芋螺毒素的生物學製備方法及其產品和用途的製作方法

2023-06-13 01:09:46

專利名稱：芋螺毒素的生物學製備方法及其產品和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及芋螺毒素的製備方法，尤其涉及一種芋螺毒素的生物學製備方法以及由該生物學方法製備得到的產品以及它們在鎮痛、神經修復或戒斷毒癮中的醫藥用途，屬於芋螺毒素的生物學製備領域。
背景技術：
海洋毒素是近二十年一個新興的研究領域，其重要進展之一是發現了一些毒性極大的小肽類毒素，其中軟體動物芋螺(conus)分泌的芋螺毒素(conotoxin)是備受重視的一類神經毒素，是迄今發現的最小核酸編碼的動物神經毒素肽，也是二硫鍵密度最高的小肽。芋螺毒素具有化學結構新穎，生物活性強，作用靶位選擇性高等特點，已成為藥理學和神經科學的有力工具和新藥開發的新來源。依照芋螺毒素對神經肌肉系統的作用部位，將其分為四類1、α -芋螺毒素(a-conotoxin):其與銀環蛇毒素相似,作用於神經突觸後乙醯膽鹼受體(AchR)起阻斷作用；2、μ-芋螺毒素(μ-conotoxin):其與河豚毒素相似，在·活化相起作用，專一抑制電壓敏感性鈉通道；3、ω-芋螺毒素(ω-conotoXin)，專一阻斷神經末梢突觸前電壓敏感性鈣通道；4、δ-芋螺毒素(δ-conotoxin)，專一作用於電壓敏感性鈉通道，在非活化相起作用，延長動作電位持續時間。芋螺毒素對靶受體的作用具有高親和性和高特異性，可以區分不同的受體亞型。雖然不同的芋螺毒素的胺基酸序列變化非常大，但它們的結構上的差異不大，尤其是表達後加工的過程基本是一致的。a CTx(alpha conotoxin Tx)有望被直接開發成藥物或作為新藥的先導化合物。作用於N型VSCCs的芋螺毒素能抑制中樞神經系統的與痛覺相關的神經遞質(如穀氨酸和P物質)釋放，從而減輕動物的神經性疼痛，並引起了人們希望將其開發成為新的肽類止痛劑的濃厚興趣。a CTx有望用於慢性疼痛的治療，它相對於嗎啡，具有療效好、不成癮的獨特優點；CTx具有比嗎啡藥效更強和持續時間更長的鎮痛效果，是通過阻斷外周初級傳入神經元的nAChRs而發揮止痛作用，其給藥更方便(可肌注或脂肪注射)，同時也無嗎啡引起的副反應(如便秘、呼吸抑制等)，極有望開發成為高效止痛藥物。此外a CTx能選擇性阻斷nAChRs的某種亞型，除有止痛效果外，也有望開發成用於治療焦慮症、帕金森氏病、肌肉緊張和高血壓等病症的藥物。alpha A conotoxin Txl即是目前研究比較多的一種a CTx。迄今尚未見有芋螺毒素高活性的體外表達的文獻報導，可能原因有以下兩點1、在原核表達系統，無法加工去除N-端信號肽序列，無法解決C-端醯胺化問題；2、芋螺毒素分子小，鹼性胺基酸較多，因此難於形成特定活性構象。由於以上原因，大部分實驗室為獲得具有生物活性的芋螺毒素只好轉向化學合成。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種優化的芋螺毒素a ACTl基因，該基因能夠在昆蟲宿主或細胞中高效表達具有生物學活性的芋螺毒素。本發明的目的之二是提供一種芋螺毒素的生物學製備方法。
本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的本發明將芋螺毒素a ACT的原始基因序列(GenBank AF146352. 1，其核苷酸序列為SEQ ID No. I所示，所編碼的胺基酸序列為SEQ IDNo. 3所示)根據家蠶和多角體病毒密碼子偏好性進行改造，採取了調整了 GC含量及不宜峰(以延長mRNA的半衰期)、去除常用限制性內切酶位點以及原始序列中含有串聯的稀有密碼子(減少翻譯序列甚至解除翻譯裝置)，破除那些影響mRNA穩定性及其與核糖體結合的莖環結構等一系列優化手段，得到優化後的芋螺毒素基因(aACTl)，其核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示，本發明進一步的在SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的5』端加上BamHI酶切位點和kozak序列，3』端加上EcoRI，得到SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列。優化後的芋螺毒素a ACTl基因能夠在家蠶等昆蟲宿主或細胞中高效表達具有生物學活性的芋螺毒素。本發明進一步提供了一種芋螺毒素的生物學製備方法，該方法包括以下步驟(I)將芋螺毒素基因克隆到杆狀病毒運載載體的表達盒中，構建得到重組轉移表達載體；(2)將所構建的重組轉移表達載體與杆狀病毒DNA共轉染昆蟲細胞，獲得重組杆狀 病毒；(3)用重組杆狀病毒感染昆蟲宿主或昆蟲細胞；培養被感染的昆蟲宿主表達有活性的芋螺毒素；收穫並純化所表達的產物(即芋螺毒素)，即得。其中，所述的芋螺毒素基因的核苷酸序列可以是任何一種芋螺毒素基因的核苷酸序列，例如可以是α-芋螺毒素、μ-芋螺毒素、ω-芋螺毒素或δ-芋螺毒素中的任意一種；優選為α -芋螺毒素，更優選為SEQ ID NO :I所示的原始的芋螺毒素a ACT基因或SEQID NO :2所示的優化後的芋螺毒素a ACTl基因，最優選為SEQ ID NO :2所示的優化後的芋螺毒素ct ACTl基因。本發明中所述的杆狀病毒運載載體的表達盒包括啟動子和增強子；所述的啟動子優選為多角體蛋白啟動子、PlO啟動子或ie-l啟動子中的任意一種。本發明中所述的杆狀病毒選自BmNPV、AcMNPV, ApNPV, HaNPV, HzNPV, LdMNPV,MbMNPV,OpMNPV,SIMNPV,SeMNPV或SpltNPV中的任意一種；優選的，所述杆狀病毒為家蠶杆狀病毒BmNPV，進一步優選為家蠶杆狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8。本發明中所述的昆蟲宿主選自家蠶(Bombyx mori)、野蠶(Bombyx mandarina)、蓖麻香(Philosamia cynthia ricim)、樟香(Dictyoploca japanica)、樗香(Philosamiacynthia pryeri)、作香(Antheraea pernyi)、日本作香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、斜紋夜蛾(Spodoptera Iittoralis)、秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、行軍蟲(Thaumetopoeawilkinsoni) > 棉鈴蟲(Heliothis armigera) > 美國棉鈴蟲(Heliothis zea)、煙青蟲(Heliothis assulta)、菸草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(Pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(Lymantria dispar);優選的,所述杆狀病毒的昆蟲宿主為家蠶。本發明中所述的感染是將重組杆狀病毒通過口食來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；優選的，所述的感染是將重組家蠶杆狀病毒感染家蠶細胞或將重組家蠶杆狀病毒穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹體，在感染3-6天後收集家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿，對樣品用超聲波破碎，然後5，OOOrpm離心3min，酸或溫度處理，經O. 22微米濾膜過濾等，得芋螺毒素製品；其中，所述的蛹體優選為1-2天的早期嫩蛹。本發明通過同源重組的方式將芋螺毒素原始基因或優化後的芋螺毒素基因重組到杆狀病毒中獲得重組杆狀病毒；再將重組杆狀病毒感染家蠶，以家蠶作為生物反應器，在家蠶中高效表達具有鎮痛、神經修復或毒癮戒斷等藥理活性的芋螺毒素產物。本發明方法採用杆狀病毒表達系統在昆蟲個體生物反應器中安全、高效的生產有活性的芋螺毒素，所製備的毒素純化後，安全性極高，可直接用於鎮痛等用途。本發明製備芋螺毒素的方法具有表達效率高、後加工完備、生物活性好、生產成本低、可實現規模化生產等優點。將有效量的本發明所製備的芋螺毒素與藥學上可接受的輔料或載體配伍在一起能夠獲得鎮痛、神經修復或戒斷毒癮的藥物組合物。本發明所述的藥物組合物可以按照本領域的常規製備方法將其成臨床上可接受的藥物製劑，如口服製劑或注射製劑。作為一種優選的實施方案，可以將本發明有效量的芋螺毒素與脂肪酸相混合，經超聲波乳化後製備成口服製劑。所述脂肪酸在口服製劑中的終濃度為25-35% (g/ml)(更優選為30%)，餘量為純化的芋螺毒素溶液；其中，所述的脂肪 酸優選由棕櫚酸、油酸和硬脂酸組成。


圖lpVL1393 示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實驗材料I.菌株、病毒株與載體大腸桿菌株Bmbacmid和BmNPV的構建方法見有關文獻(發明專利申請
發明者張志芳, 李軼女, 易詠竹, 劉興健, 鄭學星, 邊大勇, 王國增, 江峰, 鍾魯龍 申請人:中國農業科學院生物技術研究所