合多糖或糖及其類似物中的所有KDN殘基。該酶作用於自然界中已知的任何一種含KDN的殘基，即α2→3，α2→6和α2→8酮苷鍵(a)含KDN的糖蛋白與大量糖鏈連接的粘蛋白(mucin)樣糖蛋白，糖鏈上含有3種類型的KDN鍵(KDNα2→3Gal，KDNα2→8KDN和KDNα2→6Gal NAc)；(b)通過將含KDN的糖蛋白與alkaliborohydride處理後獲得的KDN寡糖醇通式為(→8KDNα2→)n→8KDNα2→6[KDNα2→3Galβ1→3GalNAcα1→3]GalNAc-01，其中n為2至9，平均數為5；(c)KDN二聚體，KDNα2→8KDN；(d)通過α2→3Gal連接的具有兩個KDN殘基的N-類型糖鏈KDNα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→6[KDNα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→3]Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc；(e)含有KDN的神經鞘糖脂(sphingoglycolipid)，含有KDN的神經節苷脂(ganglioside)GM3KDNα2→3Galβ1→4Glcβ1→Cer；以及(f)4-methylumbelliferyl KDN。
另一方面，本發明的脫氨基神經氨酸酶不催化水解在已知的含唾液酸(N-乙醯神經氨酸和N-乙二醇醯神經氨酸)的複合多糖或糖中由唾液酸形成的酮苷鍵(見後面的實施例2)。因此，本發明的脫氨基神經氨酸酶對脫氨基神經氨酸形成的酮苷鍵具有極高的特異性。3)最適反應pH值在pH6附近，本發明的脫氨基神經氨酸酶具有最高的反應活性。
如後面的實施例2所述，將sphingobacteriummOL2-4s菌的細胞裂解液上清通過50-70％硫酸銨的沉澱作用所得到的初始組份，通過使用Sepharcyls-200(Pharmacia產品)色譜柱純化兩次，再經過接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的瓊脂糖凝膠色譜柱(Affi-gel 15，Bio Rad產品)可獲得本發明脫氨基神經氨酸酶經親合純化的酶組份。圖8顯示了親合純化所得酶組份的酶活性與pH值之間的關係。如後面實施例2所述，經純化所得酶樣品在SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳上呈現出單一的條帶(如果需要的話，在後面稱該酶為「單一純化的酶」)，而該酶是將Sphingobacterium mOL2-4s菌的細胞裂解液上清經過90％硫酸銨沉澱作用所得到的初始組份，通過連續使用CM-Toyopearl 650M(Toyo Soda產品)、DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda產品)和CM-Toyopearl650M(Toyo Soda產品)色譜柱而純化所得。圖9顯示了使用單一純化酶的酶活性與pH值之間的關係。4)最適反應溫度對於本發明的脫氨基神經氨酸酶，在25℃至30℃之間可獲得高的酶反應活性。5)穩定性在25℃、pH4至9下放置數小時後，本發明的脫氨基神經氨酸酶具有相當的穩定性。在25℃下，本發明的酶至少保持48小時不失活。然而，無論pH或離子強度如何，本發明的酶在數十個μg/ml或稍低的濃度下是不穩的，但是，在存在其它蛋白如牛血清白蛋白時，可使本發明的脫氨基神經氨酸酶穩定。6)酶活性的抑制和活化本發明的脫氨基神經氨酸酶的活性不受1mM鈣離子(Ca2+)、鎂離子(Mg2+)、錳離子(Mn2+)和EDTA(乙二胺四乙酸鈉，Sodiumethylenediaminetetraacetic acid)的影響。
當離子強度增加時，本發明的脫氨基神經氨酸酶的活性迅速增加。例如存在300mM NaCl時，酶的活性具有最高值，而在低離子強度50mM或更低時NaCl時，酶的活性極低。
本發明的脫氨基神經氨酸酶的活性可被游離的KDN抑制(在3mMKDN濃度下)。與此相反，本發明的KDNase酶活性不被游離的唾液酸抑制，而唾液酸是脫氨基神經氨酸(KDN)的結構類似物，亦不被含有N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸的複合多糖或糖抑制，它們不能成為該脫氨基神經氨酸酶的底物。本發明的脫氨基神經氨酸酶不被2，3-二羥基-2-脫氧-N-乙醯神經氨酸所抑制，而該化合物是已知的、裂解N-醯基神經氨酸所形成酮苷鍵的唾液酸酶的特異性抑制劑。
表面活性劑Triton X-100不抑制本發明脫氨基神經氨酸酶的活性。該酶在0.5％膽酸鈉(Sodiumcholate)時活性完全消失，而在0.1％膽酸鈉時，90％的酶活性得以保持。因此，當使用該酶作用於含KDN的糖脂如含KDN的ganglioside時，可以加入Triton X-100。7)分子量如後面的實施例2所述，對於親合純化所得的酶組份，本發明脫氨基神經氨酸酶經凝膠過濾法測定的分子量約為50,000(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；用20mM Tris-Hcl緩衝液(pH8.0)/0.5M NaCl洗脫)，或者經SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳測定約為57,000；而該親合純化的酶組份是將Sphingobacterium mOL2-4s菌的細胞裂解液上清通過50-70％硫酸銨的沉澱作用所得到的初始組份，通過使用Sephacryl S-200(Pharmacia產品)色譜柱純化兩次，再經過接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的瓊脂糖凝膠色譜柱(Affi-gel15，Bio Rad產品)而獲得的。
如後面的實施例2所述，對於單一純化的酶，本發明脫氨基神經氨酸酶經凝膠過濾法測得的分子量約為40,000(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；使用20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)/0.2M NaCl)，或經SDS聚丙烯醯胺法測得的分子量約為42,000；而該單一純化的酶是按照Nossal和Heppel的滲透休克法(J.Biol.Chem.，Vol.241，pp.3055至3062(1966)，而且把原方法的經過1mM Mg(CH3COO)2處理10分鐘後通過離心獲得上清的操作作了修改，改成經過1mM Mg(CH3COO)2處理10分鐘後，加入2倍體積的1M NaCl-1M Tris-HCl(pH7.1)，再離心以獲得上清)，將Sphingobacterium mOLl2-4s菌的微生物細胞滲出外周質(periplasm，peripheral cytoplasm)製備液經過90％硫酸銨沉澱作用所得到初始組份，通過連續使用CM-Toyopearl 650M(ToyoSoda產品)、DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda產品)和CM-Toyopearl 650M(Toyo Soda產品)色譜柱而純化所得。8)(酶反應動力學的)Michaelis常數以4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)做為底物，本發明脫氨基神經氨酸酶的Michaelis常數(Km)和最大酶反應速度(Vm)如下。
Km19μMVmax0.19μM/min或7.4mM/min/mg蛋白9)胺基酸組成本發明的脫氨基神經氨酸酶具有以下的胺基酸組成。數字以摩爾百分率(％)表示。
天門冬醯胺和天門冬氨酸 5.3穀氨醯胺和穀氨酸 5.5絲氨酸 13.6甘氨酸 19.8組氨酸 2.0精氨酸 2.0蘇氨酸 6.7丙氨酸 9.0脯氨酸 3.5酪氨酸 5.6纈氨酸 5.9甲硫氨酸 7.6異亮氨酸 3.5亮氨酸 4.9苯丙氨酸 3.2賴氨酸 2.02本發明的Sphingobacterium mOL12-4s菌本發明的微生物，即Sphingobacterium mOL12-4s菌，最初取自魚塘的淤泥，經過包括含脫氨基神經氨酸(KDN)的寡糖醇做為唯一碳源的豐富培養基的培養而獲得，並經過篩選，該細菌的細胞裂解液具有水解4-MU-KDN的活性。本發明微生物的特徵在於能夠產生上述的、無唾液酸酶活性的KDNase。
使用與上述內容相似的方法，將最初取自魚塘或類似地點的土壤或淤泥，經過包括含KDN複合多糖或糖及其類似物做為唯一碳源的濃縮培養基的培養，亦可獲得本發明的微生物，並經過是否具有KDNase活性作為指標篩選。值得注意的是，按本發明所分離到的SphingobacteriummOL12-4s菌已於1994年5月24存入國際貿易和工業部(Ministryof International Trade and Industry)中工業科學和技術機構(Agency ofIndustrial Science and Technology)的生命科學和人類技術國立研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology)，貯藏編號為FERMP-14325，並於1995年5月26日依照布達佩斯條約(BudapestTreaty)轉入國際貯存庫，其貯存編號為FERM BP-5116。
在下面的實施例1中，將對本發明微生物所具有的微生物學性質加以說明。按照該菌的性質，經過鑑定，本發明的微生物可能是屬於Sphingobacterium種屬細菌的一種，並且極可能是Sphingobacteriummultivorum菌。
附圖簡述

圖1顯示不同培養時間下對一定數量微生物細胞(1010個)中KDNase活性的測定結果，該數據來自對Sphingobacterium mOL12-4s菌在加有0.1％粗提的KDN-OS(虹鱒魚的製備組份，富含KDN寡糖醇(KDNα2→3Galβ1→3GalNAcα1→3[KDNα2→(8KDNα2→)n→6]Ga1Nacol；其中n＝5))培養基中的培養物。
圖2顯示本發明酶純化過程中使用第一級Sephacryl S-200凝膠過濾色譜的洗脫圖。實線代表酶的活性，虛線為表示蛋白含量的紫外吸收(A280)。
圖3顯示本發明酶純化過程中使用第二級Sephacryl S-200凝膠過濾色譜的洗脫圖。實線代表酶的活性，虛線為表示蛋白含量的紫外吸收(A280)。
圖4顯示本發明酶純化過程中使用第一級KDN-gp連接瓊脂糖的親合色譜的洗脫圖。實線代表酶的活性，虛線為表示蛋白含量的紫外吸收(A230)。
圖5顯示本發明酶純化過程中使用第二級KDN-gp連接瓊脂糖的親合色譜的洗脫圖。實線代表酶的活性，虛線為表示蛋白含量的紫外吸收(A220)。
圖6顯示本發明酶純化過程中使用第二級CM-Toyoperal 650M柱色譜的洗脫圖(單一純化的酶組份)。實線代表酶的活性，虛線代表洗脫時NaCl的濃度。
圖7顯示親合純化酶組份的10％丙烯醯胺電泳的結果。經銀染後，使用光密度儀分析每個條帶的位置和染色強度(測定600nm的吸收)。
圖8顯示了pH-酶活性曲線，提示本發明酶經親合純化酶組份的最適pH值。
圖9顯示了pH-酶活性曲線，提示本發明酶的單一純化酶樣品的最適pH值。
圖10顯示了離子強度-酶活性曲線，提示本發明酶的最適離子強度。離子強度用加入的NaCl濃度表示。
實施本發明的最佳方案在下面做為參照的實施方案中，將對本發明做更明確的解釋。然而，實施方案只是對本發明的說明，並非對本發明的限制。在實施方案中，可按照下列的方法測定KDNase的活性。測定酶活性的方法(1)基於使用4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN法)的方法當按照下列反應式對4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)的酮苷鍵進行酶催化水解時，具有螢光的4-methylumbelliferone被釋放出來，因此可以測到螢光。
4-methylumbelliferyl KDN→KDN-4-甲基繖形酮特別是，將該酶溶解在20μl的0.1M Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)/0.1M NaCl，並把1.4nmol的4-MU-KDN加入該酶溶液中，並在25℃下進行反應30分鐘。反應後，將1份體積的反應液(20μl)與2.5ml的85mM甘氨酸-碳酸鹽緩衝液(pH9.3)混合，以測定螢光強度(激發波長365nm，測定波長450nm)。為測定螢光強度，請參照Biochemistry，Vol.18，No.13，pp.2783-2787。將按照上述方法、但不加酶進行反應後所測得的螢光強度作為對照。將25℃下，每分鐘水解1nmol4-MU-KDN的酶量定義為1個單位。
按照下述的Dr.Thomas G.Wamer建立的方法，製備本方法中所使用的4-MU-KDN。本法所用的4-MU-KDN由Dr.Thomas G.Warner惠贈。
KDN是按照已知的方法[Auge，C.etal.，Tetrahedron，46，201-214(1990)]，使用Neu 5Ac醛縮酶(aldolase)將D-甘露糖和丙酮酸催化合成而來。將KDN乾燥，然後混懸於10ml的乙酸酐和10ml的吡啶中，並繼續在室溫下反應過夜。反應液用冰冷卻。加入甲醇終止反應，並去除溶劑。殘餘物溶於甲醇，上Dowex 50(H+)柱(4×5cm)，用甲醇洗脫。除去溶劑後，往洗脫物中加入過量的溶於乙醚的重氮甲烷(diazomethane)以生成甲酯。完全乙醯化的甲酯，上矽酸柱(2.5×17cm)，並用溶於己烷的乙酸乙酯梯度洗脫，並獲得甲基-2，4，5，7，8，9-六-O-乙醯基KDN(甲基-2，4，5，7，8，9-六-O-乙醯基KDN，K1)。然後，將K1轉入glycosyl Chloride，按照已知的方法[Wamer etal.，Biochemistry，18，2783-2787(1979)]，與4-methylumbelliferone鈉鹽(4MU)反應，這樣K1和4-MU聚合形成4-甲基-2-氧代-2H-1-苯並吡喃-7-基4，5，7，8，9-五-O-乙醯KDN(K2)。
將K2(0.5g)加入4ml的甲醇，然後是4ml的0.5N NaOH，K2在其中混懸，並在37℃下維持1小時。再加入4ml的NaOH，並繼續在37℃維持90分鐘。然後，加入Dowex 50(H+)樹脂將pH值中和至pH6.0。將樹脂通過過濾而去除，並去除溶劑。往殘餘物中加入少量的氨水(10mM)使pH到9，接著用Sephadex G-25凝膠濾過法，將4-MU-KDN純化至很高純度。
另外，4-MU-KDN也可按照Schreiner，E.和Zbiral，E.(1990)Liebigs Ann.chem.，581-586.所述的方法獲得。(2)氯化十六烷基吡啶鎓，CPC法將虹鱒魚卵巢液中取得的含KDN糖蛋白作為底物。按照與上述方法(1)相同的條件，進行酶的反應。然後，往反應液中加入2ml的0.1％cetylpyridinium chlorde(CPC)。在CPC存在條件下，含KDN的糖蛋白會形成複合物進而沉澱。然而，經酶反應所釋放的KDN不會沉澱。該反應液放置30分鐘，然後離心(3,000rpm，10分鐘)以獲得上清。按照硫代巴比妥酸的方法，通過定量測定所得上清中KDN的含量而確定脫氨基神經氨酸酶的活性(Analytical Biochemistry，Vol。205，pp.244-250(1992))。將25℃下，每分鐘水解1nmol的含KDN糖蛋白的酶量定義為1個單位。
實施例一Sphingobacterium mOL12-4s的獲取將從魚塘中獲得的淤泥接種於M9液體培養基中(在1升體積中含有6.0克的Na2HPO4，3.0克KH2PO4，1.0克的NH4Cl，0.5克的NaCl，1mM MgSO4和0.1mM CaCl2)，加入0.05％KDN寡糖醇(按照J.Biol.Chem.，265，21811-21819(1990)所述的方法製備)，在25℃下培養48小時，將所獲得的培養液劃線接種於含KDN寡糖醇的Mg瓊脂培養平皿上，並於25℃下培養48小時。由此獲得了可在KDN寡糖醇作為唯一碳源的培養條件下生長的66個微生物克隆。
將所形成克隆中相應的微生物分別接種於含有0.05％KDN寡糖醇的M9液體培養基中進行培養，並通過離心的方法收集微生物細胞。通過超聲處理的方法裂解收穫的微生物細胞。按照4-MU-KDN的方法測定KDNase的活性和唾液酸酶的活性。其中，對於那些具有KDNase活性而無唾液酸酶活性的細胞裂解液，其來源的微生物克隆被稱為mOL12菌株，並用於下面的篩選。
將mOL 12菌株的克隆劃線接種於含0.05％KDN寡糖醇的M9瓊脂培養基中，從中分離出4個菌株的克隆，並將它們分別命名為mOL12-1、mOL12-2、mOL12-3和mOL12-4。將克隆分別劃線接種於LB平皿培養基中以獲得單一的克隆，並將單個克隆接種於含0.05％KDN的寡糖醇液體培養基中進行培養。從中製備細胞裂解液，並按照4-MU-KDN法和氯化十六烷基吡啶鎓法分別測定KDNase的活性和唾液酸酶的活性。劃線接種在LB平皿培養基上而形成的mOL12-4菌株克隆按其大小可分為三種類型，即「大型的」、「中型的」和「小型的」。其中，在所形成的「大型的」克隆和「中型的」克隆菌株中未發現KDNase的活性。然而，在「小型的」克隆菌株中存在有KDNase活性而且無唾液酸酶活性。從只存在KDNase活性菌株挑選出一種菌株，並將其命名為mOL12-4s。
使用商購的試劑盒(Biomeleu生產，API 20NE)對上述分離的mOL12-4s菌株進行鑑定，該試劑盒用於確定腸道桿菌之外的革蘭氏陰性杆狀菌。測定所得的主要微生物特性如下形狀 杆狀革蘭氏染色 陰性芽胞形成 -活動性 -對氧氣喜好 需氧菌吲哚產生 -葡萄糖發酵 -尿素降解 +七葉苷降解(esculin degradation)+同化作用葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-甘露糖+D-甘露糖-麥芽糖 +過氧化氫酶 +過氧化物酶 +β-半乳糖苷酶 +按照上述的結果，mOL12-4s菌株被鑑定為屬於Sphingobacterium菌屬的一種細菌，並稱其為Sphingobacterium mOL12-4s菌株。這一菌株已於1994年5月24日存入國際貿易和工業部中工業科學和技術機構的生命科學和人類技術國立研究所，儲存號為FERMP-14325，並於1995年5月26日依照布達佩斯條約(Budapest Treaty)轉入國際儲存庫，編號為FERMBP-5116。根據其微生物性質，該菌株極可能是Sphingobacterium multivorum。
實施例2KDNase的製備配製800ml含有Miller′s Luria肉汁(LB，Bibco BRL生產)的液體培養基，倒入2升的Erlenmeyer瓶，並高壓滅菌。將SphingobacteriummOL12-4s菌株接種於該培養基中，並在25℃下振搖培養48小時。1KDNase的提取和硫酸銨分離(1)通過對微生物細胞裂解而提取KDNase和硫酸銨的分離培養結束後，通過離心法(15,000xg，40分鐘)，從培養液中收集細胞細胞，收穫的細胞懸浮於冰冷的、含0.1M NaCl的0.1M Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中，並再次通過離心清洗細胞。這一清洗操作重複三次。之後，將細胞細胞懸浮於1/2細胞體積的、0.1M NaCl-20mMTris-HCl緩衝液(pH8.0)中。通過超聲處理(50瓦，5分鐘)的方法裂解細菌細胞。
冷卻條件下，將細胞裂解液離心(17,000xg，40分鐘)以獲取上清。上清中加入硫酸銨至50％飽和度，然後於4℃放置1小時。將溶液於150,000xg離心1小時以去除沉澱。獲得的上清中加入硫酸銨至70％的飽和度，然後於4℃放置過夜。溶液再次於150,000xg離心1小時以獲得沉澱，將沉澱溶於10ml的0.5M NaCl-20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中，往溶液中加入硫酸銨的飽和水溶液至43％的飽和度，然後於4℃放置1小時。將溶液於150,000xg離心1小時經獲得上清，並在上清液中加入硫酸銨至85％飽和度，然後於4℃放置過夜。通過150,000xg離心1小時的方法將生成的沉澱回收，並將收得的沉澱溶於10.9ml的0.5M NaCl-20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中。所收穫的這一組份稱為50-70％硫酸銨的沉澱組份。(2)滲透休克法提取KDNase的硫酸鹽析分離從細菌細胞中提取KDNase的另外一種方法是，通過對細菌細胞應用滲透休克，使酶釋放至細胞外。所獲得的細胞外溶液被用於硫酸銨鹽析分離，經純化KDNase。
按照上述相同方法培養的Sphingobacterium mOL12-4s菌株，通過離心(15,000xg，40分鐘)的方法收集和清洗細菌細胞。按照已知的方法[Nossal，N.G.and Heppel，L.A.(1996)J.Biol.Chem.241，3055-3062]對細菌細胞進行滲透休克處理，使酶釋放至細胞外。即，以1克細菌細胞加至40ml體積的方法，將細菌細胞懸浮於含有20％蔗糖的20mMTris-HCl緩衝液(pH7.1)中，然後放置10分鐘。之後，通過離心(13,000xg，30分鐘)的方法將細胞沉澱。通過將細胞懸浮含有1mM氯化鎂的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.1)中，對細菌細胞進行滲透休克，並放置10分鐘。
將細菌細胞的懸浮液重新離心(13,000xg，30分鐘)以去除細胞。獲得的上清液迅速加入硫酸銨至90％的飽和度，然後於4℃放置過夜。經離心(15,000xg，30分鐘)收集生成的沉澱，將沉澱溶於50％飽和度的硫酸銨溶液，並用離心(15,000xg，30分鐘)的方法將不溶的懸浮物質去除。所獲的上清液中加入硫酸銨至70％飽和度，然後於4℃放置過夜。通過對溶液再次離心(15,000xg，30分鐘)以獲得沉澱組份，並以50-70％的硫酸銨沉澱組份加以收集。(3)Sphingobacterium mOL12-4s菌株中KDNase的誘導(3-1)誘導劑的製備按照已知的方法(Kitajima，K.et al.，J.Biol.Chem.，269，21415-21419(1994))製備KDN和KDN寡糖醇(用KDN α 2→3Gal β1→3GalNAc α 1→3[KDN α 2→(8KDN α 2→)n→6]GalNacol，其中n＝5，如果需要後面將其稱作「KDN-OS」)。可如下製備富含KDN-OS的組份(如果需要後面將其稱作「粗製KDN-OS」)。將虹鱒魚卵巢液(12.3升)濃縮和凍幹，獲得110克的乾粉。取凍乾粉(50克)，用1.0升的氯仿/甲醇(2∶1，v/v)在室溫下萃取2小時(見Yu，s.etal.，Biochemistry，32，9221-9229(1993))。將去除脂肪後的殘餘物空氣中晾，稱重量為39克。將去脂的卵巢液粉末(10克)懸浮於100ml的1M NaBH4/0.1M NaOH中，並在37℃下攪拌溫育。溫育24小時後，加入50ml的同樣溶液(1M NaOH4/0.1M NaOH)，然後再溫育24小時。反應地9,000xg下離心20分鐘，然後加入冰醋酸中和pH至6.0左右。之後，使用Sephadex G-25(Pharmacia生產)色譜(2.0×150cm，用水洗脫)將上清液脫鹽。脫鹽後的組份富含KDN-OS，並稱為粗製KDN-OS。按照TBA法(Kitajima，K.et al.，Anal.Biochem，205，244-250)定量測定KDN。(3-2)誘導酶的實驗將Sphingobacterium mOL 12-4s菌細胞(1×108個)接種於40ml含有1％(w/v)酪蛋白水解物(Casamino acid，Gibco生產)和1％(w/v)葡萄糖(Glc)的M9液體培養物基中，並於25℃下44培養物小時。收集處於生長期的微生物細胞(細菌細胞)，並用M9液體液體培養物基洗滌兩次。將細菌細胞(6.1×1010個細胞)接種於2.0ml含有0.1％(w/v)粗製KDN-OS，KDN-OS，KDN，Neu5Ac，多聚乙醯神經氨酸的酸性水解物(oligo-Neu5Ac；Kitazume，S.etal.，Anal.Biochem.，202，25-34(1992))，或者Glc的M9液體培養物基，並且於25℃溫育24小時，以測定可生長的細胞個數和KDNase活性。通過稀釋每個溫育後細胞培養物液，並將所得的每個稀釋好的溶液接種於LB瓊脂培養物平皿，並計數生長的克隆數從而確定原培養物液中的細胞個數(Kitajima，Ket al.，j.Biol.Chem.，269，21415-21419)。為測定細胞中KNDase的活性，通過5,000rpm或1,500xg下離心10分鐘收集細胞。將收集到的細胞懸浮於0.5ml含有100mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)中，並用超聲的方法裂解細胞(50瓦，1分鐘)。將裂解製備物於10,000rpm或6,000xg下離心10分鐘，進而獲得可用於測定KDN活性的上清液。結果見表1。表1[]中的數值表示酶活性的比值，並將未加入(誘導劑)前的活性值作為1。
表1加入的物質細胞數KDNase 一定細胞中KDNase活性活性 (百萬單位/每1010個細胞)(百萬單位)加入前 6.1×1010[1] 20[1]3.3[1]Glc 1.7×1012[1] 80[4]0.47
KDN-OS 1.5×1012[25] 7500[380]50[15]粗製KDN-OOS 5.7×1012[93] 2300040[12]KDN 3.6×1010
38[1.9] 11[3.3]Neu5Ac 2.5×1010
15
6.0[1.8]Oligo-Neu5Ac3.0×1010
12
4.0[1.2]在加入0.1％粗製KDN-OS後，測定了隨著培養的變化、一定數量(1010個)細胞中KDNase的活性。結果見圖1。
作為結果，KDN，KDN-OS和粗製KDN-OS誘導了KDNase，然而，其它的單糖和寡糖對酶的誘導沒有作用。游離的KDN同樣可誘導KDNase，但是未見與KDN-OS和粗製KDN-OD等強的誘導作用。據此，我們建議優選含有KDN形成酮苷鍵的物質作為誘導劑。
圖1表明，當把增殖的細菌細胞(6.0×1010個)接種於含有0.1％KDN-OS的M9培養基中，在溫育24小時至43小時後，每個細胞中的KDNase活性與培養開始時的活性相比增加到一個非常高的水平。2KDNase的純化將全部的、按照前文(1)中所得到的5-70％硫酸銨沉澱組份用於Sephacryl S-200(Phamacia生產)柱(1.8×135cm)，並用含0.5M NaCl的20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)洗脫。因此通過凝膠過濾進行了組份分離(圖2)。按照4-MU-KDN法測定了每個洗脫組份的KDNase活性。收集有活性的組份，並加入硫酸銨至90％飽和度，然後放置物過夜。將該溶液於150,000xg離心1小時，得到的沉澱溶於4.7ml的20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)/0.5M NaCl並按照上述使用Sephacryl S-200柱相同的方法再次進行凝膠過濾，以收集KDNase的活性組合物(圖3)。
將收集到的KDNase活性組份中加入硫酸銨至90％飽和度，然後放置過夜。將該溶液於150,000xg離心1小時，得到的沉澱溶於4.8ml的20mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)/0.05M NaCl。該溶液用於填充了連接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的瓊脂糖凝膠(Affe-gel 15，Bio Rad生產)柱(2.0×15cm)，並連續使用90ml 20mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)/0.05M NaCl和135ml 20mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)/0.5MNaCl洗脫(圖4)。有一部分的活性組份未被吸附，是由於樣品負載超過了柱子的吸附能力。在前面所得到的凝膠柱上，將活性組份中未被洗脫的部分再次上柱和吸附，然後用20mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)/0.5M NaCl洗脫(圖5)。因此收集到了所有吸附於連接有KDN-gp瓊脂糖凝膠的、可被高離子強度洗脫的酶組份(15ml)。使用超濾(Centriflow CF25，Amicon生產)的方法將所收集到的酶組份濃縮至最多為2ml，並稱為親合純化的酶組份。
測定了每一純化步驟中所獲酶組份的酶活性、蛋白含量、產率和純度。按照4-MU-KDN法測定了KDNase的活性，其中25℃下、每分鐘每產生1nmol 4MU的酶量被定義為1個單位，按照修改了的Lowry法定量測定蛋白的的含量(BCA試劑，Pierce，U.S.A)，其中使用牛血清白蛋白(BSA)作為標準，測定230nm的吸收，結果見表2。
表2組份 活性 蛋白 比活 產率純化度(單位) (mg) (單位/mg)(％)(倍數)細胞裂解液 153 2070.737 100 1.050-70％ 113 1031.11 74.2 1.5(NH4)2SO4組份第一級 76.1 57.3 1.33 49.8 1.8SephacrylS-200第二級 57.4 26.6 2.16 37.6 2.9SephacrylS-200KDN-gp 52.2 0.410 12734.2 173瓊脂糖吸附組份將親合純化的酶組份進行10％SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳後使用銀染試劑盒(Wako Pure Chemical生產)對凝膠進行染色，使用光密度掃描儀(測定600nm的吸收)對所染的5或6個條帶的位置和光密度進行了測定，結果見圖7。
使用Sephacryl S-200凝膠過濾柱對上述酶組份作進一步的分離，並在Kav 0.3-0.4時洗脫獲得7個具有KDNase活性的組份，並且對於這7個組份的KDNase活性與其在SDS聚丙烯凝膠電泳上所測得的帶行為間的關係作了細緻的研究。作為結果，發現了對應單-組份的一個條帶，該條帶所顯示的類型與其活性值相符，因此判斷它是KDNase的條帶。與分子量標記物(Seikagaku公司產品)比較，該條帶的表觀分子量計算為57,000。另外，通過凝膠濾過色譜法所得到的活性組分，經過與分子量標記物(Seikagaku公司產品)比較，算出的分子量為50,000，這與SDS-PAGE所得的結果基本一致。圖7顯示了親合純化酶組份SDS-PAGE的類型，其中所示的條帶位置被認為是KDNase。
通過上述的純化步驟無法將KDNase完全純化。然而，粗製的酶溶液，如細胞裂解液，以及親合純化的酶組份都可以用作具有無唾液酸酶活性的KDNase。如果需要的話，可按照普通酶純化的方法對該酶作進一步的純化。在那些純化過程中，KDNase的活性和估計出的分子量可作為指標。
本發明者使用下列的方法將KDNase成功地純化至SDS-PAGE上的均一水平，在適度攪拌的同時，向滲透休克法獲得的細胞裂解液上清中一點點地加入硫酸銨至90％的飽和度，然後於4℃放置過夜。通過在17,000xg下離心30分鐘的方法回收沉澱。將回收的沉澱溶於10ml的0.1MNaCl-100mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)中，並用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)進行透析。透析後，溶液上CM-Toyopearl 650M柱(2.2×11cm，42ml；Toyo Soda生產)，該柱已用相同透析緩衝液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0))平衡，柱子先用60ml相同的緩衝液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0))洗脫，然後用400ml含線性濃度梯度NaCl(0.1M至0.6M)的0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)洗脫。將通過的組份(pass-through fractions)合併成一個溶液，用超濾(YM10，Amicon生產)的方法濃縮至15ml。濃縮的溶液用於DEAE-Toyopearl 650M柱(2.2×11cm，42ml；ToyoSoda生產)，柱子用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩衝液(pH8.0)平衡，然後先用相同的平衡緩衝液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩衝液(pH8.0))60ml洗脫，再用60ml的0.5M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩衝液(pH8.0)洗脫。未被柱子吸附的組份匯集得到匯集溶液，並用超濾的方法濃縮至13ml。濃縮液上CM-Toyopearl 650M柱，柱子用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩衝液(pH8.0)平衡，柱子先用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-緩衝液(pH8.0)洗脫。然後用含線性濃度梯度NaCl(0.1M至0.6M)的0.25M蔗糖-20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)洗脫，以收集具有KDNase活性的組份(0.17至0.2M NaCl附近)。將收集到的組份合併後上SDS-PAGE電泳，作為結果，可確定有單一的條帶。
按照上述方法獲得的單一純化的酶，在SDS-PAGE電泳上與分子標誌比較，其表觀分子量計算約為42,000。通過凝膠濾過色譜法(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；用20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)/0.2M NaCl洗脫)評估分子量，與分子量標誌比較，計算值約為40,000左右3本發明脫氨基神經氨酸酶的性質使用前述方法所獲得的親合純化酶組份，研究了本發明脫氨基神經氨酸的性質。(1)底物特異性研究了本發明脫氨基神經氨酸酶對於不同的含KDN複合多糖和糖類，以及含唾液酸複合多糖和糖類的反應活性。
其中所使用的含KDN複合多糖和糖類，以及含唾液複合多糖和糖類的獲取方法和來源如下KDN二聚體，N-乙醯神經氨酸(Neu5Ac)二聚體，N-乙二醇醯神經氨酸(Neu5Gc)二聚體Anal.Biochem.，202，25-34(1992)。
含KDN的雙鏈N-型糖鏈Biochemistry，33，6495-6502(1994)。
KDN寡糖醇含KDN糖蛋白J.Biol.Chem.，265，21811-21819(1990)。
含KDN神經節苷脂(ganglioside)GM3J.Biol.Chem.，266，21929-21935(1991)。
4-Methylumbelliferyl Neu5Ac，多聚乙醯神經氨酸購自NakaraiChemical。
N-乙醯神經氨酸乳糖，人轉鐵蛋白(Huamn transferrin)，胎牛血清胎球蛋白購自Sigma。
含Neu5Ac的雙鏈N-型糖鏈J.Biol.Chem.，264，18520-18526(1989)。
豬頜下腺粘蛋白Arch.Biochem.Biophys.，129，49-56(1969)。
湖鱒魚多糖蛋白，虹鱒魚多糖蛋白，arctic char多糖蛋白J.Biol.Chem.，268，23675-23684(1993)。
含Neu5Ac神經節苷脂GM3、Neu5Ac神經節苷脂GM1Biochem.J.，441，488-497(1976)。
Neu5Ac α 2→6(Gal β 1→3)GalNAcol，蟾蜍卵巢狀糖蛋白Enr.J.Biochem.，223，223-231(1994)。
在10μl含0.1N NaCl的0.1M Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)中，將相當於5μg KDN或N-乙醯神經氨酸(Neu5Ac)或N-乙二醇醯神經氨酸(Neu5Gc)的、每個上述含KDN唾液酸的複合多糖或糖類，與本發明的脫氨酸神經氨酸酶(80個百萬單位)在25℃下共存20小時。
將反應液點樣於矽膠薄層板上(Merck生產)，用1-丙醇∶25％氨水∶水＝6∶1∶2.5(體積比)展開7個小時。展開後，將平板乾燥，噴10％硫酸乙醇溶液。平板在120℃加熱，使展開的複合多糖或糖類、以及釋放的KDN、Neu5Ac或Neu5Gc變色。作為對照，進行反應時不加入酶。結果見表3。其中有KDN、Neu5Ac或Neu5Gcc釋放的表為「+」，而無KDN、Neu5Ac或Neu5Gcc釋放的表為「-」。
根據這一結果，表明本發明的脫氨基神經氨酸酶不僅把4-MU-KDN作為合成的底物，而且作用於任何一種、自然存在並已知的、由KDN殘基形成的α2→3、α2→6、α2→8鍵形式的酮苷鍵。
對於表3所示的含有N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸的各種複合多糖和糖類，本發明的脫氨基神經氨酸酶不能水解由N-乙醯神經氨酸或N-乙醇醯神經氨酸形成的酮苷鍵、因此，本發明的脫氨基神經氨酸酶對於脫氨基神經氨酸具有高度的特異性。
表3複合 鍵 存在或無裂解4-MU-KDN+KDN二聚體 KDNα2→8KD +含KDN的雙鏈N-型糖鏈 KDNα2→3Gal+KDN寡糖醇 KDNα2→8KDN，KDNα2→3Gal +KDNα2→6GalNAcol含KDN糖蛋白 KDNα2→8KDN，KDNα2→3Gal +KDNα2→6GalNA含KDN的神經節苷脂GM3KDNα2→3Gal+4MU-Neu5AcNeu5Ac二聚體Neu5Acα2→8Neu5Ac -Neu5Gc二聚體Neu5Gcα2→8Neu5Gc -Neu5Ac半乳糖Neu5Acα2→3(6)Gal -含Neu5Ac的雙鏈N-型糖鏈 Neu5Acα2→3Gal -Neu5Acα2→6(Galβ→3)GalNAcol Neu5Acα2→6GalNAcol-人轉鐵蛋白 Neu5Acα2→6Gal -胎牛血清胎球蛋白Neu5Acα2→3(6)Gal -豬頜下腺粘蛋白 Neu5Acα2→6GalNAc -蟾蜍卵巢膠狀糖蛋白 Neu5Acα2→6GalNAc -多聚乙醯神經氨酸(→8Neu5Acα2→)n-湖鱒魚多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→)n-虹鱒魚多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→)n-arctic char多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→，→8Neu5Gcα2→)n-含Neu5Ac的神經節Neu5Acα2→3Gal -含NEu5Ac的神經節苷脂GM1 Neu5Acα2→3(GalNAcβ1→4)Gal -(2)最適pH使用上述獲得的、本發明脫氨基神經氨酸酶的親和純化酶組份和單一純化酶組份測定最適pH。除了使用0.1 M Tris-乙酸緩衝液作為緩衝液外，按照上述的4-MU-KDN法進行酶反應，在pH4.0至9.0範圍內，在每個pH下進行酶反應，以測定每個pH條件下的酶活性。作為結果，圖8(親和純化酶組份)和圖9(單一純化酶組份)顯示，在pH6左右可獲得最高的反應活性。(3)最適反應溫度除了溫度變化外，按照上述的4-MU-KDN法測定本發明脫氨基神經氨酸酶的活性。作為結果，本發明的脫氨基神經氨酸酶在25℃至30℃左右具有較高的反應活性。(4)穩定性將本發明的脫氨基神經氨酸酶在25℃和pH4至9條件下放置數小時。之後，按照4-MU-KDN法測定KDNase的活性。在這一pH範圍內本發明脫氨基神經氨酸酶是相對穩定的。
將本發明脫氨基神經氨酸酶溶於0.1 M Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)/0.1 M NaCl至70μg/ml的濃度，在不同溫度下放置預定的一段時間。之後，按照4-MU-KDN法測定KDNase的活性。作為結果，在25℃下，本發明脫氨基神經氨酸酶至少48小時內不會失活。
無論pH或離子強度如何，本發明脫氨基神經氨酸酶在數十個μg/ml或稍低的濃度下是不穩定的。純化了的酶可在存在蛋白如牛血清白蛋白時被穩定。(5)本發明脫氨基神經氨酸酶的抑制和活化為了研究諸如離子強度的EDTA(乙二胺四乙酸)對本發明脫氨基神經氨酸酶活性的影響，將這些化合物加入按照4-MU-KDN法進行酶反應的反應溶液中。作為結果，在這些用於研究的加入物濃度為1mM時，酶活性不受任何一種二價陽離子，即鈣離子(Ca2+)、鎂離子(Mg2+)、錳離子(Mn2+)，以及EDTA的影響。
研究了離子強度對本發明脫氨基神經氨酸酶活性的影響。結果見圖10。當離子強度增加時，本發明脫氨基神經氨酸酶的活性迅速增加。在300mM NaCl時可得到最大的反應值。而在低離子強度50mM或者更低時，酶的活性極低。
本發明脫氨基神經氨酸酶可被游離的KDN(3mM)抑制，另外，本發明酶不被游離、作為KDN結構類似物的唾液酸所抑制。本發明脫氨基神經氨酸酶同樣不被含有N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸的複合多糖和糖類所抑制，已證明它們不是本發明脫氨基神經氨酸酶的底物。本發明脫氨基神經氨酸酶不被2，3-二羥基-2-脫氧-N-乙醯神經氨酸所抑制。而2，3-二羥基-2-脫氧-N-乙醯神經氨酸是已知的、可裂解N-醯基神經氨酸所形成酮苷鍵的唾液酸酶的特異性抑制劑。
本發明脫氨基神經氨酸酶不被作為表面活性劑的Triton X-100所抑制。存在有0.5％膽酸鈉時，本發明脫氨基神經氨酸酶的活性基本消失，而在0.1％膽酸鈉時，約有90％的酶活性得以保持。(6)(酶反應動力學的)Michaelis常數的測定在使用4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)作為本發明脫氨基神經氨酸酶底物的條件下，測定了Michaelis常數(Km)和最大酶反應速度(Vmax)。在25℃下，將本發明脫氨基神經氨酸酶(32個百萬單位)和底物(4-MU-KDN，4.7μM)於216μl的反應液(含有0.1mg/ml的牛血清白蛋白的0.1 Mtris-乙酸緩衝液(pH6.0)/0.1M NaCl)中反應。作為結果，在1小時內可線性釋放4-methylumbelliferyl(4-MU)。
在25℃，正這一酶濃度下，在與上述相同的反應液中，4-MU-KDN的濃度改變為21至167μM，反應進行30分鐘，以測定初反應速度。得到Lineweaver-Burk曲線，並由此計算Michaelis常數。作為結果，本發明脫氨基神經氨酸酶催化水解4-MU-KDN時的Vmax為0.19μM/min或者7.4mM/min/mg蛋白，Km為μM。(7)胺基酸分析使用6N鹽酸，在105℃下水解24小時，以研究純化了的KDNase(單一純化酶)的胺基酸組成。結果如下，數字以摩爾百分率％表示。
天門冬醯胺和天門冬氨酸5.3穀氨酸5.5絲氨酸13.6甘氨酸19.8組氨酸2.0
精氨酸2.0蘇氨酸6.7丙氨酸9.0脯氨酸3.5酪氨酸5.6纈氨酸5.9甲硫氨酸 7.6異亮氨酸 3.5亮氨酸4.0苯丙氨酸 3.2賴氨酸2.0實施例3合成含KDN的糖鏈將本發明脫氨基神經氨酸酶(1個單位)加入40mM KDN和40mM乳糖的混和溶液(50μl)，然後在25℃下於0.1 M Tris-乙酸緩衝液(pH6.0)中放置。作為結果，確定30分鐘後在反應溶液中存在有含KDN的乳糖工業可應用性本發明的微生物可生產新的KDNase，該KDNase對於已知的、作為唾液酸酶作用點的N-醯基神經氨酸殘基無反應活性。另外，該KDNase可作用於已知的唾液酸酶極難裂解的脫氨基神經氨酸殘基，並且該KDNase可水解由脫氨基神經氨酸殘基形成的酮苷鍵。
本發明的脫氨基神經氨酸酶有希望作為研究上有用的試劑，例如對脫氨基神經氨酸結構和功能的分析。本發明脫氨基神經氨酸酶對於KDN形成的酮苷鍵具有極高的特異性。因此，本發明脫氨基神經氨酸酶有希望用於檢測KDN形成的酮苷鍵。
可使用本發明脫氨基神經氨酸酶進行水解反應的逆反應，以生成新的含脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類。這些新的含脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類可以作為類似物，從而有可能修飾含有N-乙醯神經氨酸的複合多糖或糖類，或者有希望用作新的生理活性物質。
權利要求
1.一種具有下列酶學性質的脫氨基神經氨酸酶(1)作用該脫氨基神經氨酸酶作用於含有脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類，並且水解由脫氨基神經氨酸形成的酮苷鍵(ketosidic linkage)，以生成游離的脫氨基神經氨酸和不含有脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類，或者部分去除脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類。(2)底物特異性該脫氨基神經氨酸酶作用於含有脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類，但不作用於含有N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸複合或糖類中、由N-乙醯神經氨酸或N-乙二醇醯神經氨酸形成的酮苷鍵。
2.權利要求1的脫氨基神經氨酸酶，該酶具有以下的理化性質(i)最適反應pH；該脫氨基神經氨酸酶在pH6附近具有最適的反應pH值；(ii)穩定的pH範圍在25℃下，該脫氨基神經氨酸酶在pH4至9範圍內穩定；(iii)最適反應溫度在25℃左右，該脫氨基神經氨酸酶具有最適的反應溫度；(iv)熱穩定性在25℃下，該脫氨基神經氨酸酶至少48小時不會失活；(v)抑制和穩定化作用該脫氨基神經氨酸酶被游離的脫氨基神經氨酸抑制，並且存在蛋白時，如牛血清蛋白，該脫氨基神經氨酸酶可被穩定。
3.權利要求1或2的脫氨基神經氨酸酶，該酶由SphingobacteriummOL 12-4s菌株產生。
4.一種用於生產脫氨基神經氨酸酶的方法，包括培養屬於Sphingobacterium菌屬並具有生產脫氨基神經氨酸酶能力的細菌，以及從所得培養物中收集該酶的步驟，該脫氨基神經氨酸酶由權利要求1所定義。
5.Sphingobacterium mOL 12-4s菌株具有生產脫氨基神經氨酸酶的能力。
6.一種用於生產含有脫氨基神經氨酸複合多糖或糖類的方法，包括權利要求1所定義的脫氨基神經氨酸酶與脫氨基神經氨酸和複合多糖和/或糖類進行共反應的步驟。
全文摘要
將屬於Sphingobacterium菌屬的一種菌、如Sphingobacterium mOL12-4S菌株，進行培養後從得到的培養物中收集菌，一種作用於含有脫氨基神經氨酸複合多糖或糖類的脫氨基神經氨酸酶，該酶可水解由脫氨基神經氨酸形成的酮苷鍵，以生成游離的脫氨基神經氨酸和不含有脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類，以及部分去除脫氨基神經氨酸的複合多糖或糖類，該脫氨基神經氨酸酶不作用於有關的、含有N-乙醯神經氨酸或N-乙醇醯神經氨酸複合多糖或糖類中、由N-乙醯神經氨酸或N-乙醇醯神經氨酸形成的酮苷鍵。
文檔編號C12N1/20GK1156480SQ95194792
公開日1997年8月6日 申請日期1995年6月19日 優先權日1994年6月28日
發明者井上康男, 井上貞子, 北島健 申請人:生化學工業株式會社