蠶豆染色病毒檢測用引物的製作方法
2023-06-13 05:04:51 2
專利名稱：蠶豆染色病毒檢測用引物的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及蠶豆染色病毒檢測用 引物。
背景技術：
蠶豆染色病毒CSraad ^朋svz>w ， BB SV)是豇豆花葉病毒屬 (Cww Wmy)重要病毒之一，主要自然寄主為豆科植物。BBSV易 於汁液傳播和種子傳播，種傳率可達10%。由於BBSV可引起嚴重 經濟損失，我國一直將其列入《進境植物檢疫性有害生物名錄》，是 重要的檢疫性病毒。國內外學者對該病毒的研究較少，甚至沒有公 開的基因序列，因此一直沒有針對BBSV的分子檢測方法。2006年， 國家科技支撐計劃項目一 《潛在入侵物種偵測技術研究》將BBSV 檢測方法作為子課題中研究內容之一，目的是填補多年來這一重要 檢疫性病毒缺少分子檢測方法的空白，提高口岸防範BBSV的技術 水平。本申請發明人在國際上首次測定了 BBSV外殼蛋白基因序列， 設計特異性引物，通過反轉錄(reverse transcription, RT)和聚合酶 鏈式反應技術(polymerase chain reaction, PCR)建立了 BBSV的 RT-PCR檢測方法，反應結束後根據特異性擴增DNA片段的位置判 定結果。
發明內容
本發明目的在於提供用於蠶豆染色病毒RT-PCR檢測的引物序列。
本發明通過分析已報導的BBSV外殼蛋白基因序列，設計BBSV 特異性引物。所述的引物對由正向和反向引物組成，其核苷酸序列 如序列表SEQIDNo.l&2所示。
本發明還進一步給出了應用上述引物的RT-PCR檢測方法，其 以樣品總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，反應結束後根據特異性 擴增的499bpDNA片段判定結果。
具體地說本發明以樣品總RNA為模板，進行RT-PCR反應。 RT-PCR反應包括反轉錄和PCR擴增兩個過程。
首先在20pL反應體系進行反轉錄反應，即在0.2mL的反應管 中加入6.75 |iL DEPC處理水，4 pL總RNA， 1 pL BBSV-SCPr ( 10 pmol/L )， 1 dNTP ( 10謹ol/L )，混勻後於65 °C保持5 min，迅 速轉移到冰上驟冷5min;然後向反應管中加入2 DTT (0.1 mmol/L)， 4pL5x反轉錄緩衝液，1^iLRNA酶抑制劑(40U4iL)， 0.25 pL反轉錄酶(200U/nL)， 42。C反應50min; 72 。C 15min滅活 反轉錄酶後獲得反轉錄產物cDNA。
PCR反應體系為50fiL，即在0.2mL的PCR反應管中加入30.5 |iL DEPC處理水，2 pL cDNA, 2 pL BBSV-SCPf ( 10 (imol/L )， 2 pL BBSV-SCPr (10 pmol/L), 10xPCR緩衝液5 pL， 8 |iL dNTP (2.5 mmol/L )， 0.5 pL DNA聚合酶(5 U/(xL )。反應條件為94 °C, 5 min; 94 °C 30 s, 54 °C 45 s, 72 °C 1 min，共30個循環；72 °C延伸5 min。
進一步，還可以將本發明引物及相關試劑組裝成試劑盒，以方 便使用。
本發明根據蠶豆染色病毒外殼蛋白基因序列設計引物，該引物 可用於BBSV的RT-PCR檢測。本發明檢測方法能夠快速準確地判 斷樣品是否有BBSV，為進出口安全提供了保證。
圖1是BBSVRT-PCR方法的特異性試驗結果。1-IO為顯症葉 片的檢測結果，11-13為健康葉片的檢測結果。
圖2是BBSV RT-PCR方法的靈敏度試驗結果。1-6為發病樣 本，50 反應體系中總RNA分別為5 pL， 4 pL， 3 ^L， 2 ^L, 1 0.具體實施例方式
下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明 的範圍。
實施例l引物設計和合成
根據BBSV外殼蛋白基因序列(登陸號FJ028650)，釆用引物設
計軟體Primer 5.0設計引物，引物序列為
BBSV-SCPf (正向)5，- Tgg CAA gTC ACA gTT CgC -3， BBSV-SCPr (反向)5，-CgC CTC TTT ggTTTC ACg-3，
實施例2總RNA的提取
1) 取0,2g發病葉片，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，移入 滅菌的1.5 ml離心管中，然後加入1 ml的Trizol試劑，劇烈震蕩搖 勻；
2) 室溫下保持5min,加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 s,然後在 室溫下保持2-15min後，4°C， 12000 g離心15 min;
3) 將上層水相轉移到新的1.5ml離心管中，加0.5ml異丙醇， 顛倒混勻，室溫下保持15min;
4) 4°C, 12000 g離心10 min, RNA就會在管的側壁和底部形 成沉澱；
5) 倒掉上清液，加入75%的乙醇洗滌沉澱，然後4匸，7500g 離心5min (如沉澱懸浮起來，則用12000g),棄去乙醇；
6 )沉澱於室溫下充分乾燥後，溶於40dH20 ( DEPC處理) 中，-20°。保存備用。 實施例3 RT-PCR擴增方法的建立
以總RNA為模板，進行RT-PCR反應。20(iL反應體系進行反 轉錄反應，即在0.2mL的反應管中加入6.75pLDEPC處理水，4 總RNA， 1 BBSV-SCPr ( 10 jimol/L )， 1 dNTP ( 10 mmol/L )，
混勻後於65 °C保持5 min，迅速轉移到冰上驟冷5min;然後向反 應管中加入2 DTT (0.1 mmol/L)， 4 5x反轉錄緩衝液，1 RNA酶抑制劑(40U/pL)， 0.25 nL反轉錄酶(200U L), 42。C反 應50min; 72 °C 15 min滅活反轉錄酶後獲得反轉錄產物cDNA。
PCR反應體系為50|iL，即在0.2mL的PCR反應管中加入30.5 ^LDEPC處理水，2pLcDNA， 2 BBSV畫SCPf ( 10 |imol/L )， 2 pL BBSV誦SCPr (10 pmol/L), 10xPCR緩衝液5 pL， 8 [iL dNTP (2.5 mmol/L ), 0.5 pL DNA聚合酶(5 U/pL )。反應條件為94 °C ， 5 min; 94 °C 30 s, 54 °C 45 s， 72 °C 1 min,共30個循環；72 °C延伸5 min。
PCR反應結束後根據特異性擴增的499 bp DNA片段判定樣品 中是否含有BBSV。
實施例4 BBSVRT-PCR方法的特異性確定
取不同病症葉片IO份，健康葉片3份，按實施例2方法分別提 取總RNA,再按實施例3的方法進行RT-PCR擴增，凝膠電泳檢測 結果。結果病症葉片中均檢出499bpDNA片段，健康葉片中均未檢 出。檢測結果如圖1所示。表明建立的RT-PCR方法具有良好的特 異性，可用於BBSV的檢測。
實施例5 BBSVRT-PCR方法的靈敏度確定
使用l ml的Trizol試劑從0.2 g發病葉片中提取總RNA，用40 pL DEPC處理水溶解總RNA,進行相對靈敏度檢測。在50 ^L反應體系中， 總RNA分別為5 4 ^L, 3 ^L, 2 ^L, 1 ^L， 0.5 pL。檢測結果如圖2所 示。表明建立的RT-PCR方法可從0.5 pL總RNA中成功檢測出BBSV。
具有較高的靈敏度，符合檢測的要求。
序 列 表
〈110〉廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，中國檢驗檢疫科學研究院 <120〉蠶豆染色病毒檢測用引物 〈130〉 <160〉 2
Patentln version 3. 5
〈210> 1
〈211〉 18
畫 〈213〉人工序列
〈400〉 1
tggcaagtca cagttcgc 18
<210〉 2
18
飄 <213〉人工序列
〈400〉 2
cgcctctttg gtttcacg 18
權利要求
1.一種蠶豆染色病毒檢測用引物，其核苷酸序列為BBSV-SCPf5』-Tgg CAA gTC ACA gTT CgC-3』BBSV-SCPr5』-CgC CTC TTT ggT TTC ACg-3』
2、 一種檢測蠶豆染色病毒的方法，該方法以樣品總RNA為模 板，利用權利要求1所述的引物進行RT-PCR擴增，反應結東後凝 膠電泳檢測擴增產物，根據特異性擴增DNA片段的位置判定結果。
3、 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，RT-PCR的反應過 程中反轉錄反應的溫度為42°C， PCR擴增的退火溫度為54°C，延伸 溫度為72°C。
4、 含有權利要求l所述蠶豆染色病毒檢測用引物的試劑盒。
5、 權利要求l所述的引物在蠶豆染色病毒檢測中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種蠶豆染色病毒檢測用引物，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本發明還進一步提供了檢測蠶豆染色病毒的方法，該方法以樣品總RNA為模板，利用本發明特異性引物進行RT-PCR擴增，反應結束後凝膠電泳檢測擴增產物，根據特異性擴增DNA片段的位置判定結果。本發明引物特異性好，檢測方法快速準確，為進出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/68GK101368218SQ200810223788
公開日2009年2月18日 申請日期2008年10月13日 優先權日2008年10月13日
發明者朱水芳, 李桂芬, 趙文軍, 青 陳, 陳洪俊, 陳紅運 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;中國檢驗檢疫科學研究院