一種抑制血栓形成的藥物的製作方法

2023-06-13 14:58:56 1

專利名稱：一種抑制血栓形成的藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物，特別涉及一種抑制血栓形成的藥物。
背景技術：
血栓性疾病可見於臨床各科患者，尤其是心腦血管血栓性疾病，已位於我國人口病死原因的第一位，而且發病率有增加趨勢，嚴重危害人類健康。抗血小板藥阿司匹林、噻氯匹定和抗凝血藥肝素、法華林在血栓性疾病的預防和治療中發揮了很大的作用。但這些藥物也存在局限性，特別是對缺血性心血管病和出血併發症的療效作用還有待提高。隨著對血栓性疾病發病機制的深入研究，近來在所謂第二代藥物之外，又出現了許多新的抗血小板藥和抗凝藥(如表1)(Gresele P，et al.Novel approachesto the treatment of thrombosis.Trends Pharmacol Sci 2002；2325-32)。
表1.抗血栓形成藥物抗血小板藥 抗凝血藥第一代阿司匹林肝素噻氯匹定(力抗栓)、氯吡格雷 法華林第二代GPIIb/IIIa拮抗劑低分子量肝素阿司匹林-氯吡格雷混合劑 水蛭素新方法vWF-GPIb相互作用抑制劑 組織因子-VIIa因子途徑抑制劑膠原-血小板相互作用抑制劑 選擇性因子Xa抑制劑凝血酶誘導的活化抑制劑 選擇性凝血酶抑制劑ADP受體拮抗劑 人活化蛋白C釋放NO的抗血小板物質可溶性重組血栓調節素縮寫GP，糖蛋白；vWF，yon Willebrand因子血小板膜表面糖蛋白Ibα(GpIbα)與vWF的結合引起的血小板與受損血管內皮的粘附，在初期止血和血小板血栓形成中起著至關重要的作用。
血小板膜表面存在有多種糖蛋白，其中GPIbα是血管假性血友病因子(vonWillebrand factor，vWF)凝血酶、P-選擇素、Mac-1、XII因子和高分子量激肽原的受體，在非活化血小板表面就已表達。GPIbα的分子量約為135000，每個細胞表面大約有30,000個分子，主要分布於血小板、巨核細胞中，屬富亮氨酸糖蛋白重複片段(LGR)家族，由610個胺基酸組成，GPIbα與vWF結合區位於GPIbα的氨基端(1-302胺基酸)。
血小板粘附於血管內皮下組織涉及三個因素GPIb，vWF及內皮下組織；在血液循環中，血小板並不粘著在血管壁上，也不同其他細胞發生相互作用，而是在近管壁的流層流動；當血管受損時，內皮下組織暴露，血小板迅速粘著於暴露的內皮下組織參與止血反應的第一步。GPIbα是參與粘附作用的主要粘附受體，參與多種生理和病理過程，包括在血管損傷處的黏附，與凝血酶的結合，Bernard-Soulier綜合症(BSS)或稱巨血小板症候群，血小板型血友病及免疫性血小板減少等(Chester Q.Li，etal.Expression of the Amino-Terminal Domain of Platelet Glycoprotein IbαExploitation of a Calmodulin Tag for Determination of Its FunctionalActivity.Protein Expression and Purification 200122200-210)。
正常情況下血小板不能與血管內皮組織結合，血管受損後，vWF首先結合於內皮下膠原纖維，以致vWF發生構型改變，此時血小板GPIb即與vWF結合活化血小板，發揮粘附作用，同時釋放ADP，提高胞質中鈣離子濃度，活化鈣離子依賴的GPIIb-IIIa，暴露出纖原受體，一個纖原可以同時和至少兩個GPIIb-IIIa結合，導致血小板的黏附和聚集(Goto S，et al.Distinct mechanisms of platelet aggregationas a consequence of different shearing flow conditions.J Clin Invest.1998.101479)，形成白色血栓(Sugimoto M，et al.Functional property of vonWillebrand factor under flowing blood.Int J Hematol 2002.7519-24；RuggeriZM.Von Willebrand factor.Curr Opin Hematol 2003.10142-149)。這一過程如圖1所示。
GPIb和vWF的相互作用對血小板黏附、聚集而後形成血栓起著關鍵的作用，因而，許多研究致力於以二者為靶點的新的抗血栓藥物的研製和開發。血栓的治療可通過以下兩條途徑抑制vWF和GPIb的相互作用來實現(1)封閉血小板上的GPIbα；(2)特異性結合vWF。目前國外研究的vWF-GPIb相互作用抑制劑有6B4單抗的F(ab』)2片段(GPIb抗體)(Cauwenberghs N.et al.Antithrombotic effect of plateletglycoprotein Ib-blocking monoclonal antibody Fab fragments in non humanprimates.Arterioscler Thrombo Vasc BIol 2000.201347-1353)、AjvW2單抗(GPIb抗體)(Kageyama S.et al.Antinuman yon Willebrand factor monoclonal antibodyAjvW-2 prevents thrombus deposition and neointima formation after ballooninjury in guinea pigs.Arterioscler Thrombo Vasc BIol 2000.202303-2308)、重組vWF片段VCL(Gralnick HR.et al.A monomeric von Willebrand factor fragment，Leu504-Lys728，inhibits von Willebrand factor interavtion with glycoproteinIb-IX.Proc Natl Acad Sci 1992.897880-7884)、重組vWF片段AR545C(GurevitzO.et al.Recombinant von Willebrand factor fragment AR545C inhibits plateletaffregation and enhances thrombolysis with rtPA in a rabbit thrombosis model.Arterioscler Thrombo Vasc BIol 1998.18200-207)和黃酮類化合物(Murk JS.etal.Flavone-8-acetic acid(flavonoid)profoundly reduces platelet-dependentthrombosis and vasoconstriction after deep arterial injury in vivo.Circulation 2000.101324-328)等。
基於GPIbα在血小板膜上分布相對較多，並且在血小板與血管壁粘附作用和血栓形成中起著至關重要的作用，使得GPIbα成為研究血小板相關藥物的重要靶點之一。目前製備的許多GPIb抗體在體外穩定或者流動條件下都能有效的發揮抑制作用。在兩例以豚鼠為動物模型的體內研究成功的報導中，6B4和AjvW2證實能夠在不明顯延長出血時間的情況下延長小動脈血管血栓形成的時間。在另一例豚鼠模型中，PG-1抗體可以有效的減少雷射損傷處的血栓形成，但這個抗體雖然能夠特異性的結合豚鼠血小板卻不能與人血小板發生交叉反應。另有研究數據表明，TGX-6B4 Fab段抑制劑能夠與GPIbα氨基端(His1-Val289)抗原決定簇結合，阻斷瑞斯託黴素或布妥黴素誘導的血小板聚集。重要的是在治療劑量，這個抗體能夠抑制血小板的粘附而不發生嚴重的血小板減少症，同時沒有延長出血時間。TGX-6B4的進一步研製有可能提供一種抗血栓形成的輔助用藥。總的來說，GPIb抗體到目前為止還不理想，部分可能是由於種屬的不同，例如，鼠抗人單抗長期應用會產生人抗鼠抗體反應，因此限制了6B4和AjvW2在人體的應用，也可能是由於二價抗體與GP1b分子交聯導致嚴重的血小板減少症造成的。
另一方面，由於大量數據表明血漿vWF水平的升高與血栓栓塞性疾病的發生有關，所以很多研究致力於研究VWF分子GPIb結合區的重組片段及VWF的抑制劑。重組vWF片段VCL(Leu504-Lys728)和AR545C(Ala444-Asp730)可與GPIb結合，而且這兩個片段的抗栓劑量對於出血時間只有輕微的延長。由此可以看出，其他膜蛋白如GPIa/IIa和GPIIb-IIIa等，都參與了血栓的形成。由於這種GPIb抑制劑阻止血小板黏附，延緩血栓形成，但不阻止血栓形成，因此需要與阿司匹林或溶栓藥合用。由於vWF是由內皮細胞和巨核細胞產生的一種糖蛋白，在內皮細胞受到刺激時釋放入血漿，故血漿vWF水平的升高可作為內皮細胞受損的標誌。已有大量數據證實多種血管病變，如糖尿病的血管病變，血漿vWF水平升高，vWF可與GPIb、GPIIb-IIIa、凝血因子VIII、纖維連接蛋白、膠原結合，促進血小板在內皮下的黏附，誘導血小板的聚集，促進血栓形成。因此，對血漿vWF水平升高這一類的血管病變，重組vWF片段的作用有限。
Plaimauer B等(Plaimauer B.et al.Cloning，expression，and functionalcharacterization of the von Willebrand factor-cleaving protease(ADAMTS13).Blood 2002.1003626-3632)克隆了vWF裂解蛋白酶(ADAMTS13)的基因，並在HEK293細胞中進行了表達，在體外可裂解vWF多聚體，並可被血栓性血小板減少性紫癜患者的血漿(含有該酶的抑制劑，IgG)所抑制。但該酶的抗栓作用還未得到證實。
發明創造內容本發明的目的是提供一種以vWF為作用靶點的抑制血栓形成的藥物。
本發明所提供的抑制血栓形成的藥物，它的活性成分是序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列，或者是將SEQ ID №2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。
SEQ ID №2的胺基酸殘基序列，名稱為重組血小板糖蛋白rGP302，由324個胺基酸殘基組成，包括血小板糖蛋白GPIbα的vWF結合域，可與vWF結合。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發明的藥物可以製成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。
上述藥物的用量一般為0.1μg-1000mg/kg/day療程為10至30天。
本發明的第二個目的是提供一種重組血小板糖蛋白rGP302的編碼基因。
重組血小板糖蛋白rGP302的編碼基因，是下列核苷酸之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1109個鹼基組成，該基因的讀碼框為自5』端第17位到第1105位鹼基，包含1089個鹼基。
重組血小板糖蛋白rGP302與血漿中和內皮下的vWF結合後，可使vWF不能與血小板上的GPIb結合，從而阻斷血小板在內皮下的黏附。同時vWF與GPIIb-IIIa的結合也會受到影響，並進一步影響血小板的聚集功能，從而達到防止血栓形成的目的。實驗表明，體外可溶性rGP302能夠抑制瑞斯託菌素誘導的血小板凝集，延長凝血時間，血小板聚集率由對照的100％降低至13％。
本發明為血栓性疾病的預防和治療提供了一種新的思路和方法，從而為進一步的理論研究和製備新型抗血栓藥物奠定了基礎，具有重要的意義。


圖1為血小板黏附和聚集過程的示意2為GPIbα的vWF因子結合域的cDNA的RT-PCR的電泳3為真核表達質粒pcDNA3.1(+)圖4為真核表達質粒pSecTaq2/HygroB圖5為鑑定真核表達質粒pGP302的電泳6為可溶性rGP302的dot blot結果圖7為可溶性rGP302的Westernblot結果圖8a為Ristocetin誘導的血小板聚集曲線圖8b為CHO-空載體表達蛋白血小板聚集曲線圖8c為CHO-pGP302重組蛋白的血小板聚集曲線具體實施方式
實施例1、重組血小板糖蛋白rGP302的製備重組血小板糖蛋白rGP302的製備，包括以下步驟1、設計引物上遊5』-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3』下遊5』-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3』為便於基因定向插入表達載體pcDNA3.1(+)(Invitro公司產品)，在上遊引物中引入BamH I酶切位點序列，在下遊引物中引入EcoR I酶切位點序列。
2、自人紅白血病細胞系TF-I細胞株(CRL-2003 Homo sapiens(human)TF-1)中提取細胞總RNA。
3、利用下述的上、下遊引物，以提取的細胞總RNA為模板利用RT-PCR釣取GPIbα的全長cDNA，上遊5』-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3』下遊5』-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3。
4、以GPIbα cDNA為模板，用步驟1合成的上、下遊引物，PCR法克隆GPIbαvWf因子結合域的cDNA，如圖2所示，其中帶1顯示GPIbαvWF因子結合域，帶2是核酸分子量Mark2000，1000，750，500，250，100bp；該步驟中PCR的條件是50μl總反應體系中，依次加入dNTP至終濃度0.2mM，MgCl2至終濃度2.5mM，加入上下遊引物至終濃度為0.4μM，加入0.5μg模板，10×RT-PCR緩衝液5μl，Taq酶1μl(5U/μl)。在PE-2400型PCR儀上按下述條件擴增94℃，5Min；94℃，45s，60℃，45s，72℃，延伸1Min，共30個循環；再在72℃，延伸7Min。
5、將GPIbαvWf因子結合域的cDNA克隆至質粒T-Vector(Promega公司產品)，由上海博亞生物工程公司測定其序列正確，其序列如序列表中SEQ ID №1。
6、以BamH I和EcoR I雙酶切將目的片段自T-Vector切下，回收目的片段，插入與經BamHI和EcoR I雙酶切處理後的真核表達質粒pcDNA3.1(+)(其圖譜如圖3所示)構建pcDNA3.1-GP302，經鑑定正確。
7、真核表達質粒pGP302的構建以pcDNA3.1-GP302真核表達載體為模板，設計了一對含有Hind III或Not I的兩條引物引物I 5』-GCAAGCTTCACCCCATCTGTGAGGTC引物II 5』-GAGCGGCCGCGGCTTTGGTGGGGAACTT將GP302基因插入真核表達載體pSecTaq2/HygroB(如圖4，含有6個純化標籤His6和檢測標籤c-myc)中，構建了真核表達質粒pGP302。真核表達質粒pGP302經HindIII/NotI酶切鑑定，結果如圖5所示，表明所構建的質粒結構正確。
8、將pGP302用脂質體法轉染COS-7以及CHO細胞，培養72小時收集細胞培養上清，SDS-PAGE顯示有新生蛋白帶出現。用c-myc抗體和GPIb單抗做點印跡以及Westernblot，結果如圖6和圖7所示，表明表達的特異性重組蛋白質為可溶性rGP302。圖6中，1為CHO表達上清，2為CHO-pGP302表達上清，3為CHO-p空載體表達上清；圖7中，1，3為GP302重組蛋白，2為CHO培養上清。
9、將細胞系在含10％胎牛血清的培養基中培養至細胞80％滿底，以無血清的培養基洗細胞，並在無血清培養基中培養24小時，收集含rGP302的上清液；10、收集後的上清液以鎳親合柱純化，得到rGP302，其胺基酸序列為SEQ ID №2。
實施例2、rGP302的抑制凝血效果從健康人採集全血按1∶10與3.14％的檸檬酸鈉混合，100g離心15分鐘收集富含血小板的上清(PRP)，以無血小板的血清(PPP)調節血小板濃度為300×106/ml。將濃度為0.5mg/ml的rGP302先與PRP在室溫孵育5分鐘後，將瑞斯託菌素加入PRP中至終濃度為1.5mg/ml，在血小板聚集儀上測定10分鐘凝集率，結果如圖8a，8b和圖8c所示，表明體外可溶性rGP302能夠抑制瑞斯託菌素誘導的血小板凝集，延長凝血時間，血小板聚集率由對照的100％降低至13％。
序列表160221012111109212DNA213人屬人(Homo sapiens)4001ctggctagcc accatggaga cagaeacaet cctgctatgg gtactgctgc tctgggttcc 60aggttccact ggtgacgcgg cccagccggc caggcgcgcg cgccgtacga agcttcaccc 120catctgtgag gtctccaaag tggccagcca cctagaagtg aactgtgaca agaggaatct 180gacagcgctg cctccagacc tgccgaaaga cacaaccatc ctccacctga gtgagaacct 240cctgtacacc ttctccctgg caaccctgat gccttacact cgcctcactc agctgaacct 300agataggtgc gagctcacca agctccaggt cgatgggacg ctgccagtgc tggggaccct 360ggatctatcc cacaatcagc tgcaaagcct gcccttgcta gggcagacac tgcctgctct 420caccgtcctg gacgtctcct tcaaccggct gacctcgctg cctcttggtg ccctgcgtgg 480tcttggcgaa ctccaagagc tctacctgaa aggcaatgag ctgaagaccc tgcccccagg 540gctcctgacg cccacaccca agctggagaa gctcagtctg gctaacaaca acttgactga 600gctccccgct gggctcctga atgggctgga gaatctcgac acccttctcc tccaagagaa 660ctcgctgtat acaataccaa agggcttttt tgggtcccac ctcctgcctt ttgcttttct 720ccacgggaac ccctggttat gcaactgtga gatcctctat tttcgtcgct ggctgcagga 780caatgctgaa aatgtctacg tatggaagca aggtgtggac gtcaaggcca tgacctctaa 840cgtggccagt gtgcagtgtg acaattcaga caagtttccc gtctacaaat acccaggaaa 900ggggtgcccc acccttggtg atgaaggtga cacagaccta tatgattact acccagaaga 960ggacactgag ggcgataagg tgcgtgccac aaggactgtg gtcaagttcc ccaccaaagc1020cgcggccgct cgaggagggc ccgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc1080cgtcgaccat catcatcatc atcattgag 11092102211324212PRT
213人屬人(Homo sapiens)4002His Pro Ile Cys Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn1 5 10 15Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp20 25 30Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu35 40 45Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn Leu Asp Arg50 55 60Cys Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly65 70 75 80Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly85 90 95Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu100 105 110Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu115 120 125Leu Tyr Leu Lys Gly Ash Glu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu130 135 140Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu145 150 155 160Thr Glu Leu Pro Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Glu Asn Leu Asp Thr165 170 175Leu Leu Leu Gln Glu Asn Ser Leu Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Phe Phe180 185 190Gly Ser His Leu Leu Pro Phe Ala Phe Leu His Gly Asn Pro Trp Leu195 200 205Cys Asn Cys Glu Ile Leu Tyr Phe Arg Arg Trp Leu Gln Asp Ash Ala210 215 220
Glu Asn Val Tyr Val Trp Lys Gln Gly Val Asp Val Lys Ala Met Thr225 230 235 240Ser Asn Val Ala Ser Val Gln Cys Asp Asn Ser Asp Lys Phe Pro Val245 250 255Tyr Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Cys Pro Thr Leu Gly Asp Glu Gly Asp260 265 270Thr Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Thr Glu Gly Asp Lys275 280 285Val Arg Ala Thr Arg Thr Val Val Lys Phe Pro Thr Lys Ala Glu Glu290 295 300Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His305 310 315 320His His His His32權利要求
1.一種抑制血栓形成的藥物，它的活性成分是序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列，或者是將SEQ ID №2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的藥物，其特徵在於所述抑制血栓形成的藥物的活性成分是序列表中SEQ ID №2。
3.根據權利要求1所述的藥物，其特徵在於所述藥物中還含有人體可接受的藥用載體。
4.重組血小板糖蛋白rGP302的編碼基因，是下列核苷酸之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於所述重組血小板糖蛋白rGP302的編碼基因是序列表中SEQ ID №1。
全文摘要
本發明公開了一種抑制血栓形成的藥物。本發明所提供的抑制血栓形成的藥物，它的活性成分是SEQ ID №2的胺基酸殘基序列，或者是將SEQ ID №2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。重組血小板糖蛋白rGP302編碼基因，是下列核苷酸之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼SEQID №2的胺基酸殘基序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明為血栓性疾病的預防和治療提供了一種新的思路和方法，從而為進一步的理論研究和製備新型抗血栓藥物奠定了基礎，具有重要的意義。
文檔編號A61K38/16GK1602953SQ0313471
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優先權日2003年9月29日
發明者王字玲, 蘇麗, 王波, 張玉華, 趙敬湘 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所