含配糖物的脂質體的製作方法
2023-06-13 21:31:31 2
專利名稱：含配糖物的脂質體的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有可以用作抗癌劑的配糖物的脂質體。
背景技術：
例如在使膽甾醇B環的雙鍵飽和而得到的膽甾烷醇上結合特定的糖鏈的下述膽甾烷醇配糖物(1)具有抑制癌細胞增殖的作用，是可以作為抗癌劑的化合物(參考專利文獻1和2)。
[式中，G表示GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-。]像膽甾烷醇這樣的疏水性化合物由於與細胞膜具有親和性，容易進入細胞，所以這些配糖物可以容易地進入各種癌細胞，充分發揮其效果。然而，由於該配糖物溶解性低，所以難以使用，對於有些腫瘤無法充分發揮其效果。
專利文獻1日本專利特開平11-60592號公報專利文獻1日本專利特開2000-191685號公報發明的揭示本發明的目的在於提供能夠使具有抗腫瘤活性的配糖物更有效地發揮該化合物本身具有的抗腫瘤效果的製劑。
本發明人鑑於所述實際情況，對於具有抗腫瘤活性的疏水性化合物的配糖物進行了其投與方式的各種研究後，發現了可以更有效地發揮該化合物本身具有的抗腫瘤效果的製劑，在至少使用磷脂作為膜脂質、並且使其與正電荷給予物質共存而將該配糖物脂質體化的情況下，由於溶解性低而難以使用的化合物變得可以使用，而且即使對以往直接投與配糖物時幾乎不顯示出效果的腫瘤株也顯示出強的抗腫瘤活性。
即，本發明提供含有配糖物、磷脂和正電荷給予物質的脂質體，所述配糖物為具有抗腫瘤活性且具有GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-作為糖的可以脂質體化的疏水性化合物。
此外，本發明提供含有從下述的式(1)～(3) [式中，G表示GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-，n表示12～26的整數。]中選出的配糖物、磷脂和正電荷給予物質的脂質體。
另外，本發明提供具有該脂質體的抗癌劑。
若採用本發明，則可以提供提高了具有抗腫瘤活性的配糖物的溶解性、該配糖物能更有效地發揮該化合物本身具有的抗腫瘤效果的製劑。尤其，使用膽甾烷醇配糖物(1)的製劑即使對以往直接投與時難以發揮作用的癌細胞也顯示出強的抗腫瘤活性，可以最大限度地發揮該化合物所具有的抗腫瘤作用。
附圖的簡單說明[
圖1]脂質體化GlcNAcβ1，4GalChol的抑制癌細胞增殖的效果的示意圖。圖中，-Lipo表示脂質體。
脂質體化Fucα1，3GalChol的抑制癌細胞增殖的效果的示意圖。圖中，-Lipo表示脂質體。
脂質體化GalβChol的抑制癌細胞增殖的效果的示意圖。圖中，-Lipo表示脂質體。
脂質體化GlcNAcβ1，3Galβ1，1NM和脂質體化GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glcβ1，1神經醯胺的抑制癌細胞增殖的效果的示意圖。圖中，-Lipo表示脂質體。
不同粒徑的脂質體化Fucα1，3GalChol產生的抑制腹膜播散的效果的示意圖。
表示脂質體化GlcNAcβ1，4GalChol的抑制腹膜播散的效果，特別測定了腫瘤形成數的圖。
表示脂質體化GlcNAcβ1，4GalChol的抑制腹膜播散的效果，特別測定了腫瘤重量(g)的圖。
比較脂質體化FucGalChol和單獨投與FucGalChol的抑制腹膜播散的效果，特別測定了腫瘤形成數的圖。
實施發明的最佳方式本發明脂質體所含的配糖物為具有GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-作為糖、以可以脂質體化的疏水性化合物作為苷元的化合物，而且具有抗腫瘤活性。
在這裡，可以脂質體化的疏水性化合物可以例舉例如膽甾醇、神經醯胺、疏水性胺基酸、脂肪酸(油酸、亞油酸、亞麻酸等)、脂溶性維生素等生物體結構成分等和例如萘衍生物(例如萘甲醇)等具有芳環的化合物、膽甾醇衍生物(例如膽甾烷醇)等。其中，較好是神經醯胺、萘衍生物、膽甾醇衍生物，特別好是使膽甾醇B環的雙鍵飽和得到的膽甾烷醇。
此外，糖部分中，GlcNAc-Gal-較好是GlcNAcβ1，3-Galβ-或GlcNAcβ1，4-Galβ-，GlcNAc-Gal-Glc-較好是GlcNAcβ1，3-Galβ1，4-Glc-，Fuc-Gal-較好是Fucα1，3-Gal-，Gal-Glc-較好是Galβ1，4Glcβ-，Gal-較好是Galβ-。
另外，優選的配糖物可以例舉以下的膽甾烷醇配糖物(1)、萘甲醇配糖物(2)和神經醯胺配糖物(3)。
[式中，G表示GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-，n表示12～26的整數。]其中，從抗癌作用的角度來看，膽甾烷醇配糖物(1)是特別理想的，另外，式(1)中優選的化合物可以例舉以下所示的化合物。
(1)G＝GlcNAc-Gal-3-β-膽甾烷基3-O-(2-乙醯胺基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷、3-β-膽甾烷基4-O-(2-乙醯胺基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷、(2)G＝GlcNAc-Gal-Glc-3-β-膽甾烷基4-O-{3-O-(2-乙醯胺基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃半乳糖基}-β-D-吡喃葡萄糖苷、(3)G＝Fuc-Gal-3-β-膽甾烷基3-O-(α-L-吡喃巖藻糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷、(4)G＝Gal-Glc-3-β-膽甾烷基4-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、(5)G＝Glc-3-β-膽甾烷基β-D-吡喃半乳糖苷、本發明的配糖物可以通過從生物體內提取、公知的化學反應或者將它們組合來製造。例如，上述膽甾烷醇配糖物(1)可以通過日本專利特開平11-60592號公報或日本專利特開2000-191685號公報所記載的方法製造，萘甲醇配糖物(2)可以通過J.Biol.Chem.272(41)25608，1997記載的方法製造，神經醯胺配糖物(3)可以通過從人紅血球、肝臟、消化管黏膜、胎糞等提取得到。
該配糖物具有抗腫瘤活性，本說明書中具有抗腫瘤活性，在體內是指對至少1種癌症可以發揮抗腫瘤效果；在體外是指對至少1種癌細胞株具有阻礙增殖的活性或抑制增殖的活性。
本發明脂質體中，配糖物相對1摩爾磷脂較好是含有0.3～2.0摩爾，更好是0.8～1.5摩爾。
本發明的脂質體中，至少使用磷脂作為膜成分脂質。
所述磷脂可以例舉二月桂醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯膽鹼、二亞油醯磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯棕櫚醯磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯硬脂醯磷脂醯膽鹼、棕櫚醯花生醯磷脂醯膽鹼等磷脂醯膽鹼類，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯肌醇，磷脂酸等，它們可以是天然的，或通過半合成或者全合成得到。此外，還可以使用加氫磷脂等終修飾的磷脂。所述磷脂可以單獨使用，也可以2種以上混合使用。
其中，從可以形成電中性且穩定的脂質體的角度來看，較好是使用磷脂醯膽鹼類，特別好是使用1α二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)。
正電荷給予物質是為了使脂質膜的表面帶有正電荷而添加的物質。通過使脂質體的表面帶有正電荷，可以期望能容易與膜表面處於負電荷狀態的細胞接觸。
正電荷給予物質可以例舉硬脂胺、油胺等脂肪族胺，芴乙基胺等芳族胺，其中較好是脂肪族胺，特別好是使用硬脂胺。
正電荷給予物質相對1摩爾磷脂較好是含有0.04～0.15摩爾，更好是0.1～0.15摩爾。
本發明的脂質體中，除了上述成分之外，可以根據需要加入膽甾醇、脂肪酸、二乙醯磷酸酯等作為膜結構的穩定劑。
分散膜成分的水溶液較好是使用水、生理鹽水、各種緩衝液、糖類的水溶液或它們的混合物。緩衝液可以適當地使用不論有機類或無機類的在體液氫離子濃度附近具有緩衝作用的緩衝液，可以列舉例如磷酸緩衝液。
本發明脂質體的製備沒有特別限定，根據常規方法進行即可。按照例如日本專利特開昭57-82310號公報、日本專利特開昭60-12127號公報、日本專利特開昭60-58915號公報、日本專利特開平1-117824號公報、日本專利特開平1-167218號公報、日本專利特開平4-29925號公報、日本專利特開平9-87168號公報、Methods of Biochemical Analysis(1988)33，p337或者《脂質體(リポソ一ム)》(南江堂)中所記載的方法進行即可。
以下，對基於日本專利特開平9-87168號公報所記載的方法的本發明脂質體的製備工序進行說明。
首先，向本發明的配糖物、磷脂和正電荷給予物質加有機溶劑和水混合後，用旋轉蒸發器等將有機溶劑完全除去，接著進行水分的除去。這時，膜成分物質、正電荷給予物質和配糖物的混合比例可以例舉例如52∶8∶20(摩爾比)，只要是與其近似的混合比例都沒有問題。配糖物的混合比例小的情況下，可以根據需要添加以膽甾醇為代表的膜結構穩定劑，但如果該混合比例高，則不一定需要添加膜結構的穩定劑。
有機溶劑只要是水不溶性的揮發性有機溶劑，沒有特別限定，可以使用例如三氯甲烷、氯甲烷、苯和己烷等，若考慮到溶解性，可以使用適當添加乙醇或甲醇等極性較強的有機溶劑配製的混合有機溶劑。該混合有機溶劑和水的混合比例只要是達到均一的比例，沒有特別限定。
此外，添加水分製備時，水分除去方法一般使用冷凍乾燥法，但並不局限於此，可以在減壓乾燥器中乾燥。水分除去後，添加前述的分散水溶液，通過用渦流混合器等浸滲而實現脂質體化。
本發明脂質體的粒徑從腫瘤抑制效果方面來看，較好是在10μm以下，更好是在3μm以下。
使脂質體的尺寸一致時，可以通過例如超聲波處理、經多孔濾膜的擠壓處理、用高壓噴射乳化裝置的處理或者組合這些處理實現尺寸的均一化。此外，要得到更小的脂質體粒子的情況下，可以通過例如延長超聲波處理時間來實現。
因此，如後述實施例所示，製備的本發明脂質體具有極其優異的抑制癌細胞增殖的作用。尤其，對於膽甾烷醇配糖物(1)，即使對以往直接投與時難以發揮作用的癌細胞也顯示出強的抗腫瘤活性。脂質體一般是形成磷脂雙層膜的小胞球，是為了以將藥劑包裹在內部的形式分散、通過與細胞融合使藥劑達到細胞內而製作的，所以藥劑自身的性質不能因脂質體化而改變。因此，通過將該膽甾烷醇配糖物脂質體化使該化合物的抗腫瘤活性大幅提高完全是意外。
由此，含有該脂質體的製劑可以用作更有效地發揮配糖物本身具有的抗腫瘤效果的抗癌劑。
本發明的抗癌劑根據治療部位、治療目的可以選擇適當劑型，只要是沒有使用損害脂質體形狀的穩定性的添加劑等，可以按照公知的製備方法製成例如口服劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、貼劑等。
製備口服用固體製劑時，可以向本發明的脂質體加入賦形劑，根據需要加入粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、調味劑、除臭劑等後，通過常規方法製造片劑、包衣片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等。這樣的添加劑可以是本領域中一般所使用的，例如，賦形劑可以例舉乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、澱粉、碳酸鈣、高嶺土、微晶纖維素、矽酸等，粘合劑可以例舉水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖液、澱粉液、明膠液、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基澱粉、甲基纖維素、乙基纖維素、蟲膠、磷酸鈣、聚乙烯吡咯烷酮等，崩解劑可以例舉乾燥澱粉、藻酸鈉、瓊脂粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸甘油一酯、乳糖等，潤滑劑可以例舉精製滑石、硬脂酸鹽、硼砂、聚乙二醇等，調味劑可以例舉蔗糖、橙皮、檸檬酸、酒石酸等。
製備口服用液體製劑時，可以向本發明脂質體加入調味劑、緩衝劑、穩定劑、除臭劑等，通過常規方法製造內服液劑、糖漿劑、酏劑等。這時，調味劑可以是上述例舉的，緩衝劑可以例舉檸檬酸鈉等，穩定劑可以例舉西黃蓍膠、阿拉伯樹膠、明膠等。
製備注射劑時，可以向本發明脂質體加入pH調節劑、緩衝劑、穩定劑、等滲劑、局部麻醉劑等，通過常規方法製造皮下、肌肉和靜脈注射劑。這時的pH調節劑和緩衝劑可以例舉檸檬酸鈉、醋酸鈉、磷酸鈉等。穩定劑可以例舉焦亞硫酸鈉、EDTA、巰基乙酸、硫代乳酸等。局部麻醉劑可以例舉鹽酸普魯卡因、鹽酸利多卡因等。等滲劑可以例舉氯化鈉、葡萄糖等。
製備栓劑時，可以向本發明脂質體加入公知的製劑用載體，例如聚乙二醇、含水羊毛脂、可可豆脂、脂肪酸甘油三酯等，再根據需要加入ツイ一ン(註冊商標)之類的表面活性劑等後，通過常規方法製造。
製備軟膏劑時，可以向本發明脂質體根據需要加入通常所使用的基質、穩定劑、溼潤劑、防腐劑等，通過常規方法混合、製劑化。基質可以例舉液體石蠟、白色凡士林、白蠟、辛基十二烷醇、石蠟等，防腐劑可以例舉對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯等。
製備貼劑時，通過常規方法在通常的支承體上塗布所述軟膏、乳膏、凝膠、糊料等即可。作為支承體，可以是由棉、人造棉、化學纖維構成的織物、非編織物和軟質聚氯乙烯、聚乙烯、聚氨酯等薄膜或者發泡體片。
本發明抗癌劑的投與量根據患者的症狀、體重、年齡、性別等而不同，不能一概而論，作為膽甾烷醇配糖物(1)，通常成人每天是約0.01～200mg/Kg，較好是0.1～50mg/Kg，較好是將其一天一次或分成2～4次投與。
實施例以下，通過實施例對本發明進行詳細說明。
實施例1膽甾烷醇配糖物的脂質體化膽甾烷醇配糖物使用所述式(1)中的G為GlcNAcβ1，4Gal的「GlcNAcβ1，4GalChol」、G為Fucα1，3Gal的「Fucα1，3GalChol」、G為Galβ的「GalβChol」以及作為對照的G為H的「Chol」，將它們的20μmol/ml(以三氯甲烷/甲醇＝5/1，v/v溶解)溶液作為初始物質。
將1α二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、硬脂胺和上述的膽甾烷醇配糖物以52/8/20(摩爾比)的比例混合成700μl，接著添加300μl有機溶劑(三氯甲烷/甲醇＝2/1，V/V)和1ml蒸餾水，並混合。然後，用旋轉蒸發器將有機溶劑完全除去後，進行冷凍乾燥操作，將水分完全除去。該冷凍乾燥品溶解於1mlPBS中，通過進行超聲波處理(15W，15分鐘)將脂質體均一化到粒徑2-4μm左右，供實施例2和3使用。
實施例2萘甲醇配糖物的脂質體化萘甲醇配糖物使用所述式(2)中的G為GlcNAcβ1，4-Galβ1，1-的「GlcNAcβ1，4Galβ1，1NM」(NM萘甲醇)，以與膽甾烷醇配糖物的脂質體化同樣的條件進行脂質體化。
實施例3神經醯胺配糖物的脂質體化神經醯胺配糖物使用所述式(3)中的G為GlcNAcβ1，3-Galβ1，4-Glc-的「GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glcβ1，1神經醯胺」，以與膽甾烷醇配糖物的脂質體化同樣的條件進行脂質體化。但是，該脂質體化的情況下添加膽甾醇作為穩定劑。
實施例4脂質體化膽甾烷醇配糖物產生的抑制細胞增殖的效果將培養癌細胞株(colon26wild)以1×104細胞/100μl/孔接種到96孔板中後，添加膽甾烷醇配糖物(GlcNAcβ1，4GalChol、Fucα1，3GalChol、GalβChol、Chol)和實施例1中所得到的脂質體化膽甾烷醇配糖物，在37℃下培養3天。然後，進行MTT試驗確定細胞數。根據以下的式子求得增殖抑制率。
細胞增殖抑制率(CPI率)(％)＝(1-處理細胞的OD/未處理細胞的OD)×100由結果可知，單獨幾乎不顯示效果的Fucα1，3GalChol通過脂質體化顯示出了顯著的抑制細胞增殖的效果。此外，以往顯示出抑制細胞增殖的效果的GlcNAcβ1，4GalChol經脂質體化顯示出了更強的抑制細胞增殖的效果(圖1、2和3)。
實施例5脂質體化萘甲醇配糖物和脂質體化的神經醯胺配糖物產生的抑制細胞增殖的效果將培養癌細胞株(colo201)以1×104細胞/100μl/孔接種到96孔板中後，添加實施例2和3中所得到的脂質體化萘甲醇配糖物和脂質體化神經醯胺配糖物，在37℃下培養3天。然後，進行MTT試驗確定細胞數。與實施例4同樣地求得增殖抑制率。
由結果可知，由於不溶解而單獨幾乎不顯示效果的GlcNAcβ1，4Galβ1，1NM和GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glcβ1，1神經醯胺通過脂質體化顯示出了顯著的抑制細胞增殖的效果(圖4)。
實施例6脂質體化膽甾烷醇配糖物產生的抑制腹膜播散的效果(1)脂質體化Fucα1，3GalChol的粒徑產生的影響對Balb/c小鼠(8周齡，雌)將癌細胞株(colon26wild，5×104細胞/200μl)投與腹腔內。接著，在12小時、24小時和48小時後將以不同的超聲波處理時間(15W×5，10，15分鐘)配製的脂質體化Fucα1，3GalChol(2μmol/100μl)投與腹腔內。10天後，對腸繫膜中的腫瘤數進行測定。超聲波處理時間越長、脂質體粒徑越小，則越表現出抑制腹膜播散的效果(圖5)。
(2)脂質體化GlcNAcβ1，4GalChol的抑制腹膜播散的效果對Balb/c小鼠(8周齡，雌)將癌細胞株(colon26wild，5×104細胞/200μl)投與腹腔內。接著，在24小時和48小時後將通過超聲波處理(15W，15分鐘)配製的脂質體化GlcNAcβ1，4GalChol(2μmol/100μl)投與腹腔內。10天後，對腸繫膜中的腫瘤數進行測定，21天後對大網膜和腸繫膜上形成的腫瘤重量進行測定。由其結果可知，投與脂質體化GlcNAcβ1，4GalChol表現出良好的抑制腹膜播散的效果(圖6和7)。
(3)脂質體化FucGalChol和單獨投與FucGalChol的抑制腹膜播散的效果的比較對Balb/c小鼠(8周齡，雌)將癌細胞株(colon26wild，5×104細胞/200μl)投與腹腔內。接著，在0、24和48小時後將通過超聲波處理(15W，15分鐘)配製的脂質體化FucGalChol和FucGalChol(都是2μmol/100μl)分別投與腹腔內。10天後，對腸繫膜中形成的腫瘤數進行測定。
由其結果可知，與未處理、FucGalChol投與組相比，脂質體化FucGalChol投與組中，腫瘤的形成被更強地抑制(圖8)。
權利要求
1.脂質體，其特徵在於，含有配糖物、磷脂和正電荷給予物質，所述配糖物為具有抗腫瘤活性、且具有GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-作為糖的可以脂質體化的疏水性化合物。
2.脂質體，其特徵在於，含有從下述的式(1)～(3) 中選出的配糖物、磷脂和正電荷給予物質，式中，G表示GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-，n表示12～26的整數。
3.如權利要求1或2所述的脂質體，其特徵還在於，正電荷給予物質是脂肪族胺。
4.抗癌劑，其特徵在於，含有權利要求1～3中的任一項所述的脂質體。
全文摘要
本發明提供能夠用作抗腫瘤劑的、可以最大限度地發揮膽甾烷醇配糖物的效果的製劑。即，本發明涉及含有配糖物、磷脂和正電荷給予物質的脂質體，所述配糖物為具有抗腫瘤活性、且具有GlcNAc－Gal－、GlcNAc－Gal－Glc－、Fuc－Gal－、Gal－Glc－或Gal－作為糖的可以脂質體化的疏水性化合物。
文檔編號C07J17/00GK1822844SQ20048002040
公開日2006年8月23日 申請日期2004年7月15日 優先權日2003年7月17日
發明者矢澤伸, 高井泉, 西村東洋 申請人:大塚製藥株式會社