一種能高效生物轉化汙染土壤中鎘形態的微生物菌劑的製作方法

2023-06-13 01:29:46

本發明屬於微生物治理重金屬汙染
技術領域：
，具體涉及一種能高效生物轉化汙染土壤中鎘形態的微生物菌劑。
背景技術：
：隨著礦產資源的開發利用，工業生產的迅猛發展和各種化學產品、農藥及化肥的廣泛使用，含重金屬的汙染物通過各種途徑進入環境，造成土壤汙染日益嚴重。目前我國受cd、hg、as、cr、pb汙染的耕地面積約2000×104hm2，每年因重金屬汙染而損失的糧食約1000×104t，受汙染糧食多達1200×104t，經濟損失至少達200×108元。重金屬汙染物不能被化學或生物降解，易通過食物鏈途徑在植物、動物和人體內積累，毒性大，對生態環境、食品安全和人體健康構成嚴重威脅。因此，農田土壤重金屬汙染己成為當前日益嚴重的環境問題，其汙染來源和修復技術也一直是國內外研究的熱點和難點。由於傳統的物理化學方法的局限性，土壤重金屬修復越來越偏向於生物修復，其中植物修複比較普遍，但高富集植物的馴化培養以及生長周期長等因素限制了植物修復的發展，微生物轉化技術以其經濟高效的優勢突顯出來。例如，李潔等人通過將1％的黑麴黴菌接種在1.5％的土漿濃度中進行生物浸出，在11天時達到最大浸出率67.4％。再如，張靜霞等人利用自養菌和異養菌混合浸出湘江底泥時，以10％的菌種接種到5％的土漿濃度中，在48天時達到浸出率84.4％。與本發明的微生物菌劑相比，他們面臨浸出率低，以及時間周期長等關鍵問題。礦山廢水微生物早已廣泛應用於冶金工業中，而很少將其獨特的功能在治理土壤中的重金屬元素中展現出來，主要是由於土壤體系十分複雜，有機物含量豐富，浸礦微生物難以存活。同時，由於浸礦微生物生長周期較長，生長條件較為苛刻，復配出一種可以快速生長，條件簡單易控且能高效轉化土壤中鎘形態的微生物菌劑十分必要。技術實現要素：本發明的目的是提供一種微生物複合功能菌劑，該複合功能菌劑能將汙染土壤中難利用鎘高效轉化成可溶態，實現快速，有效治理鎘汙染的目的。一種能高效生物轉化土壤中鎘形態的微生物菌劑：該微生物菌劑主要包括以下菌種：產朊假絲酵母(candidautilis)、申克孢子絲菌(sporothrixsp.)、氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)、異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)；這些菌混合前分別在含鎘的培養基中進行了馴化。進一步的優選，該微生物菌劑主要包括以下數量比例的菌混合而成：25～35％產朊假絲酵母菌(candidautilis)、15～20％申克孢子絲菌(sporothrixsp.)、15～20％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、15～20％嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)、5～15％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)；這些菌混合前分別在含鎘的培養基中進行了馴化。所述的能高效生物轉化土壤中鎘形態的微生物菌劑的菌種的馴化過程如下：設置鎘的濃度梯度為1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l；培養基其它成分為：9k培養基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)；培養條件為:溫度20～30℃，轉速150～200r/min，產朊假絲酵母菌和申克孢子絲菌的初始ph為4.0，氧化亞鐵嗜酸硫桿菌、嗜酸硫桿菌和異化鐵還原菌的初始ph為2.0。首先分別將活化的5種菌濃達到5.0x107個/ml以上的菌液以8-12％(v/v)的接種量接種到100ml含1mg/lcdso4的培養基中，馴化培養2-10天後再以8-12％體積的接種量接種到下一個鎘的濃度梯度培養基中，直到最終鎘濃度達到25mg/l。所述的能高效生物轉化土壤中鎘形態的微生物菌劑的配方來源以下過程：通過將長期受到高濃度鎘汙染的農田土壤和富含鎘的鉛鋅礦坑廢水富集物接種到富集培養基中，振蕩培養後，將培養物轉接到新鮮的富集培養基中，繼續振蕩培養，經過5～10次轉接培養後獲得高效生物轉化土壤中鎘形態的微生物菌劑。所述的長期受到高濃度鎘汙染的農田土壤來自於湖南省衡陽大浦鎮礦區汙染農田土壤，汙染年限長達40年，鎘含量高達100ppm；礦坑廢水來自於湖南省郴州市柿竹園鉛鋅礦區，鎘含量高達20ppm。採集長期受到高濃度鎘汙染的土壤樣品，以2～10％(v/v)的比例接種到富集培養基中。採集富含鎘的鉛鋅礦坑廢水，以5～20％的(v/v)比例接種於9k培養基中，在初始ph1.8～2.5，溫度20～30℃，轉速150～200r/min條件下培養2～10天，直到菌濃達到4x108個/ml以上，然後以5～20％(v/v)的比例轉接到新鮮的9k培養基中，繼續培養，經過5～10次轉接培養後獲得富含鎘的鉛鋅礦坑廢水富集物，然後以2～10％(v/v)接種到富集培養基中。富集培養基組成如下：9k培養基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)。所述的9k培養基成分如下：蒸餾水1000ml，3g/l的(nh4)2so4，0.5g/l的k2hpo4，0.1g/l的kcl，0.01g/l的ca(no3)2，0.5g/l的mgso4·7h2o。配製時，首先在9k培養基中加入0.01～0.5％酵母膏，同時配入0.01％～0.5％的葡萄糖溶液，在115～121℃高壓滅菌15～30分鐘，然後稱取0.01～0.5％硫粉進行紫外滅菌15-30min後加入。所述微生物菌劑的富集培養條件為：初始ph4.0～6.0，溫度20～35℃，轉速150～200r/min條件下富集培養2～10天，傳代培養8次以上，每次以8-12％(v/v)接種濃度接種於新鮮的富集培養基中進行培養。最終得到的微生物菌劑ph為1.0～1.7，菌濃為1.0x109～4.0x109個/ml。採用上述方法得到的微生物菌劑進行miseq測序，能夠得到主要的微生物種類和相對豐度，然後根據測定結果進行本發明菌群的復配，得到功能統一的微生物菌劑。本發明菌劑使用時，將其稀釋至濃度為4.0x107～8.0x107個/ml，將稀釋後的菌劑加入到鎘汙染土壤中，控制土壤質量:稀釋菌劑體積＝(0.05～1.0)kg:1l，攪拌處理2～96h。與現有技術相比，本發明的優點在於：本發明通過將鎘汙染土壤中具有鎘轉化功能的微生物和鉛鋅礦坑廢水中的浸礦微生物富集物結合起來生成微生物菌劑，然後通過miseq測序得到主要的微生物種類和數量，然後復配得到功能統一的微生物菌劑；不僅突破了傳統物理和化學方法面臨的處理周期長，成本高，不能從根本上減少土壤中鎘含量等缺點，也打破了植物和動物富集法所面臨的生長周期長，不易存活等限制因素，本發明所述的微生物菌劑具有培養周期短，成本低，操作簡單易控，能有效將難利用鎘轉化成可溶態，加速鎘溶出到溶液中來等優勢，在土壤重金屬鎘修複方面具有廣闊的應用前景。附圖說明圖1是實施例1得到的微生物菌劑的生長曲線；圖2是實施例1得到的微生物菌劑的ph值變化曲線。具體實施方式實施例1：微生物菌劑的採集、培養和馴化培養基配製：9k培養基+0.1％酵母膏+0.1％葡萄糖+0.1％硫粉。9k培養基成分如下：蒸餾水1000ml，(nh4)2so43g/l，k2hpo40.5g/l，kcl0.1g/l，ca(no3)20.01g/l，mgso4·7h2o0.5g/l。首先在9k培養基中加上0.1％酵母膏，調節ph4.0，同時配製5％的葡萄糖溶液，在121℃高壓滅菌20分鐘，然後稱取0.1％硫粉進行紫外滅菌20min後加入。底泥採集於湖南省衡陽大浦鎮礦區汙染農田土壤，汙染年限長達40年，鎘含量高達100ppm。利用五點採樣法採集5～10cm深的長期受到高濃度鎘汙染的土壤樣品，混勻後作為製備微生物菌劑的底泥，以5％的比例接種到富集培養基中。鉛鋅礦坑廢水富集物的製備包括如下步驟：採集富含鎘的鉛鋅礦坑廢水，以15％的比例接種於9k培養基中，在初始ph2.0，溫度30℃，轉速180r/min條件下富集培養5～7天，直到菌濃達到4x108個/ml以上，然後以10％的比例轉接到新鮮的9k培養基中，繼續培養，經過6次富集培養後獲得鉛鋅礦坑廢水富集物，然後以5％的比例接種到富集培養基中。將富集培養基高溫滅菌後，加入5％的底泥和5％的礦坑廢水富集物，在30℃，轉速180r/min條件下富集培養7～10天。當菌濃達到4.0x108個/ml以上後，以10％的接種濃度接種於新鮮的富集培養基中進行培養5～10天，經過8次傳代培養後，獲得生長周期基本穩定在72h左右，ph1.5～1.7，菌濃1.0x109～4.0x109個/ml的微生物菌劑。選取第1代、第6代、第8代富集物進行miseq測序，結果表明：第1代富集物主要由：42％產朊假絲酵母(candidautilis)、15％單胞瓶黴屬真菌(phialemoniumsp.)、5％蠟狀子囊菌(coniochaetavelutina)、23％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)、10％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)；第6代富集物主要由：30％產朊假絲酵母菌(candidautilis)、15％申克孢子絲菌(sporothrixsp.)、3％單胞瓶黴屬真菌(phialemoniumsp.)、20％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、12％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)、14％嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)組成；最終所得微生物菌劑的群落結構主要由29％產朊假絲酵母菌(candidautilis)、17％申克孢子絲菌(phialemoniumsp.)、18％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、10％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)、17％嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)組成。實施例2：本發明微生物菌劑的復配根據實施例1測序的結果，按照以下數量比例的菌混合而成：25～35％產朊假絲酵母菌(candidautilis)、15～20％申克孢子絲菌(sporothrixsp.)、15～20％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、15～20％嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)、5～15％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)；這些菌混合前分別在含鎘的培養基中進行了馴化。菌種的馴化過程如下：設置鎘的濃度梯度為1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l；培養基成分為：9k培養基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)；培養條件為:溫度20～30℃，轉速150～200r/min，產朊假絲酵母菌和申克孢子絲菌的初始ph為4.0，氧化亞鐵嗜酸硫桿菌、嗜酸硫桿菌和異化鐵還原菌的初始ph為2.0。首先分別將活化的5種菌濃達到5.0x107個/ml以上的菌液以8-12％(v/v)的接種量接種到100ml含1mg/lcdso4的培養基中，馴化培養2-10天後再以8-12％體積的接種量接種到下一個鎘的濃度梯度培養基中，直到最終鎘濃度達到25mg/l。表1三個組合的菌劑配方組合產朊假絲酵母菌申克孢子絲菌氧化亞鐵嗜酸硫桿菌嗜酸硫桿菌異化鐵還原菌126％20％20％20％14％230％20％20％18％12％335％15％15％20％15％實施例3：微生物菌劑生物去除汙染土壤中的鎘鎘汙染土壤採自於湖南省衡陽大浦鎮礦區汙染農田土壤，編號a、b、c。將土壤風乾後磨碎過100目篩，然後分別稱取20g樣品到乾淨小三角瓶中，封裝滅菌。實驗所用菌劑包括：實施例2所得微生物菌劑a、實施例1的礦山廢水富集物b、直接由鎘汙染土壤通過實施例1得到礦山廢水富集物相同方法富集得到的土壤富集物c、實施例1中將5％礦山廢水富集物和5％的底泥混合培養後的第1代富集物d。實驗設計：反應體系為200ml富集培養基，初始ph4.0。每個樣品設置7個實驗組，每個實驗組都加入10％的汙染土壤樣品，其中三個平行實驗組接種10％的a(exp.)，一個接種10％的b(kk)，一個接種10％的c(sk)，一個接種10％的d(dk),一個不加菌(ck)，在30℃，180r/min條件下振蕩5天。每天測定ph，5天後離心收渣，將殘渣風乾過100目篩，測定土壤中鎘含量，結果如表2所示。結果表明：實施例2製備的微生物菌劑的鎘去除率顯著優於其他各組的效果。表2實施例3中鎘的去除率實驗組abcck(對照)28.69％21.04％21.40％sk(土壤富集物)29.05％20.89％21.76％kk(礦山廢水富集物)51.09％49.86％44.81％dk(第1次富集物)72.33％65.87％57.99％exp.(實施例2所得微生物菌劑組合1)92.76％90.46％82.55％exp.(實施例2所得微生物菌劑組合2)94.98％91.25％84.21％exp.(實施例2所得微生物菌劑組合3)90.74％89.41％82.10％當前第1頁12