牙周膜幹細胞的分離與體外增殖方法與流程
2023-06-13 18:26:41 2
本發明涉及幹細胞技術領域，尤其是涉及一種牙周膜幹細胞的分離與體外增殖方法。
背景技術：
牙周病是一類發生在牙周組織的慢性感染性疾病，其治療以實現牙周組織的完全再生，恢復牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質的正常生理功能為最終目標，但是目前牙周組織缺損一直未能得到完全有效的再生。
牙周膜幹細胞屬於成體幹細胞，2004年由byoung首次提出，並且證實了其在一定條件下能形成牙周膜牙骨質樣複合體，這將為其組織工程化研究提供理論依據和可靠的細胞來源。近年來此項組織工程技術迅猛發展，為牙周病的治療帶來了新的希望。牙周組織工程包括生長因子、支架材料及種子細胞。
因此，牙周膜幹細胞作為一種新發現的幹細胞，在牙周組織工程研究中有較大的應用前景。但是牙周膜組織量小、分離困難，一直成為制約牙周膜幹細胞研究的重要原因。
為了解決上述問題，本發明提出了一種牙周膜幹細胞的分離與體外增殖方法，該方法通過對牙周膜幹細胞進行分離，然後利用有限稀釋法克隆純化牙周膜幹細胞，使牙周膜幹細胞得到增殖。本發明的有益效果是：通過對研究牙周膜幹細胞的分離與體外增殖，為後期研究牙周組織工程的生物器官的構建和牙周膜再生治療提供理論基礎。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種牙周膜幹細胞的分離與體外增殖方法。
為實現上述方法，本發明提供如下技術方案：
牙周膜幹細胞的分離與體外增殖方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟：
步驟a，選擇並收集12-18歲因正畸減數需拔牙患者而拔除的牙周健康的前磨牙，要求牙體無齲壞、無缺損，拔除後4h內送至實驗室；
步驟b，在超淨工作檯內，於無菌培養皿中用pbs液反覆衝洗牙體3-4遍，然後使用無菌手術刀片，小心刮取根中1/3處的牙周膜，邊刮取邊用pbs液衝洗，使用眼科剪將刮取的組織塊剪至最小；
步驟c，將獲取的牙周膜組織塊離心，分離，培養；
步驟d，採用有限稀釋法克隆純化牙周膜幹細胞，使所述牙周膜幹細胞增殖。
所述步驟c中還包括以下分步驟：
分步驟1，所述的牙周膜組織塊轉移至離心管中，在1000r/min條件下離心2分鐘；
分步驟2，棄掉所述離心管中的上清液，避光條件下分別加入1mlⅰ型膠原酶和1mldispase酶，在37℃恆溫水浴鍋內消化40-50分鐘；
分步驟3，在所述消化過程中，每5分鐘輕輕振蕩所述離心管一次，至所述牙周膜組織消化為棉絮狀；
分步驟4，在1000r/min的條件下，經所述離心管離心5分鐘，棄掉上清液，加入完全培養液2ml，重懸細胞；
分步驟5，將所述重懸的細胞接種於六孔板中，在每孔中加入2ml的所述的完全培養液，置於5％的co2孵箱中在37℃下培養；
分步驟6，5天後初次更換培養液，以後每3天更換培養液一次，等待細胞在六孔板中長滿80％。
所述步驟d中還包括以下分步驟：
分步驟01，取所述牙周膜幹細胞培養的上清液，在1500r/min的條件下，在所述離心管中離心10分鐘；
分步驟02，取所述離心後的上清液，經0.22μm直徑的小濾器過濾後，與培養基以體積比1∶1混合，作為適應性培養基。
分步驟03，取所述牙周膜幹細胞處於對數生長期的第一代細胞，用所述適應性培養基倍比稀釋，調整細胞密度至每毫升10-15個，吹打混勻，接種於96孔培養板中，每孔100μl，培養12小時後標記單個細胞孔，並補液至每孔200μl；
分步驟04，所述96孔培養板中每5天換液，待所述牙周膜幹細胞克隆長至孔底1/3-1/2後胰酶消化，擴大培養。
本發明的有益效果是：通過對研究牙周膜幹細胞的分離與體外增殖，為後期研究牙周組織工程的生物器官的構建和牙周膜再生治療提供理論基礎。分離純化人牙周膜細胞，進一步認識其生物學特性，為後期研究牙周膜牙骨質複合體的人工生物器官的構建以及牙周膜再生治療提供重要的理論依據。
附圖說明
圖1是本發明實施例1的整體流程示意圖；
圖2是本發明實施例1的離心，分離，培養的過程示意圖；
圖3是本發明實施例1中有限稀釋法克隆牙周膜幹細胞的過程示意圖。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
參照圖1所示牙周膜幹細胞的分離與體外增殖方法，該方法的實施步驟是：首先選擇並收集12-18歲因正畸減數需拔牙患者拔除的牙周健康的前磨牙1，要求牙體無齲壞、無缺損，拔除後4h內送至實驗室；之後在超淨工作檯2內，於無菌培養皿3中用pbs液反覆衝洗牙體3-4遍，然後使用無菌手術刀片，小心刮取根中1/3處的牙周膜，邊刮取邊用pbs液衝洗，使用眼科剪4將刮取的組織塊剪至最小；將獲取的牙周膜組織塊5離心，分離，培養；最終採用有限稀釋法克隆純化牙周膜幹細胞6，使所述牙周膜幹細胞6增殖。
參照圖2所示所述離心，分離，培養的過程中還包括以下步驟：
將所述的牙周膜組織塊5轉移至離心管中，在1000r/min條件下離心2分鐘；棄掉所述離心管7中的上清液，避光條件下分別加入1mlⅰ型膠原酶和1mldispase酶，在37℃恆溫水浴鍋8內消化40-50分鐘；
在所述消化過程中，每5分鐘輕輕振蕩所述離心管7一次，至所述牙周膜組織塊5消化為棉絮狀；在1000r/min的條件下，經所述離心管7離心5分鐘，棄掉上清液，加入完全培養液2ml，重懸細胞；
將所述重懸的牙周膜細胞6接種於六孔板9中，在每孔中加入2ml的所 述的完全培養液，置於5％的co2孵箱10中在37℃下培養；
5天後初次更換培養液，以後每3天更換培養液一次，等待細胞在所述六孔板9中長滿80％。
參照圖3所示所述有限稀釋法克隆牙周膜幹細胞的過程包括以下步驟：
取所述牙周膜幹細胞6培養的上清液11，在1500r/min的條件下，在所述離心管7中離心10分鐘；
取所述離心後的上清液，經0.22μm直徑的小濾器過濾後，與培養基12以體積比1∶1混合，作為適應性培養基13。
取所述牙周膜幹細胞6處於對數生長期的第一代細胞，用所述適應性培養基13倍比稀釋，調整細胞密度至每毫升10-15個，吹打混勻，接種於96孔培養板14中，每孔100μl，培養12小時後標記單個細胞孔，並補液至每孔200μl；
在所述96孔培養板14中每5天換液，待所述牙周膜幹細胞6克隆長至孔底1/3-1/2後胰酶消化，擴大培養。
對於本領域技術人員而言，顯然本發明不限於上述示範性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特徵的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示範性的，而且是非限制性的，本發明的範圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨 在將落在權利要求的等同要件的含義和範圍內的所有變化囊括在本發明內。
此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。