含有抗血凝素抗體、保守的流感抗原和免疫刺激載體結合結構域的多功能連接子蛋白的製作方法

2023-06-13 13:01:06

專利名稱：含有抗血凝素抗體、保守的流感抗原和免疫刺激載體結合結構域的多功能連接子蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學和疫苗領域。具體而言，本發明涉及蛋白質物質及其在對抗 由呼吸道病原體引起的感染的疫苗中的應用。
背景技術：
流感病毒是一種世界範圍內的最重要的呼吸道病原體之一。流感病毒在季節性 流行期間通常感染全世界總人口的10% 20%，產生三 五百萬的嚴重病例並導致每年 250,000 500,000例死亡。在美國，每年流感要奪去平均20,000人的生命，而同時平均 114,000例流感相關的住院治療導致每年$120億的估計經濟損失。而且，新型流感菌株 也偶爾出現在人群中，導致大範圍流行。1917 1920年西班牙流感流行的死亡人數導致 全世界超過了 5000萬例死亡，而新型流感流行的危險一直存在。控制流感的最佳方式是 接種疫苗。然而，相對於針對許多其它病原體在一生中僅接種1 3次的疫苗，流感疫 苗需要每年給予。流感表現出改變其兩個主要膜蛋白，血凝素(HA)和神經氨酸苷酶(NA)的抗原 特性的非凡能力。這通過遠離人群中所建立的適應性免疫響應的連續選擇而產生。由於 病毒的高突變率，特定的疫苗製劑通常僅僅有效約1年。世界衛生組織每年調整疫苗的 內容物以包含下一年發作的最可能的病毒菌株。現在，傳統疫苗是由三種非活化的流感 病毒(兩個A-鏈和一個B鏈)組成的疫苗。這三價流感疫苗是基於WHO預測的在即將 來臨的流感季節流行的流感菌株每年重新製作的。例如，對於2007 2008季的年更新 三價流感疫苗由來自流感H3N2、HlNl和B流感病毒的血凝素(HA)表面糖蛋白組分組 成。流感疫苗的劑量根據其HA內容物、病毒的主要糖蛋白確定。每年生產超過二 億五千萬劑的流感疫苗，在60% 80%範圍內的兒童和老人中發揮保護效果。因此，對 於改進的流感疫苗尤其是在易感目標人群如兒童和老人中仍存在某些需要未滿足。改進 流感疫苗的當前方法包括a.引入佐劑；b.引入其它流感抗原組分；C.在體內的病毒進入處引發局部免疫反應的方法，由此提供疫苗的外部防禦 線。流感疫苗現在來自於在含胚雞蛋或組織培養中生長的病毒。大多數流感疫苗包 含減毒的活病毒、滅活病毒、裂解病毒(split virus)或HA亞單位。新技術正在出現，例 如通過採用昆蟲細胞生產HA亞單位物質。一個增強疫苗組分尤其是亞單位疫苗的免疫 原性的常見方式，是加入佐劑。通常也認為，疫苗組分(抗原)共價或非共價吸附或連 接至佐劑是有利的。鋁鹽(Alum)是人類疫苗中適於此目的的最常用佐劑。然而，吸附 於鋁鹽上的流感疫苗是有毒，因此批准的人用流感疫苗主要是無佐劑的。
迄今為止，對抗流感還沒有可用的廣譜疫苗。另外，儘管與季節性流感爆發相 關的發病率和死亡率很高，在許多國家人群中的接種覆蓋率卻較低。能夠得到提供比每 年度的流感疫苗對流感更廣譜的保護的流感疫苗，更具吸引力並因此有助於流感疫苗的 增效和/或使用。另外，無論亞型如何，有效對抗多種人類流感病毒A菌株的疫苗可以 考慮用於作為對新型流感流行預防的儲備。

發明內容
因此，本發明的一個目的是提供改進的流感疫苗。具體而言，本發明人的目的 在於提供適用於人的有佐劑的流感疫苗，其提供對抗非疫苗型流感類型的交叉保護。優 選新疫苗的分子設計能夠進行方便的和成本有效的年度重新配製。至少一些這樣的目的通過開發含有不易突變的流感抗原組分的多功能多肽而被 滿足，所述多肽進一步能夠「負載」上各種HA亞型多樣性和被固定或連接至免疫刺激 載體上的多肽。因此，本發明提供了一種蛋白質物質，含有(i)至少一個能夠非共價結合至HA 的多抗原亞型的血凝素(HA)結合結構域(HBD)，(ii)保守的流感蛋白、或其抗原片段， 和(iii)免疫刺激載體結合結構域(IBD)。優選地，抗原片段能夠通過主要的組織相容性 複合物(MHC)I類或II類提供。因此，該片段將典型地具有至少約6或7個胺基酸殘基 的長度。本發明還提供了編碼該蛋白質物質的核酸序列和含有該核酸序列的宿主細胞。 其它實施方式涉及(通過其IBD)連接至免疫刺激載體的蛋白質物質和含有用HA亞型負 載的多種物質(例如，抗體片段)的載有抗原的免疫刺激載體。正如本文中所公開的蛋白 質物質容許易於將具有佐劑活性的免疫刺激載體加載到不同的HA亞型，而不會改變HA 抗原生產工藝過程，與此同時提供對抗其它菌株的更廣譜(交叉的)保護。蛋白質物質 也稱之為『多功能蛋白錨定(縮寫為『Protan』)連接子』。在本發明的蛋白質物質中，不同結構域的相對位置能夠變化。所述結構域能夠 直接相互融合或它們可以通過間隔區序列間隔。典型地，保守流感病毒(膜)蛋白或其 抗原片段(或其多個拷貝；參見以下內容)將會側接於HBD的一側並通過IBD側接於另 一側，而使HBD和IBD易於接近其結合伴侶(分別是HA抗原和免疫刺激載體)。在一 個實施方式中，至少一個HBD和IBD分別位於所述蛋白質物質的C-端和N-端。在另 一實施方式中，至少一個HBD和IBD分別位於該蛋白質物質的N-端和C-端。該結構 域並沒有必要位於該蛋白質物質的最外端；一段一個或多個胺基酸殘基能夠存在於該物 質既不是HBD也不是IBD的任意一端。在優選的實施方式中，該蛋白質物質的HA-結合結構域能夠結合至多個源於流 感病毒A型和/或B型的HA亞型。典型的HA亞型包括HA1、HA2、HA3、HA4、 HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HAl0, HAlU HAl2, HAl3, HA14、HAl5 和 HA16。在一個實施方式中，HA-結合結構域能夠識別特異於季節性流感的亞型，例如， HAl和HA3。在另一實施方式中，其識別特異於流行性流感的多個亞型，如HA5、HA7 和 HA9。流感HA亞型合適的結合結構域能夠通過多個方式獲得i.通過免疫小鼠選擇抗體，選擇顯示出對HA亞型廣譜結合的單克隆，確定可變的結構域胺基酸序列；ii.使用抗體噬菌體展示文庫選擇顯示結合多個HA亞型的scFv或納米抗體 (nanobodies)；iii.文獻中描述的具有已知結合譜和所述可變區的已知胺基酸序列的抗體。因此，本發明一方面提供了包含(i)能夠結合至HA的多抗原亞型抗體或其功能 片段，Gi)保守流感蛋白、或其抗原片段，和(iii)免疫刺激載體結合結構域(IBD)的蛋 白質物質。例如，HA結合結構域是由通過間隔區連接的可變輕鏈結構域(VL)和可變重鏈 結構域(VH)組成的單鏈抗體(scFv)。可以使用任何類型的間隔區序列，條件是其並不 包含潛在的蛋白裂解位點且可以具有充分的柔性以正確地定位VL和VH結構域從而獲得 功能性scFv。連接VH和VL的合適間隔區是間隔區218 (Whitlow, M et al.l993.Protein Eng.6 989-995)。Watabe, T et al. (2007 ； Mol.Biol.Evol.24 1627-1638)，描述了結合至 HA 的具
有已知的3D結構的四種小鼠單克隆抗體。兩種抗體結合至HA受體結合區域的稍微不同 的表位(單克隆HC 19和HC63，結構2VIR.PDB和1KEN.PDB)並且結合到HA側更近 膜區域上的一個表位的兩個抗體並不涉及受體結合(HC45和BH151，結構IQF U.PDB和 1E08.PDB)。根據作者，抗體HC45和BH151不易產生HA中的抗原漂移且能夠結合更 不同的突變體/亞型。因此，在一個實施方式中，本發明蛋白質物質中的HBD包含小鼠 單克隆抗體(mAb)的VL和VH鏈，優選mAb HC45或BH151。然而，應該理解到，原 則上，能夠使用任何VL-VH結構域，只要能夠通過不發生抗原漂移的表位結合至廣泛範 圍的HA亞型，而由此並不會起到中和抗體的作用。HC45尤其適用於實施本發明，因為 其對於一定範圍的HA亞型顯示出最高的結合親合力。這種抗體的VL和VH鏈能夠通過 將連接子引入至VL的C-端和VH鏈的N-端之間而接合至單鏈抗體(scHC45)。連接本發明蛋白質物質中VL和VH鏈的優選連接子是基本上抗蛋白酶解降解的 並提供VL和VH鏈產生相互作用的足夠柔性的那些連接子。尤其合適的是「218」連接 子(Whitlow，M et al.1993, Protein Eng.6 989-995)。例如，構建體 scHC45 (252 個氨 基酸)的所述胺基酸序列如下(HC45VL[黑體]和VH[下劃線]結構域，其中的「218」
連接子-序列[斜體])
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTLVHSNGNTYLHWYL QKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA
EOl^GyYFCSONTUYPYTFGGGTKLElKGSTSGSGKPGSGEGST
KG OVOLOOPGAELVRPGASVKLSCKASGYTLTTYWMNWFKORPDOGLEWIGRIDPY DSETHYNOKFKDKAILTVDRSSSTAYMOLSSLTSEDSAVYYCTRFLOITTIIYGMDYWGO GTSVTVSS在另一個實施方式中，HA-結合結構域是所謂的單_結構域抗體(dAb)或駱駝 化(camelised)抗體。如果具有輕鏈的接觸殘基被親水性更強的側鏈替代而模擬天然缺乏 輕鏈伴侶的駱駝源抗體重鏈並防止聚集，則標準抗體的重鏈(VH)的可變部分能夠用於結合。這就是所說的駱駝化並產生駱駝化重鏈(CVH)。因此，以下胺基酸變化需要置入重 鏈中L11S，G44E, L45R, W47G 和 V37F/Y (Davies，J.and Riechmann，L.1996.Protein Eng.9 531-537 ； Muyldermans, S.2001.J.Biotechnol.74 277-302)。本文中本發明人提供了一種hc45小鼠結構域的駱駝化變體，產生了具有以下氨 基酸序列(129aa)的 cVH 結構域(cVH45) ovoloopgaesvrpgasvklsckasgytl tt ywmnwfk orpdo EReG igridpydsethynokfkdkailtvdrssstaymolssl tsedsavyyctrfloittiiygmdywgogtsvtvss AKTTPPS黑體是使VH結構域可溶性更強的胺基酸取代部分。下劃線部分是VH結構域。 斜體是連接抗體中的VH域與恆定域的間隔區。本文中是指用於將VH結構域連接至蛋 白質物質的其餘部分。W02007/011216公開了包含融合至一個或多個抗原結合結構域，如能夠結合感 興趣的抗原的抗體的肽聚糖結合結構域的多肽。典型的抗原包括多肽、碳水化合物、脂 質、多核苷酸和病原體抗原，如失活病毒顆粒和純化的抗原決定區。然而，在單多肽中 一方面保守的流感抗原和另一方面經歷高突變速率的流感抗原結合結構域的同時存在， 在本領域內還沒有公開或提出。Brameanu etal. (Vaccine 2007, Vol.25, pp.2497-2506)公開了基於使用表達 PR8
流感病毒HA的T和B病毒表位的雙倍抗原化的免疫球蛋白的流感疫苗生產的遺傳工程方 法。其並未公開能夠非共價結合至HA的多抗原亞型的至少一個HA結合結構域。正如所述，根據本發明的蛋白質物質的特徵在於其中存在保守流感蛋白，例 如，保守的核蛋白(NP)或保守的基質蛋白(M)。採用Heiny AT et al.2007.PLoS ONE 2(11) : ell90中描述的方法就能夠找到保守流感蛋白序列。例如，該蛋白質物質包含一 個或多個(一前一後)流感保守基質Ml (58-66)肽的拷貝(Plotnicky，H et al.2003.Virology 309 320-329)。一方面，其包括保守流感膜蛋白的胞外部分。優選地，其包括流感膜蛋白M2的 胞外部分(M2e)，優選流感病毒A型的M2e。非常合適的是流感A的M2-蛋白(M2e) 的保守23個胺基酸胞外肽結構域的使用。基於M2e的所述保守23個胺基酸胞外肽結構 域的廣譜候選疫苗已經開發出來(DeFilette，M et al.2005.Virology337 149-161)。因為 M2e肽是免疫原性較差的，優選包括本發明蛋白質物質中的肽，例如，二聚體或三聚體 構象的一個以上的拷貝(參見圖1)。這種方法在之前M2e三聚體融合至，例如Hepatitis B核抗原(HBcAg)時使用。M2e-HBcAg疫苗在小鼠模型中有免疫原性並具有保護性的， 但是仍需要其它佐劑(De Filette, M et al.2006.Vaccine 24 544-551)。本文中提供的蛋白質物質的其它特性元素之一是能夠將(載有抗原)HA結合結 構域和保守流感抗原結合至免疫刺激載體的免疫刺激載體結合結構域(IBD)。在一個實 施方式中，IBD是能夠結合至含有可接近肽聚糖表面的免疫刺激載體的肽聚糖結合結構 域。例如，蛋白質物質包含選自由LysM結構域、由具有乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmA 的C-端中的LysM結構域的胺基酸序列資料庫中同源性搜索而檢索的胺基酸序列(本文 中所述結構域也稱之為AcmALysM結構域)和與AcmA LysM結構域顯示出至少70%序 列一致性的序列組成的組中的胺基酸序列。在一個實施方式中，IBD包含能夠結合至肽聚糖的胺基酸序列，該序列是LysM結構域。優選地，多肽包含至少兩個，更優選至少3個LysM結構域。LysM(細胞 溶解酶基序)結構域約有45個殘基的長度。已經發現細菌細胞壁降解涉及的各種酶 (Joris et al.1992.FEMS Microbiol.Lett.70 257-264)。LysM 結構域被認為具有一般肽聚 糖結合功能。這個結構域的結構是已知的(『The structure of aLysM domain from E.coli membrane-bound lytic mureintransglycosylase D(MltD)， .Bateman A, Bycroft M.2000. J.Mol.Biol.299 : 1113-11192)。LysM結構域的存在並不限於細菌蛋白。它們也存在於許 多真核蛋白中，而它們在古生菌蛋白中不存在。細胞壁的結合功能對於許多含LysM結 構域的蛋白已經進行假設。部分純化的海氏腸球菌溶菌酶，類似於AcmA而含六個LysM 結構域的蛋白，結合至相同菌株的肽聚糖片段。單核細胞增多李斯特菌的p60蛋白含有 兩個LysM結構域並顯示出與細胞表面結合。枯草桿菌的穆勒肽酶(muropeptidases) LytE 和LytF在其N-端分別具有三個和五個重複並都是結合細胞壁的。技術人員能夠通過在公開可獲得的蛋白序列資料庫中採用本領域已知的方法 實施基於同源性搜索而確定LysM結構域胺基酸序列。各種已知算法已經對公眾公 開而能夠使用各種公開的和可商購的軟體。實例包括但不限於MacPattem(EMBL)， BLASTP(NCBI), BLASTX(NCBI)禾Π FASTA(維吉尼亞大學)。在一個實施方式中， LysM 結構域的 PFAM 登記號 PFO1476 (參見 http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/Pfam/ getacc ？ PF01476)用於搜索實現LysM結構域標準的胺基酸序列。PFAM網址提供的兩 個分布隱藏的馬科夫模型(分布HMMs)，採用序列家族一致性的統計描述而能夠用於完 成敏感資料庫搜索。HMMER是蛋白質序列分析的分布HMM軟體的自由可分布的執行。乳球菌的主要自溶酶的C-端區域包含三個同源LysM結構域，其由非同源性 序列分開。對於三個AcmA LysM結構域的胺基酸序列參見，例如，圖2(基本上來自 W099/25836),其中三個LysM結構域由Rl、R2和R3指示。所示AcmA的C端區域 調節自溶酶的肽聚糖結合(Buist，G.etal.l995.J.Bacteriol.l77 1554-1563)。在一個實施方式中，本發明蛋白質物質的IBD包含至少一個如AcmA中存在的 LysM結構域。在AcmA LysM結構域的精確胺基酸序列中的變異也包含在內，但條件是 保持肽聚糖結合的功能性。因此，胺基酸取代，缺失和/或插入可以實施而不會破壞肽 聚糖的結合能力。AcmA LysM結構域的一些部分更不適於變異，例如在大部分的LysM 結構域中發現的保守的GDTL、N和GQ基序(圖2)。然而，也可以改變其它的序列而 不會影響IBD結合免疫刺激載體的效能。例如，在AcmA三個LysM結構域中性質非常 不同的(極性、非極性、親水性、疏水性)位置處的胺基酸殘基能夠進行改性。優選地， IBD包含與乳酸乳球菌AcmA的三個LysM結構域之一具有至少70%，優選80%，更優選 90%,比如92%、95%, 97%或99%同一性的序列。適用於本發明的蛋白質物質的IBD 可以包含一個或多個這種(同源的)AcmA LysM結構域，無論是不同的，還是相同的。 典型地，LysM結構域相互毗鄰，可能被一個或多個胺基酸殘基分開。LysM結構域之間 能夠分開一個短距離，例如，分開1 15個胺基酸、或15 100個胺基酸的中等距離， 或像分開150或甚至200個胺基酸的大距離。在某些方面，本發明涉及的IBD所包含的胺基酸序列，與AcmALysM結構域具 有至少約80%的胺基酸序列同一性，可替代地至少約81%的胺基酸序列同一性，可替代 地至少約82%的胺基酸序列同一性，可替代地至少約83%的胺基酸序列同一性，可替代地至少約84%的氨基酉髮序列同--性，可替代地至少約85 %的氨基酉I序列同--性，可替代地至少約86%的氨基酉髮序列同--性，可替代地至少約87%的氨基酉I序列同--性，可替代地至少約88%的氨基酉髮序列同--性，可替代地至少約89%的氨基酉I序列同--性，可替代地至少約90%的氨基酉髮序列同--性，可替代地至少約91 %的氨基酉変序列同--性，可替代地至少約92%的氨基酉堯序列同--性，可替代地至少約93 %的氨基酉変序列同--性，可替代地至少約94%的氨基酉堯序列同--性，可替代地至少約95%的氨基酉変序列同--性，可替代地至少約96%的氨基酉堯序列同--性，可替代地至少約97%的氨基酉変序列同--性，可替代地至少約98%的氨基■I序列同--性和可替代地至少約99%的氨基畫g序列同--性。多肽的『胺基酸序列同一性百分數，，如70%、80%, 90%, 95%, 98%, 99%或100%序列一致性，可以通過在比對窗口比對兩個最佳對齊序列而測定，其中比 對窗口中的多肽序列部分可以包括相對於兩個胺基酸序列最佳對齊的參照序列(其並不 包含增加或刪除部分)增加的或刪除的(即，間隙)部分。通過以下步驟計算百分數 (a)確定兩個序列中出現同一胺基酸的位置數而獲得匹配位置數；(b)用匹配位置數除以 比對窗口中的總位置數；和(C)結果乘以100而獲得序列一致性百分數。比對的序列最 佳對齊可以通過已知算法的計算機設施執行，或通過檢驗而實施。方便利用的序列比對 和多個序列對齊算法分別是都可以網絡獲得的Basic LocalAlignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F.et al.l990.J.Mol.Biol.215 403 ; Altschul，S.F.et al,1997.Nucleic Acid Res.25 3389-3402)和 ClustalW 程序。在另一實施方式中，IBD包含存在於由具有AcmA LysM結構域的胺基酸序列數 據庫中同源性搜索而檢索的胺基酸序列中的LysM結構域，其中LysM結構域能夠將該物 質結合至革蘭氏-陽性微生物的細胞壁。優選地，檢索的所述胺基酸序列是源於革蘭氏 陽性細菌的胺基酸序列。例如，其是細菌細胞壁水解酶的胺基酸序列。優選地，檢索的 胺基酸序列與AcmA LysM結構域顯示出至少70%、更優選80%、最優選至少90%序列 一致性。可以檢索的序列實例能夠發現於專利申請W099/25836的圖11中。本發明的其他方面涉及編碼根據本發明的蛋白質物質的核酸序列和含有所 述序列的(表達)載體。這容許在宿主細胞中另外生產蛋白質物質，因此該宿主細 胞也包含在本文中。合適的原核或真核源的宿主細胞包括微生物，如乳球菌亞種 (Lactococcus ssp.)、乳桿菌亞種(Lactobacillus ssp.)、芽孢桿菌亞種(Bacillus ssp.)、肉 鏈球菌(Streptococcus carnosus)、焚光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)、釀酒酵母菌亞種(Saccharomyces ssp.)、畢赤酵母亞種(Pichia ssp.)、克魯維酵母亞種(Kluyveromyces ssp.)、裂褶菌亞種 (Schizophyllum ssp.)、木黴素亞禾中(Trichoderma ssp.)、鏈黴菌亞禾中(Streptomyces ssp.)， 植物和哺乳動物細胞，如Vero細胞、CHO細胞、MDCK細胞、PerC6。在一個實施方式 中，提供了包含根據本發明的核酸序列或載體的乳球菌宿主細胞。在另一實施方式中， 宿主細胞是CHO細胞系。如果需要，該核酸序列可以針對宿主編碼子應用進行設計和優 化而提高所編碼蛋白的生產水平。本發明也涵蓋了提供根據本發明蛋白質物質的方法。其包括以下步驟在合適 介質中培養含有根據本發明的核酸序列或載體的宿主細胞，允許表達該物質並分離出該 物質。該方法能夠以具有合適的表達載體的任何類型的合適宿主細胞進行實施。在一個實施方式中，宿主細胞是微生物宿主細胞。在另一實施方式中，宿主細胞是真核宿主細 胞，真核宿主細胞能夠進行蛋白質物質的哺乳動物型的翻譯後修飾。最常見和最狹義的 對蛋白翻譯後修飾的理解之一是其糖基化作用。人體糖蛋白是用複合N-和O-連接的聚 糖的令人困惑的異構陣列進行糖基化，其是位於細胞內質網和高爾基體中的酶協同活性 的產物。蛋白的糖基化在不同生理的-和細胞培養條件-和疾病中的分化、發育期間是高 度調節和變化的。重組蛋白尤其是預定可能給予人類對象的那些重組蛋白的糖基化是至 關重要的。糖基化深刻地影響活性、功能、從循環中清除、以及特別重要的是抗原性。因此，對於生產本發明的蛋白質物質，採用能夠提供N-和O-型聚糖改性的宿 主細胞是有利的。後者在本領域內是已知的，包括微生物的、真菌的、哺乳動物的、昆 蟲的和植物宿主細胞。本發明也提供了根據本發明的糖基化蛋白質物質，其可以通過在合適介質中培 養含有根據本發明的核酸序列或載體的宿主細胞，容許表達該物質並分離出該物質而獲 得，其中所述宿主細胞是能夠N-和O-型糖基化的真核宿主細胞。糖基化程度能夠容 易地通過本領域內的已知方法進行確定，例如，參見Post-translational Modification A Practical Approach (1999) S.J.Higgins, B.D.Hames, eds.，ISBN13 : 978-0-19-963795-9。 正如本文以下所示，在哺乳動物(CHO)細胞中生產的蛋白質物質對免疫刺激載體(GEM) 的結合能力並不會受源自原核細胞的IBDCLysM結構域)糖基化作用的影響。本發明也提供了含有糖基化IBD的蛋白質物質，可以通過在真核宿主細胞優選 哺乳動物宿主細胞中表達編碼該物質的核酸構建體。在一個實施方式中，該物質含有融 合至糖基化IBD的感興趣的多肽。感興趣的多肽優選是N-和/或O-糖基化的。例如， 其是真核或病毒來源的抗原。該蛋白質物質可以包含含有選自由LysM結構域、由具有 乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmA C-端中的LysM結構域(本文中所述域也稱之為AcmA LysM結構域)的胺基酸序列資料庫中同源性搜索而檢索的胺基酸序列和與AcmA LysM結 構域顯示出至少70%序列一致性的序列組成的組中的胺基酸序列的糖基化肽聚糖結合結 構域。例如，該物質含有乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmA的糖基化C-端肽聚糖結合結 構域。另一方面涉及具有HA抗原亞型(通過至少一個HBD)的根據本發明的蛋白質物 質。這種所謂的『預加載多肽』適合連接至免疫刺激載體。因此，本發明也提供了具有根據本發明的蛋白質物質的免疫刺激載體，和提供 這種免疫刺激載體的方法。這種物質在連接至免疫刺激載體之前可以用HA抗原預加載。 可替換地，首先將多功能蛋白質連接子連接至載體並隨後用HA抗原加載當然也是可能 的。因此，本發明另外提供了載有抗原的免疫刺激載體，其中HA抗原結合至連接載體 的蛋白質物質的HBD(參見示例性實施方式的圖3)。提供HA負載的免疫刺激載體的方法可以包括以下步驟提供免疫刺激載體； 提供含有(i)至少一個能夠結合至HA的多抗原亞型的血凝素(HA)結合結構域(HBD)， (ii)保守流感蛋白、或其抗原片段，和Gii)容許將所述多肽連接至所述載體的免疫刺激 載體結合結構域(IBD)的蛋白質物質；和將所述免疫刺激載體和所述蛋白質物質接觸； 可選地包括將所述蛋白質物質與抗原HA亞型接觸。提供免疫刺激載體的步驟優選包括 由革蘭氏陽性細菌製備不可存活的球形肽聚糖顆粒。提供所述多功能蛋白質物質可以包括從抗體庫中選擇出HA-結合結構域，優選使用噬菌體展示技術。該蛋白質物質通過重 組表達編碼所述物質的核酸構建體而有利地在宿主細胞中生產。根據選擇的宿主細胞， 該方法可以包括從宿主細胞的培養基介質或從宿主細胞提取物或溶胞產物中收集這種蛋 白質物質的步驟。正如本文中所用的，術語「免疫刺激載體」是指一旦向對象給藥之後，具有能 夠增強或改性其所連接抗原的免疫刺激性質的能力。免疫刺激載體因此具有佐劑性質。 另外，其包含容許通過結合IBD的肽聚糖連接一個或多個蛋白質物質的肽聚糖。優選非 重組的免疫刺激載體。在優選的實施方式中，免疫刺激載體複合物是獲自革蘭氏陽性細 菌(GEM顆粒，或『菌蛻』)的不可存活的球形肽聚糖顆粒。GEM顆粒的製備方法此 前，例如在專利申請WO 02/101026和WO 2004/102199中已經進行了描述。這種方法保 留了絕大部分細菌的天然球形結構。簡而言之，該方法包括用能夠從細胞壁物質中除去 細胞壁組分，如蛋白、脂磷壁酸或碳水化合物的溶液處理革蘭氏陽性細菌。所得的GEM 顆粒可以隨後進行儲存直至其與所需(抗原負載)多功能蛋白錨定連接子接觸。GEM顆 粒比未處理的革蘭氏陽性細菌結合顯著更高數量的IBD。因此，對於GEM顆粒上的抗原 能夠實現高負載容量(WO 02/101026)。GEM顆粒也能夠比機械破壞的細胞壁物質較好 地結合至具體細胞或組織和/或更容易地被其吸收。GEM顆粒能夠靶向巨噬細胞或樹突 狀細胞的能力增強其功能性效能。本發明的非重組的非存活免疫刺激載體複合物因此是 非常適合作為疫苗遞送載體。也參見WO 02/101026和W02004/102199。原則上GEM顆粒能夠由任何革蘭氏陽性細菌製備。革蘭氏陽性細菌的細胞壁包 括肽聚糖層、蛋白、脂磷壁酸和其它改性的碳水化合物的複雜網絡。細菌細胞壁物質的 化學處理可以用於除去細胞壁組分如蛋白和脂磷壁酸而產生改進結合特性的GEM顆粒。 優選本發明的抗原結合免疫刺激載體複合物包含採用酸溶液獲得的GEM顆粒(參見，例 如，WO 02/101026)。在優選的實施方式中，免疫刺激載體由非病原體性細菌，優選食品級細菌或具 有G.R.A.S.(—般認為是安全的)狀態的細菌製備。在一個實施方式中，細胞壁物質衍 生於乳球菌，乳桿菌，芽孢桿菌或分枝桿菌亞種。採用革蘭氏陽性食品級細菌，如乳 球菌，作為疫苗遞送載體，比使用其它細菌，如沙門氏菌或結核分枝桿菌具有顯著的優 點。乳球菌並不會在人體組織中複製或入侵人體組織，據報導，具有較低的內在免疫性 (Norton P.M.et al.1996.FEMS Immunol.Med.Microbiol. 14 167-177)。表達破傷風毒素片 段C的乳球菌，即使在給藥之前已經殺滅載體細菌，在黏膜遞送之後表現出誘發保護小 鼠對抗具有破傷風毒素的致命挑戰的抗體(Norton P.M.et all997.Vaccine 15 616-619)。 相比本文中公開的免疫刺激載體中的非重組GEM顆粒而言，這些細菌，尤其是在大規模 口服免疫化計劃中使用時仍包含將會傳播至環境中的重組DNA。這種重組DNA不可控 地分散至環境中可能具有被其它細菌或其它(微)生物攝取基因的風險。如以上示出的，本發明的一個具體目的是提供一種用於每年重新配製流感疫苗 的通用和靈活系統。由於將多個蛋白質物質結合至免疫刺激載體，對於能夠結合寬範圍 HA亞型的每一物質可能配製成有佐劑(例如，以GEM為基礎的)的流感疫苗，其中所有 三種菌株的HA抗原連接至載體而沒有HA抗原改性的生產方法。因此，在一個實施方式 中，本發明提供了一種載有抗原的免疫刺激載體，包含至少兩個，優選至少三個獨特的HA抗原亞型。優選其包含兩種不同流感A型菌株的HA和一種流感B型菌株的HA。另一方面涉及的藥物組合物包含本文中公開的載有抗原的免疫刺激載體和藥用 載體。例如，其是一種配製用於黏膜給藥，優選鼻內或口服給藥的疫苗組合物。在一個 實施方式中，疫苗是三價流感疫苗，優選用於黏膜給藥的三價流感疫苗。最新使用的流 感疫苗是經由腸道外途徑給藥。然而，鼻內給藥疫苗是受歡迎的，因為流感感染就是始 於上呼吸道中的黏膜位置。這種遞送途徑的益處是黏膜接種更接近天然感染。呼吸道不 僅是流感的感染位置，而且也是對抗流感病毒感染的防禦位置。免疫響應誘導接下來的 鼻內免疫，可以防止病毒在宿主入侵的非常早期階段再黏膜內進行滲透和複製。具體而言，本發明提供了一種佐劑輔助的疫苗。與疫苗共給藥的合適佐劑通常 需要實現強大的對抗入侵病原體的黏膜保護作用。這些佐劑估計可能通過與各種免疫細 胞如巨噬細胞、B-細胞和T-細胞相互作用並激活各種免疫細胞而發揮其免疫刺激效應。 GEM顆粒構成了這種佐劑/載體系統。本發明的載體/佐劑系統，例如，由GEM顆粒 構成。這種顆粒通過Toll樣受體，最具體地但不限於TLR2受體作用於內在免疫系統。 通過TLR，如TLR2的識別導致鼠科動物和人體新生和成熟抗原提呈細胞如樹突狀細胞的 活化和成熟。在臨床前動物研究中，在與多肽抗原混合時甚至在一定程度上GEM顆粒刺 激對蛋白質抗原的系統和局部免疫響應(Audouy S.A.et al.2006.Vaccine 24 5434)。GEM 顆粒提供了黏膜內和腸道外給藥疫苗的佐劑活性。疫苗的黏膜給藥經常，甚至在遠離給 藥位點的位置產生局部抗體響應，例如，鼻內給藥的GEM-基疫苗，在陰道內誘發了分 泌IgA抗體。就流感的情況而言，在呼吸道中的局部響應，對於防止病毒進入體內是很 關鍵的。另外，本發明涉及在需要其的對象中預防流感的方法，包括給予所述對象有效 劑量的本發明藥物組合物。優選地，所述給藥包括在黏膜使用疫苗。例如，對象是如果 感染流感，高危或風險提高的發展成嚴重的威脅生命的疾病的人類對象。危險人群包括 兒童、老年人、健康護理工人、免疫功能低下的個人和患有心臟病的患者。而且，在禽 類和哺乳動物，尤其是人類中(預防性)，禽流感(「鳥類流感」)的(預防性)治療， 也包括在本發明中。


圖1 含有保守流感蛋白片段M2e、由單鏈可變片段(scFv;圖Α)或駱駝化重 鏈(cVH ；圖B)組成的HA-結合結構域和能夠結合至免疫刺激載體的肽聚糖結合結構域 (Protan)的三聚體的示例性蛋白質物質的示意圖。圖2 AcmA重複1 3 ((Rl，R2和R2)禾Π LysM 一致性序列的胺基酸序列。
X表示任何天然胺基酸。破折號(_)表示在所示位置的胺基酸缺失。在一致性序列中帶 下劃線的胺基酸表示參照第9頁文本中高度保守的基序。圖3 包含連接到HA-負載的蛋白質物質的肽聚糖(GEM)的免疫刺激載體的示 意圖。在所示實施方式中，這種物質經由其肽聚糖結合結構域(Protan)、保守的流感膜 蛋白(M2e的三個拷貝)和HA-結合結構域連接至載體。圖4 scHC45-M2e-Protan多肽的胺基酸序列。該多肽包含以下結構域 scHC45 (2-259)、M2e 三聚體(260-332)和 Protan(333-550)。預測的 N_ 糖基化位點以黑體和下劃線示出。圖5:連接子和HA結合(詳細參見文本)的ExperionPro260晶片分析。 條帶1) CHO細胞生產的scHC45-M2e-Protan( 『連接子，)的無細胞上清液； 2)用在CHO細胞中生產的GFP的無細胞上清液培養的GEM; 3)用連接子培養的 GEM ； 4)A/Beijing/262/95 裂解病毒粒子；5) B/Shangdong/7/97 裂解病毒粒子； 6) Vaxigrip2008-2009 流感疫苗(Sanofi Pasteur)。GEM 用7) +A/Beijing/262/95 ； 8)+B/Shangdong/7/97 ； 9)+Vaxigrip 培養。 結合連接子的 GEM 用10)+A/ Beijing/262/95.11)+B/Shangdong/7/97 ； 12)+Vaxigrip 培養。L:具有分子量標記的條 帶，按kDa計的大小指示於左邊。每一條帶顯示1.2和260kDa的條帶，其表示內部系統 峰。scHC45-M2e-Protan連接子的位置指示於右邊(連接子)。不同血凝素(HA)亞型 的位置也指示於右邊。包含GEM顆粒的條帶顯示的黑色染色條帶表示降解的乳球菌蛋 白，指示於右邊(GEM蛋白)。
具體實施例方式實施例1 在CHO細胞中生產scHC45-M2e-Protan連接子，將連接子結合至
GEM顆粒並將HA負載於GEM-連接子複合物上該實施例中描述了 i)將包含HBD、保守的流感肽和IBD(Protan)的連接子多肽 連接至GEM顆粒，和ii)隨後將HA加載到連接至連接子的GEM上。稱之為SCHC45-M2e-Protan的融合蛋白(『連接子，)，在中國倉鼠卵巢細 胞中生產並結合至GEM顆粒。所得的GEM-連接子複合物通過特異性非共價結合 至GEM連接子複合物而用於捕獲溶液中的HA蛋白。scHC45-M2e-Protan多肽包含 HBD(scHC45)、23個胺基酸保守的流感肽(M2e)的三聚體和IBD (Protan)的基因融合。 SCHC45HA結合結構域是由抗體HC45的VL和VH結構域採用「218」 -肽作為VL的 C-端和VH的N端之間的連接子而生產的scFV。CHO細胞在哺乳動物分泌信號之後用 克隆到Invitrogen的pcDNA3.1表達載體的scH45-M2e-Protan的哺乳動物編碼子優化的 DNA序列瞬間轉染。分泌的scHC45-M2e-Protan多肽的所述胺基酸序列描述於圖4中。在除去重組生產細胞之後，scHC45-M2e-Protan連接子通過利用雜合體連接子 中Protan部分而連接至乳球菌GEM顆粒。連接子中的scFV的部分能夠結合HA，由此 將HA固定於GEM顆粒上。菌株和生長條件CHO細胞中的蛋白表達CHO-S 懸浮液細胞(Invitrogen)在用 6mM L-穀氨酸(Gibco Cat.25030)補充的 FreeStyle CHO培養基(Gibco Cat.12651)中培養。細胞在37°C和5% CO2下於IL方瓶中 以IlOrpm保持於CO2搖床培養箱(INFORS)中。細胞以1 X IO5 2X IO5細胞mL—1的 種子密度每3 4天進行次培養。細胞用25kDa PEI (Polysciences Cat.23966)和質粒DNA 的混合物以2X106細胞mL—1的細胞密度瞬間轉染。隨後，培養物在搖動條件下培養6 天，在此時上清液通過1500rpm離心15min進行收集。普通分子生物學構建體的生產
連接子蛋白的DNA-序列根據標準方法克隆至pcDNA3.1 (+)表達載體 (Invitrogen)。構建體包含ATG-起始編碼子前面的Kozak-序列GCCACC。構建體容許 分泌所表達的蛋白。質粒由2.5L大腸桿菌搖瓶培養基製備，平均產率7 12mgDNA。 該DNA是轉染級的，無內毒素。將該DNA以lmg/mL溶解於水中並於_70°C下儲存到使用。GEM的牛產GEM 按照之前的 van Roosmalen et al. (Mucosal 疫苗 deliveryof antigens tightly bound to an adjuvant particle made from food-gradebacteria. (2006) Methods 38 (2) 144-149) 的描述通過熱酸預處理乳酸乳球菌細胞而進行生產。通過用水衝洗ImL樣品而除去PBS 並在真空乾燥之後稱重顆粒物而分三份測定GEM的乾重。 scHC45-M2e-Protan 連接子結合至 GEM在連接子結合至GEM的結合實驗中，在168 μ L磷酸緩衝鹽(PBS)中的2.8mg GEM與來自scHC45-M2e-Protan生產細胞的15mL無細胞上清液混合。10分鐘培養之 後，樣品經過18000Xg離心，顆粒用SOOyLPBS衝洗兩次並再懸浮於總體168μ L的 PBS中。採用Bio-Rad Experion Pro260晶片分析顆粒物中的蛋白(參見圖5)。為了區 分連接子的結合和可能的聚集，採用168 μ L PBS代替GEM作為對照(條帶1)。另外， 實施對照實驗，其中來自生產CHO細胞系的GFP(綠色螢光蛋白)的15mL無細胞上清液 與GEM混合而排出所產生的蛋白非特異性結合(宿主來源的)(條帶2)。條帶3顯示了 scHC45-M2e-Protan (根據 Experion 軟體 155kDa)結合至 GEM。該蛋白在 GEM 用 GFP 培養(條帶2)時和在原始無細胞上清液(條帶1)中都不可見，表明SCHC45-M2e-Protan 多肽特異性結合至GEM，且這種結合是一個濃縮步驟。Protan融合在CHO細胞中產生。 重組生產的蛋白糖基化是一個常見現象。既然Protan結構域包含了 6個公認的糖基化位 點(圖4)，則預期會出現糖基化作用。令人驚訝的是，Protan部分的糖基化作用並不幹 擾其結合至GEM顆粒的能力。HA 與 GEM-scHC45-M2e-Protan 的結合scHC45-M2e-Protan多肽連接至GEM顆粒的血凝素-結合活性進行如下檢測。 連接scHC45-M2e多肽的GEM用來自以下菌株的50 μ g HA培養-A/Beijing/262/95 (HlNl)-B/Shangdong/7/97-Vaxigrip (Sanofi Pasteur) 2008/2009 商購疫苗，含有以下菌株A/Brisbane/59/2007 (HlNl)A/Brisbane/10/2007 (H3N2)B/Florida/4/2006圖5的條帶4，5和6顯示了在Experion Pro260晶片上分析之後用於結合的HA 菌株。作為對照，缺乏連接子多肽的GEM用等量HA培養。培養之後，GEM用500 μ L PBS衝洗2次，再懸浮於總體積168 μ L的PBS中，並在Experion Pro260晶片上進行分 析。在沒有scHC45-M2e-Protan連接子的情況下，沒有觀察到HA結合，分別如條帶7，
8和9所示。在存在GEM scHC45-M2e-Protan連接子複合物的情況下，發生了來自A/ Beijing/262/95, B/Shangdong/7/97 和 Vaxigrip 2008 的 HA 與 GEM-scHC45-M2e_PA 的結合，分別如條帶10，11和12所示。該實驗證實了來自不同流感A菌株的HA能夠採 用雜合多肽連接子scHC45-M2e-Protan固定於GEM顆粒上。令人驚訝的是，流感B菌 株的HA也能固定於包含scHC45-M2e-Protan連接子的GEM上。
綜合起來，這些結果證實，糖基化scHC45-M2e-Protan連接子能夠結合至GEM 顆粒，較寬範圍的不同流感菌株的HA蛋白能夠固定於GEM-連接子複合物上。
權利要求
1.一種蛋白質物質，包含ω至少一個能夠非共價結合至HA的多抗原亞型的血凝素(HA)結合結構域 (HBD)，(ii)保守的流感蛋白、或其抗原片段，和(iii)免疫刺激載體結合結構域(IBD)。
2.根據權利要求1所述的蛋白質物質，其中所述HBD能夠結合至多個源於流感病毒 A型和/或B型的HA亞型。
3.根據權利要求1或2所述的蛋白質物質，其中所述HBD是一種抗體或其功能片段。
4.根據權利要求3所述的蛋白質物質，其中所述HBD包含駱駝化的VH鏈(cVH)。
5.根據權利要求3所述的蛋白質物質，其中所述HBD包含鼠單克隆抗體(mAb)的所 述VH和VL鏈，優選mAb HC45或BH151。
6.根據權利要求5所述的蛋白質物質，其中所述VH和VL鏈是通過抗蛋白酶解的柔 性連接子連接的，優選其中所述連接子包含胺基酸序列Gly-Ser-Thr-Ser-Gly-Ser-Gly-Ly s-Pro-Gly-Ser-Gly-Glu-Gly-Ser-Thr-Lys—Gly。
7.根據前述權利要求中任一項所述的蛋白質物質，其中所述保守的流感蛋白是保守 的核蛋白、保守的基質蛋白或保守的膜蛋白。
8.根據權利要求7所述的蛋白質物質，其中所述保守的流感蛋白是流感膜蛋白的保守 的胞外部分，優選流感病毒A型的M2。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的蛋白質物質，包括所述保守的流感蛋白或其抗 原片段的至少兩個，優選至少三個重複。
10.根據前述權利要求中任一項所述的蛋白質物質，其中所述IBD是包含選自由 LysM結構域、在具有乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)細胞壁水解酶AcmA的C_端(本文 中所述結構域也稱之為AcmA LysM結構域)中的LysM結構域的胺基酸序列資料庫中進 行同源性搜索而檢索得到的胺基酸序列和與AcmALysM結構域顯示出至少70%序列一致 性的序列組成的組中的胺基酸序列的肽聚糖結合結構域。
11.根據權利要求10所述的蛋白質物質，其中所述IBD包含所述乳酸乳球菌細胞壁水 解酶AcmA的所述C-端肽聚糖結合結構域。
12.一種核酸序列，編碼根據權利要求1至11中任一項所述的蛋白質物質。
13.一種載體，包含根據權利要求12所述的核酸序列。
14.一種宿主細胞，包含根據權利要求12所述的核酸序列或根據權利要求13所述的 載體。
15.一種用於提供根據權利要求1至11中任一項所述的蛋白質物質的方法，包括在合 適的培養基中培養根據權利要求14所述的宿主細胞，使得所述物質表達並分離出所述物 質。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述宿主細胞是真核宿主細胞，優選哺乳動物 宿主細胞。
17.根據權利要求1至11中任一項所述的蛋白質物質，包含至少一個N-或O-連接 的聚糖，通過根據權利要求16所述的方法可獲得。
18.—種蛋白質物質，包含融合至糖基化免疫刺激載體結合結構域(IBD)的感興趣多 肽，通過在真核宿主細胞，優選哺乳動物宿主細胞中表達編碼所述物質的核酸構建體可獲得。
19.根據權利要求18所述的蛋白質物質，其中所述糖基化IBD是包含選自由LysM 結構域、在具有乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmA的C-端(本文中所述結構域也稱之為 AcmA LysM結構域)中的LysM結構域的胺基酸序列資料庫中進行同源性搜索而檢索得 到的胺基酸序列和與AcmA LysM結構域顯示出至少70%序列一致性的序列組成的組中的 胺基酸序列的糖基化肽聚糖結合結構域。
20.根據權利要求19所述的蛋白質物質，包含所述乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmA的 糖基化C-端肽聚糖結合結構域。
21.根據權利要求1至11或17中任一項所述的蛋白質物質，其中所述至少一個HBD 結合至HA的抗原亞型。
22.—種具有根據權利要求1至11或17至20中任一項所述的蛋白質物質的免疫刺激 載體。
23.根據權利要求22所述的具有蛋白質物質的免疫刺激載體，是獲自革蘭氏陽性細菌 的不可存活的球形肽聚糖顆粒(GEM顆粒)。
24.根據權利要求23所述的具有蛋白質物質的免疫刺激載體，其中所述細菌是非病 原性細菌，優選食品級細菌，更優選其中所述細菌選自由乳球菌(Lactococcus)、乳桿菌 (Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)和分枝桿菌亞種(Mycobacterium ssp.)組成的組。
25.載有抗原的免疫刺激載體，包含根據權利要求22至24中任一項所述的免疫刺激 載體，其中HA的至少一個抗原亞型結合至所述蛋白質物質的HBD。
26.根據權利要求25所述的載有抗原的免疫刺激載體，包含至少兩個，優選至少三個 不同HA抗原亞型結合至所述HBD。
27.根據權利要求25或26所述的載有抗原的免疫刺激載體，包含兩種不同流感A型 菌株的HA和一種流感B型菌株的HA。
28.一種藥物組合物，包含根據權利要求25至27中任一項所述的載有抗原的免疫刺 激載體和藥用載體。
29.根據權利要求28所述的藥物組合物，是一種配製用於黏膜給藥，更優選鼻內給藥 的疫苗組合物。
30.根據權利要求28或29所述的藥物組合物，是一種適用於人的三價流感疫苗。
全文摘要
本發明涉及免疫學和疫苗領域。具體而言，本發明涉及蛋白質物質及其在對抗由呼吸道病原體引起的感染的疫苗中的應用。
文檔編號C07K16/10GK102015771SQ200980115012
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月22日 優先權日2008年9月22日
發明者戈韋爾特·約翰·施奧藤, 科內利斯·約翰內斯·林豪特施, 馬爾藤·萊昂納德斯·范羅斯馬倫 申請人:繆科西斯私人有限公司