引物伸長反應檢測方法、鹼基種類判別方法及其裝置的製作方法

2023-06-13 19:38:56 2

專利名稱：引物伸長反應檢測方法、鹼基種類判別方法及其裝置的製作方法
技術區域本發明涉及檢測引物(primer)伸長反應的伸長反應檢測方法、判別核酸的鹼基序列中的鹼基種鹼基種類判別方法、判別核酸的鹼基序列中的鹼基種鹼基種類判別裝置、焦磷酸的檢測裝置、核酸的檢測方法以及試料溶液導入晶片(チツプ)。
背景技術：
現有技術1調查是否存在具有特定鹼基序列的核酸的技術是非常重要的技術。例如在遺傳病的診斷、對由細菌以及病毒等造成的食品汙染的檢測、細菌以及病毒等對人體的感染檢測等中，是必需的技術。
已知重症複合型免疫不全症、家族性高膽固醇血症等遺傳病是由特定遺傳基因的缺損而引起的。因此，通過調查是否存在具有成為上述遺傳病因的特定的鹼基序列的遺傳基因，就能診斷有無遺傳病。
近年來，由大腸菌O157等造成的食品汙染已成為社會問題。對由這樣的細菌以及病毒造成的食品汙染的檢測是通過分析是否存在受疑細菌或病毒特有的DNA或RNA鹼基序列，判斷有無汙染。對人體的感染檢測也是一樣的。
通常，在上述這種特定核酸的鹼基序列的檢測技術中，因為大多數情況下，試料中含有特定鹼基序列的核酸是微量，所以要求檢測感度非常高。現在，最常使用的檢測技術是利用具有標的鹼基序列的核酸的放大法的技術。例如PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等。通過這些核酸的放大法，大量增加試料中具有標的鹼基序列的核酸，即可檢測出具有標的鹼基序列的核酸。上述放大法能很容易地對具有標的鹼基序列的核酸放大。但是，檢測具有受到放大的標的鹼基序列的核酸的方法還有些不足之處。
最廣泛使用的用於檢測具有受到放大的標的鹼基序列的核酸方法之一是通過電泳分離具有受到放大的標的鹼基序列的核酸後，使用溴乙啶等螢光嵌入劑的方法。該方法簡便，但另一方面，因為螢光嵌入劑是致癌物質，所以操作時要非常注意。
另外，作為其它的方法，可以舉出點印跡法。點印跡法首先通過熱處理使具有受到放大的標的鹼基序列的雙鏈DNA或RNA改性為單鏈DNA或RNA，並固定在尼龍等膜上。接著，在膜上，使經過放射性標識或螢光標識的核酸探測器與上述單鏈DNA或RNA進行特定反應的雜交。最後，通過檢測放射性標識或螢光標識而檢測具有受到放大的標的鹼基序列的雙鏈DNA或RNA。但是，在該方法中，當使用經放射性標識的核酸探測器時，通常要花1～5天左右的時間。另外，即使使用螢光標識核酸探測器時，也需要幾小時～十幾小時。而且，需要根據具有受到放大的標的鹼基序列的核酸的不同，調製被標識的核酸探測器，所以是非常複雜的。
PCR法通常使用DNA聚合酶一邊反覆進行由引物開始的DNA伸長反應(以下稱「引物伸長反應」)，一邊對具有標的鹼基序列的核酸進行放大的技術。使用引物伸長反應的應用不局限於檢測具有標的鹼基序列的核酸。
近年來，漸漸可知，被稱為SNP(Single Nucleotide Polymorphism單核苷酸多態型)中的單鹼基對的多型易於導致糖尿病或高血壓等疾病或易於對藥效等造成影響。因此，分析每個人的SNP類型的所謂SNP定型(typing)技術很受重視。另外，例如已知，染色體DNA中的鹼基序列中，僅單鹼基對的置換都會導致危重疾病。因此，有無這種單鹼基對的置換就變得格外重要。SNP定型技術在判別是否存在這樣的單鹼基對的置換中是非常有效的技術。
現在，各種各樣的SNP定型技術已被開發或已付諸實施。在這些技術中，最簡便的技術之一是利用引物伸長反應。在該技術中，通過判定是否發生引物伸長反應，進行SNP定型。
現在，利用引物伸長反應的SNP部位的鹼基種類判別技術分為兩大類。一種是利用使用4種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的引物伸長反應的方法，另一種是利用只使用一種dNTP或ddNTP的引物伸長反應的方法。
下面，一邊參照圖19和圖20一邊說明利用使用4種dNTP的引物伸長反應的方法。在該方法中，使用具有與鄰近標的DNA的SNP部位的鹼基序列互補的鹼基序列、根據標的DNA的SNP部位的鹼基種類進行伸長反應時會產生差異的引物(以下稱為「分型引物」(typingprimer))。以下為其具體實施方式
。
首先，在圖19(a)所示工序中，調製含有具備SNP部位S1的標的DNA1的試料溶液。同樣，在圖20(a)所示的工序中，調製含有具備SNP部位S2的標的DNA2的試料溶液。
接著，在圖19(b)所示的工序中，通過對DNA1熱改性等形成單鏈DNA3和單鏈DNA4。同樣，在圖20(b)所示的工序中，通過對DNA2熱改性等形成單鏈DNA5和單鏈DNA6。
接著，在圖19(c)所示的工序中，將分型引物7、DNA聚合酶8以及4種dNTP添加到含有單鏈DNA3以及4的試料溶液中。同樣，在圖20(c)所示的工序中，將分型引物7、DNA聚合酶8以及4種dNTP添加到含有單鏈DNA5以及6的試料溶液中。在此，除其3′末端的鹼基(此處為「胸腺嘧啶」、以下記為「T」)以外，分型引物7與比單鏈DNA4以及6的SNP部位更靠近3′末端側的區域為完全雜交。
在圖19(c)所示的工序中，SNP部位S1為腺膘呤(以下記為A)的單鏈DNA4與分型引物7完全雜交。因此，在圖19(d)所示的工序中，產生引物伸長反應，通過DNA聚合酶8消耗dNTP。
另一方面，在圖20(c)所示的工序中，只有SNP部位S2為鳥膘呤(以下記為G)單鏈DNA6與分型引物7的3′末端的鹼基(T)不能雜交。因此，在圖20(d)所示的工序中，難以產生正常引物伸長反應。因此，幾乎沒有消耗dNTP。
因此，通過分析這些伸長反應的進行差異，就能判別SNP部位的鹼基。這樣，就能根據是否產生引物伸長反應，進行SNP部位的鹼基判別。用該方法，即使SNP部位的鹼基有3種或4種可能性，只要準備有分別與之對應的分型引物同樣能夠進行分析。
關於分型引物，除上述的3′末端鹼基與DNA的SNP部位的鹼基對應的引物以外，也開發有其它分型引物。例如，可以舉出由東洋紡績(株)開發的ASP(Allele Specific Primer)等(參照非專利文獻1)。ASP是從其3′末端數第2位的鹼基對應於SNP部位、而且從其3′末端數第3位的鹼基與標的鹼基必須為非互補方式的引物。
已知，通過同時使用ASP與校正活性的強α型DNA聚合酶，由上述圖19以及圖20所示的方法也能正確判別SNP部位的鹼基種類。即，在與從ASP的3′末端數第2位的鹼基互補的情況下，SNP部位可產生良好的伸長反應；在不互補的情況下，不會產生正常的伸長反應。另外，已知，在產生伸長反應的情況下和不產生伸長反應的情況下，伸長反應進行差異與上述圖19以及圖20所示的方法相比要大。
接著，一邊參照圖21以及圖22一邊說明使用1種dNTP(或ddNTP)利用引物伸長反應的方法。在該方法中，使用在標的單鏈DNA中與SNP部位鄰接區域雜交的方式設計的引物進行伸長反應。即引物序列中不存在與SNP部位對應的部位。以下說明具體實施工序。
首先，在圖21(a)所示的工序中，調製含有具備SNP部位S1的標的DNA1的試料溶液。同樣，在圖22(a)所示工序中，調製含有具備SNP部位S2的標的DNA2的試料溶液。
接著，在圖21(b)所示的工序中，通過對DNA1熱改性等形成單鏈DNA3以及4。同樣，在圖22(b)所示的工序中，通過對DNA2熱改性等形成單鏈DNA5以及6。
接著，在圖21(c)所示的工序中，將引物9、DNA聚合酶8以及dCTP(或ddCTP)添加到含有單鏈DNA3以及4的試料溶液中。同樣，在圖22(c)所示的工序中，將引物9、DNA聚合酶8以及dCTP(或ddCTP)添加到含有單鏈DNA5以及6的試料溶液中。在此，引物9與比單鏈DNA4以及6的SNP部位更靠近3′末端側的區域為完全雜交。因此，單鏈DNA4、6與引物9完全雜交。
接著，在圖21(d)所示的工序中，單鏈DNA4的SNP部位S1為A、只供給dCTP(或ddCTP)，所以不產生引物伸長反應。因此，通過DNA聚合酶8幾乎沒有消耗dCTP(或ddCTP)。
另一方面，在圖22(d)所示的工序中，單鏈DNA6的SNP部位S2為G，通過供給dCTP(或ddCTP)產生正常的引物伸長反應。因此，通過DNA聚合酶8消耗dCTP(或ddCTP)。
另外，當SNP部位的鹼基有三種或四種可能性時，只要準備有分別與之對應的dNTP或ddNTP，同樣能夠進行分析。
這樣，只使用1種dNTP或ddNTP的方法與使用所有上述4種dNTP的方法不同，使用dNTP時通常為一個到幾個鹼基，使用ddNTP時只向引物附加單鹼基。因此，檢測伸長反應進行差異是非常困難的。因此，在以下所示的專利文獻1以及2中，為了檢測伸長反應進行差異，使用將隨引物伸長反應進行而生成的焦磷酸轉換為ATP、然後利用蟲螢光素酶反應測定焦磷酸量的方法。作為只使用1種dNTP的方法的優點，可以舉出通過引物的設計的辦法、通過反覆進行以圖21或圖22所示的各工序為標準的工序不僅能判別SNP部位、而且能判別SNP部位附近的鹼基序列的優點。
利用上述引物伸長反應的SNP部位鹼基判別技術有多種，在任一SNP部位鹼基判別技術中，共通之處在於，都是分析引物伸長反應進行差異、以進行SNP部位鹼基判別。
這樣的SNP部位鹼基判別技術不只應用於所謂SNP部位，也可用於所期望的特定鹼基的判別，這是非常有用的技術。在不遠的將來，很有可能用於大大小小、各種規模的醫院的日常應用中。因此，有必要發明能夠更安全更正確地分析引物伸長反應差異的方法。
現有技術2已知，焦磷酸與細胞內的酶反應密切相關。例如在蛋白質的合成過程中，在胺基酸經氨醯基腺苷酸形成氨醯基tRNA的反應中生成焦磷酸。另外，例如可在植物等中發現的澱粉合成過程中，通過葡萄糖-1-磷酸和ATP反應生成ADP-葡萄糖時，生成焦磷酸。除此以外，已知多種酶反應與焦磷酸有關。因此，定量檢測焦磷酸的技術在分析細胞狀態或上述酶反應等方面是非常重要的技術。
作為現有焦磷酸檢測方法，已知有Grindley等人所用的化學方法(參照非專利文獻2)。但在該方法中使用濃硫酸，所以非常危險。
在專利文獻3中揭示有不使用濃硫酸等危險藥品、而是利用酶的三種焦磷酸檢測方法。對此在下文進行說明。
方法1是在磷酸烯醇丙酮酸以及磷酸腺苷的存在下、使焦磷酸與丙酮酸正磷酸鹽二激酶作用的方法。因為通過該反應生成丙酮酸，所以通過測定丙酮酸量能算出焦磷酸量。另外，測定丙酮酸量的方法有兩種提案。一種是利用乳酸脫氫酶的催化作用而用NADH還原丙酮酸時，對NADH的減少進行比色定量的方法。另一種是將丙·酮酸化酶與生成的丙酮酸作用而生成的過氧化氫引入色素而比色定量的方法。
方法2是在胞苷二磷酸甘油的存在下、使焦磷酸與甘油-3-胞苷磷酸酯·移酶作用的方法。通過該反應生成甘油三磷酸。因此通過測定甘油三磷酸的生成量就能算出焦磷酸量。另外，測定甘油三磷酸量的方法有兩種。一種是利用甘油-3-磷酸酯脫氫酶的催化作用而用NAD(P)氧化甘油三磷酸時，對NAD(P)H的增加進行比色定量的方法。另一種是將甘油-3-磷酸酯氧化酶與生成的甘油三磷酸作用而生成的過氧化氫引入色素而比色定量的方法。
方法3是在胞苷二磷酸核糖醇的存在下、使焦磷酸與核糖醇-5-胞苷磷酸酯轉移酶作用的方法。通過該反應生成D-核糖醇-5-磷酸，所以通過測定其生成量可算出焦磷酸量。另外，有人提出測定D-核糖醇-5-磷酸的方法是在NAD(或NADP)存在下，通過核糖醇-5-磷酸酯脫氫酶的作用，NADH(或NADPH)的增加進行比色定量的方法。
非專利文獻1東洋紡織(株)網站，平成14年10月1日檢索URL(http//www.toyobo.co.jp/seihin/xr/product/custom/snps/snps.html)專利文獻1特表2001-506864號公報(摘要欄)專利文獻2特表2001-501092號公報(摘要欄)非專利文獻2G.B.Grindley and C.A.Nichel，Anal.Biochem，.vol33.p114(1970)專利文獻3特開昭61-12300號公報。

發明內容
如上述現有技術1中所述，利用引物伸長反應的SNP部位的鹼基種類的判別技術有多種，在任一SNP部位鹼基判別技術中，通過分析引物伸長反應的進行差異來判別SNP部位的鹼基種類，在這一點上是共通的。
分析引物伸長反應差異的方法有兩種。一種是利用PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等標的鹼基序列的放大法和核酸檢測技術的技術。即，作為引物的一種，利用上述分型引物放大含有SNP部位的鹼基序列。其結果是，當分型引物的3′末端鹼基與分析對象SNP部位互補時，具有標的鹼基序列的核酸可很好地被放大；但是在不互補的情況下，核酸難以被放大。因此，使用螢光嵌入劑等標識物質，通過測定目的鹼基序列斷片量，就能判別SNP部位的鹼基種類。但是，如上所述，螢光嵌入劑是致癌物質，所以需要非常危險的操作，因此是不合適的。
另一種是利用PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等標的鹼基序列的放大法和焦磷酸檢測技術的技術。即，作為引物的一種，與上述技術一樣，也利用上述分型引物放大含有SNP部位的鹼基序列，但該方法不是通過檢測核酸而是通過檢測隨引物伸長而生成的焦磷酸進行標的鹼基序列的放大量分析，即SNP部位的鹼基種類的判別。作為此時所用的焦磷酸檢測方法，已知有將焦磷酸轉換為ATP、然後利用蟲螢光素酶反應進行測定的方法。但是，當引物伸長反應中使用dATP時，dATP與ATP一樣成為蟲螢光素酶反應的基質。因此，不能正確地判別SNP部位的鹼基種類。因此，有必要採用特殊的dATP類似體以代替dATP用作DNA聚合酶的基質，且該基質應不與蟲螢光素酶反應，這是不可取的。另外，該方法與上述方法不同，只使用分型引物，分析由此引發的引物伸長反應，也能判別SNP部位的鹼基。
另外，如上述現有技術2所述，即使在其它焦磷酸的檢測技術中，也需要多種酶、試劑等，導致成本增加、工序複雜化，這是不可取的。
本發明就是為解決上述問題，提供檢測引物伸長反應的簡便技術、判別核酸鹼基序列中的鹼基種類的簡便技術以及核酸的檢測技術。
本發明的檢測引物伸長反應的伸長反應檢測方法包括調製含有核酸、具備含有與上述核酸互補結合的互補結合區域的鹼基序列的引物、以及核苷酸的試料溶液的工序(a)；將上述試料溶液置於發生上述伸長反應的條件下，在發生上述伸長反應的情況下生成焦磷酸的工序(b)；使上述試料溶液與具有貫穿H+難透性膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+難透性膜的表面接觸的工序(c)；在將上述H+-焦磷酸酶浸入溶液的狀態下，測定上述H+難透性膜表面側溶液或上述H+難透性膜內面側溶液中至少任一方的H+濃度的工序(d)；以及基於工序(d)的測定結果，檢測上述伸長反應的工序(e)。
本發明的判別核酸鹼基序列中的鹼基種類的鹼基種類判別方法包括調製含有核酸、具備含有與上述核酸互補結合的互補結合區域的鹼基序列的引物、以及核苷酸的試料溶液的工序(a)；將上述試料溶液置於可發生上述引物伸長反應的條件下，在發生上述伸長反應的情況下生成焦磷酸的工序(b)；使上述試料溶液與具有貫穿H+難透性膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+難透性膜的表面接觸的工序(c)；在將上述H+-焦磷酸酶浸入溶液的狀態下，測定上述H+難透性膜表面側溶液或上述H+難透性膜內面側溶液中至少任一側的H+濃度的工序(d)；基於工序(d)的測定結果，檢測上述伸長反應的工序(e)；以及基於工序(e)的檢測結果判別上述核酸的鹼基序列中的鹼基種類的工序(f)。
作為判別核酸的鹼基序列中的鹼基的方法，例如有一種如下所述的方法，即當使用具有與欲判別的鹼基的3′末端側鄰接的鹼基序列完全互補的序列的引物、以及與欲判別的鹼基的預想鹼基種類互補的dNTP進行引物伸長反應時，通過引物伸長反應進行的程度，判別欲判別鹼基的鹼基種類。另外還有一種如下所述的方法，即當使用具有與含有欲判別鹼基的鹼基序列互補的鹼基序列、且同時使用4種dNTP進行引物伸長反應時，採用根據欲判別的鹼基的鹼基種類所進行的引物伸長反應的進行程度會產生差別的引物。無論哪一種方法，共同點在於，都是根據引物伸長反應進行的程度來判別特定的鹼基的鹼基種類。在本發明中，可通過檢測由引物伸長反應生成的焦磷酸分析出引物伸長反應所進行的程度。因此，能判別核酸鹼基序列中的鹼基種類。本說明書中所說的「核酸的鹼基序列中的鹼基種類的判別」可以舉出例如判別DNA的SNP部位是否為特定的鹼基，SNP部位的鹼基種類的決定；是否存在突變部位；突變部位的決定以及突變部位的鹼基種類的決定。
在自然界中，H+-焦磷酸酶具有如下的性質，即該焦磷酸水解活性部位以露出在液泡膜的外側(表面側)的方式而被保持在液泡膜上，隨著由1分子焦磷酸生成2分子磷酸的水解反應，由液泡膜的外側向液泡膜的內側(內面側)輸送H+。因此，通過H+-焦磷酸酶的酶反應，液泡膜內部H+濃度增大，而液泡膜外部H+濃度減少。根據本發明，在露出有H+-焦磷酸酶的焦磷酸水解活性部位的第一區域，在進行伸長反應時，通過貯留含有焦磷酸的試料溶液，使得在進行伸長反應時由第一區域向第二區域輸送H+，從而使液泡膜的表面側和內面側的H+濃度產生變化。因此，通過測定表面側和內面側的任一方的H+濃度，可檢測試料溶液中的焦磷酸量。因此，當採用通過檢測隨著引物的伸長反應而生成的焦磷酸而判別核酸的鹼基序列中的鹼基種類的本發明的方法時，在焦磷酸的檢測中，不需要很多種酶和試劑等，工序簡單、成本降低。
例如，在工序(d)中，測定上述表面側溶液的H+濃度與工序(b)之後、工序(c)之前的上述試料溶液的H+濃度之差。另外，在工序(e)中，將工序(d)的測定結果與對照值比較，可檢測上述伸長反應。當上述鹼基種類的判別是SNP部位的鹼基種類判別時，上述對照值可使用上述SNP部位沒有變異的核酸作為上述核酸進行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的測定結果。
另外，例如可在工序(d)中檢測上述內面側溶液的H+濃度，在工序(e)中，將工序(d)的測定結果與對照值比較，檢測上述伸長反應。當上述鹼基的判別是SNP部位的鹼基的判別時，可在工序(a)中使用作為上述核苷酸的一種核苷酸，上述對照值為使用與上述SNP部位的鹼基種類不同的核酸作為上述核酸進行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的測定結果。
在工序(d)中也可以採用光學方法測定H+的濃度。此時，例如，可將pH敏性色素或膜電位敏性色素添加到上述表面側溶液和上述內面側溶液中的至少任一方中，通過測定上述色素的光學反饋性，測定H+濃度。作為上述pH敏性色素，可以舉出例如吖啶橙。作為膜電位敏性色素，可以舉出例如OksorV(ォクソ一ルV)。
在工序(d)中也可以採用電學方法測定H+的濃度。
伸長反應例如也可以是根據PCR法的伸長反應。
判別本發明的核酸的鹼基序列中的鹼基種類的鹼基種類判別裝置的結構特點為，具有引物伸長反應中進行必要的溫度調節的反應部和檢測隨著上述引物伸長反應而生成的焦磷酸的焦磷酸檢測部；上述反應部具有用於貯留溶液的反應用貯留區域；上述焦磷酸檢測部具有用於貯留溶液的檢測用貯留區域、將上述檢測用貯留區域分成第一區域和第二區域的H+難透性膜、用於測定貯留在第一區域和第二區域至少任一方的區域中的溶液的H+濃度的測定機構，H+難透性膜具有貫穿膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶；在上述焦磷酸檢測部中，由上述反應部送出的反應溶液貯留於第一區域。
作為判別特定鹼基的鹼基種類的方法，例如有一種如下所述的方法即，當使用具有與欲判別的鹼基的3′末端側鄰接的鹼基序列完全互補的序列的引物和與欲判別的鹼基的預想鹼基種類互補的dNTP進行引物伸長反應時，通過引物伸長反應進行的程度，判別欲判別鹼基的鹼基種類。另外還有一種如下所述的方法，即當使用具有與含有欲判別鹼基的鹼基序列互補的鹼基序列、且同時使用4種dNTP進行引物伸長反應時，採用根據欲判別的鹼基的鹼基種類所進行的引物伸長反應的進行程度會產生差別的引物。無論哪一種方法，共同點在於，都是根據引物伸長反應進行的程度來判別特定的鹼基的鹼基種類。當發生引物伸長反應時將生成焦磷酸。根據本發明的鹼基種類判別裝置，可通過測定引物伸長反應生成的焦磷酸分析出引物伸長反應所進行的程度。因此，能判別特定鹼基的鹼基種類。
另外，欲判別試料溶液中是否存在具有特定鹼基序列的核酸時，當引物伸長反應進行時，就可知溶液中存在著具有與引物互補的鹼基序列的核酸。相反，如果引物伸長反應幾乎不進行，就可知溶液中不存在具有與引物互補的鹼基序列的核酸。這樣，使用本發明的鹼基種類判別裝置，也能判別試料溶液中是否存在具有特定鹼基序列的核酸，即也能檢測特定的核酸。
上述測定機構為例如可用光學方法測定H+濃度的結構。另外，上述測定機構為例如可用電學方法測定H+濃度的結構。
上述鹼基種類判別裝置也可以是還設有控制上述反應部以及上述焦磷酸檢測部、對由上述測定機構測定的結果進行分析的分析機構的結構。
上述鹼基種類判別裝置也可以是還設有能插入具有上述反應用貯留區域以及上述檢測用貯留區域的晶片的插槽的結構。
本發明的焦磷酸檢測裝置設有容器、將上述容器內部分成第一區域和第二區域的H+難透性膜、與貯留於第一區域的溶液相接觸的電極、與貯留於第二區域的溶液相接觸的H+敏性電極，H+難透性膜具有貫穿內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的結構。
本發明的具有特定鹼基序列的核酸的檢測方法包括調製含有試料、具備含有與上述核酸互補結合的互補結合區域的鹼基序列的引物、以及核苷酸的試料溶液的工序(a)；將上述試料溶液置於可發生上述引物伸長反應的條件下，在發生所述伸長反應的情況下生成焦磷酸的工序(b)；使上述試料溶液與具有貫穿H+難透性膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+難透性膜的表面接觸的工序(c)；在將上述H+-焦磷酸酶浸入溶液的狀態下，測定上述丁難透性膜表面側溶液或上述H+難透性膜內面側溶液中至少任一側的H+濃度的工序(d)；基於工序(d)的測定結果，檢測上述伸長反應的工序(e)；以及基於工序(e)的檢測結果檢測上述核酸的工序(f)。
引物與具有互補的鹼基序列的核酸雜交，通過引物伸長反應而伸長。產生伸長反應時生成焦磷酸。根據本發明，即通過檢測焦磷酸量、通過具體地測定H+濃度就能分析引物伸長反應的進行程度。當引物伸長反應進行時，就可知試料溶液中存在具有與引物互補的鹼基序列的核酸。相反，如果引物伸長反應幾乎不能進行，就可知試料溶液中幾乎不存在具有與引物互補的鹼基序列的核酸。這樣，就能判別溶液中是否存在具有特定鹼基序列的核酸。
例如，在工序(d)中，測定上述表面側溶液的H+濃度與工序(b)之後、工序(c)之前的上述試料溶液的H+濃度之差。另外，例如可在工序(e)中，將工序(d)的測定結果與對照值比較，檢測上述伸長反應。這時，上述對照值為使用不含核酸的上述試料進行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的測定結果。
在工序(d)中可用光學方法測定H+的濃度。這時，例如，可將pH敏性色素或膜電位敏性色素添加到表面側溶液和內面側溶液中的至少任一方中，通過測定上述色素的光學反饋性，測定H+濃度。作為上述pH敏性色素，例如可以舉出吖啶橙。作為膜電位敏性色素，例如可以舉出OksorV。
另外，在工序(d)中可採用電學方法測定H+的濃度。
上述伸長反應例如也可是根據PCR法的伸長反應。
本發明的試料溶液導入晶片的結構為，設有用於進行引物伸長反應的反應槽；用於檢測焦磷酸的焦磷酸檢測槽；用於連接上述反應槽和上述焦磷酸檢測槽的通路。
另外，上述通路可開關。這時可很容易地將反應槽和焦磷酸檢測槽分開。因此，可以一個晶片進行反應溫度條件相互不同的引物伸長反應和焦磷酸的檢測。
上述焦磷酸檢測槽優選具有由H+難透性膜分離的第一區域和第二區域；上述H+難透性膜具有貫穿膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在第一區域的H+-焦磷酸酶；在上述焦磷酸檢測槽中，從上述反應槽經上述通路送出的反應溶液貯留於第一區域的結構。
向焦磷檢測槽內注入試料溶液時，在試料溶液中存在焦磷酸的情況下，發生H+-焦磷酸酶的酶反應，由膜隔開的第二區域內H+濃度增大，在第一區域內H+濃度減少。因此，通過電極和H+敏性電極，能通過電學方法測定H+濃度、並檢測出焦磷酸量。
本發明可提供檢測引物伸長反應的簡便技術、判別核酸鹼基序列中的鹼基種類的簡便技術、檢測焦磷酸的簡便技術以及檢測具有特定鹼基序列的核酸的簡便技術。


圖1為實施方式1的試料中的標的DNA的SNP部位的鹼基種類判別方法的工序示意圖。
圖2為實施方式1的試料中的標的DNA的SNP部位的鹼基種類判別方法的工序示意圖。
圖3為H+-焦磷酸酶的示意圖。
圖4為焦磷酸的檢測方法的示意圖。
圖5為焦磷酸的檢測裝置的示意圖。
圖6為實施方式1的鹼基種類判別裝置的示意圖。
圖7(a)為實施方式1的晶片的俯視圖，圖7(b)為沿圖7所示的X-X線的剖面圖。
圖8為實施方式1其它晶片的俯視圖。
圖9為實施方式1另一晶片的立體示意圖。
圖10為檢測實施方式2的試料中是否含有具有特定鹼基序列的DNA的方法的工序示意圖。
圖11為焦磷酸鈉的濃度與540nm螢光強度變化的關係曲線圖。
圖12為焦磷酸鈉的濃度與639nm的螢光強度變化的關係曲線圖。
圖13為焦磷酸鈉的濃度與pH值的關係曲線圖。
圖14(a)為λDNA的特定鹼基序列完全雜交得到的兩種引物C和D的示意圖，圖14(b)為PCR反應液G和H的組成表，圖14(c)為進行PCR反應的反應溫度條件的流程圖。
圖15(a)為分別在PCR反應液G和H中混合H+-焦磷酸酶前後的螢光強度變化率的曲線圖，(b)為螢光強度變化率表達式。
圖16(a)為野生型λDNA、變異型λDNA以及分型引物的示意圖，圖16(b)為PCR反應液I和J的組成表，圖16(c)為進行PCR反應的反應溫度條件的流程圖。
圖17為PCR反應液I和J的各自混合前後的螢光強度變化率示意圖。
圖18(a)為引物示意圖，圖18(b)為PCR反應液K和L的組成表，圖18(c)為進行PCR反應的反應溫度條件的流程圖。
圖19為利用現有引物伸長反應的SNP部位的鹼基種類判別技術的工序示意圖。
圖20為利用現有引物伸長反應的SNP部位的鹼基種類判別技術的工序示意圖。
圖21為利用現有引物伸長反應的SNP部位的鹼基種類判別技術的工序示意圖。
圖22為利用現有引物伸長反應的SNP部位的鹼基種類判別技術的工序示意圖。
符號說明1、2DNA；3、4、5、6單鏈DNA；7分型引物；8DNA聚合酶；10焦磷酸；11H+-焦磷酸酶；12磷酸；13液泡膜；31反應容器；32試料溶液；33膜小胞；34容器35電極；36內部槽；37膜；38H+敏性電極；39內部區域(第二區域)；50焦磷酸測定裝置；51反應機構；51a反應部；51b焦磷酸測定部；52分析機構；53、53a、53b、90晶片；60鹼基種類判別裝置；70樣品注入口；71DNA萃取槽；72DNA精製槽；73PCR槽；74a、74b、74c通路；75開關部件；91樣品導入部；91a樣品導入槽；91bDNA萃取柱；92DNA精製部；92aDNA精製槽；92bDNA精製柱；93PCR部；93aPCR槽；93b隔離部件；100試料溶液；101引物；102單鏈DNA。
具體實施例方式
以下一邊參照圖一邊說明本發明的實施方式。另外，本發明說明書中所述的DNA、RNA等核酸沒有特殊說明時則指雙鏈。
(實施方式1)在本實施方式中，說明判別試料中標的DNA的SNP部位的鹼基種類的方法。一邊參照圖1以及圖2一邊說明使用4種dNTP利用引物伸長反應(例如PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等放大反應)的方法。圖1以及圖2為判別本實施方式的試料中的標的DNA的SNP部位的鹼基種類的方法的工序示意圖。
在本實施方式的方法中，使用與含有標的DNA的SNP部位的鹼基序列進行實質性互補結合的、且根據標的DNA的SNP部位的鹼基種類伸長反應進行會產生差異的引物(以下稱「分型引物」)。另外，在本實施方式中，作用有分型引物的一方的單鏈狀態的標的DNA中的SNP部位鹼基有可能是A或G，如果是G的情況，引物伸長反應不進行，因此例示中為設計為A的情況下使用分型引物進行伸長反應。
首先，用圖1(a)所示工序調製含有具備SNP部位S1的標的DNA1、分型引物7、DNA聚合酶8以及4種dNTP的試料溶液。同樣，用圖2(a)所示工序調製含有具備SNP部位S2的標的DNA2、分型引物7、DNA聚合酶8以及4種dNTP的試料溶液。在此，分型引物7除其3′末端的鹼基(此處為「胸腺嘧啶」、以下記為「T」)以外，被設計為與比單鏈DNA4以及6的SNP部位更靠近3′末端側的區域完全雜交。另外，本實施方式所用的DNA聚合酶8一般使用公知的具有用於PCR等時的耐熱性的酶。
接著，在圖1(b)所示的工序中，對試料溶液加溫，對DNA1進行熱改性，從而形成單鏈DNA3和4。同樣，在圖2(b)所示工序中，加溫試料溶液，對DNA2進行熱改性，從而形成單鏈DNA5和6。
而在圖1(c)所示的工序中，冷卻試料溶液，單鏈DNA4與分型引物7雜交。因為單鏈DNA4的SNP部位S1為腺膘呤(以下記為A)，所以單鏈DNA4與分型引物7完全雜交。同樣，在圖2(c)所示工序中，冷卻試料溶液，單鏈DNA6與分型引物7雜交。因為單鏈DNA6的SNP部位S2為鳥膘呤(以下記為G)，所以單鏈DNA4中只有其3′末端的鹼基(T)未與分型引物7雜交。
接著，在圖1(d)所示工序中，調節試料溶液的溫度至最適於引物伸長反應的溫度。分型引物7與單鏈DNA4完全雜交。因此，產生引物伸長反應，通過DNA聚合酶8消耗dNTP、生成焦磷酸。
另一方面，在圖2(d)所示工序中，調節試料溶液的溫度至最適於引物伸長反應的溫度。但是，分型引物7為不與單鏈DNA6的3′末端的鹼基(T)雜交的狀態。因此，難以產生正常的引物伸長反應。因此，幾乎沒有消耗dNTP，也幾乎沒有生成焦磷酸。
接著，通過反覆進行從上述圖1(b)～(d)所示工序以及從圖2(b)～(d)所示工序，反覆進行引物伸長反應。由此，圖1(d)以及圖2(d)所示引物伸長反應進行差異非常顯著。
另外，不採用本實施方式的方法，也可採用將分型引物7作為PCR反應時所用2個引物中的一個使用，連同另一個引物，進行PCR反應。因此，引物伸長反應進行差異呈指數函數地擴大。另外，也適合使用PCR法以外的放大反應。
最後，通過焦磷酸的定量檢測分析圖1(d)以及圖2(d)所示的引物伸長反應的進行差異。由此，能判別SNP部位的鹼基種類。接著，一邊參照圖3一邊說明本實施方式的焦磷酸的定量檢測方法。
在本實施方式中，為了檢測焦磷酸而使用H+-焦磷酸酶。H+-焦磷酸酶是通常存在於植物的液泡膜等中的膜蛋白質。圖3為存在於植物液泡膜內的狀態下的H+-焦磷酸酶的示意圖。
如圖3所示，H+-焦磷酸酶11具有隨著由1分子的焦磷酸10生成2分子的磷酸12的水解反應、不使H+通過或使之難以通過液泡膜13的外側(表面13a側)向液泡膜13的內側(內13b側)輸送H+的性質。因此，通過H+-焦磷酸酶的酶反應，液泡膜內部H+濃度增大，液泡膜外部H+濃度減少。
在本實施方式中，利用H+-焦磷酸酶的上述性質以及膜蛋白質這樣的形態，進行焦磷酸的檢測。即，用保持H+-焦磷酸酶的膜劃分區域，測定任何一方H+濃度的變化，由此能檢測供給H+-焦磷酸酶水解的焦磷酸量。這樣，在本實施方式的方法中，通過檢測與H+焦磷酸酶作用直接相關的H+濃度變化，進行焦磷酸的檢測，所以能簡便且高靈敏度地進行檢測。另外，為了進行上述檢測，必要條件是將H+輸送源區域與H+輸送目的區域分離，H+-焦磷酸酶為膜蛋白質，由此可將該形態用於區域分離。這能簡化檢測。
在本實施方式中，使含有焦磷酸的試料溶液與為在由植物細胞等離析出的液泡膜內的狀態下的H+-焦磷酸酶接觸。然後，測定液泡膜內側或液泡膜外側的H+濃度的變化。液泡膜內側或液泡膜外側的H+濃度的變化如下述實施例所述，因H+濃度變化與試料溶液中的焦磷酸量相關，所以通過H+濃度變化測定，可檢測試料溶液中的焦磷酸量。焦磷酸量多的試料溶液是引物伸長反應進行的試料溶液，焦磷酸量少的試料溶液是引物伸長反應難以進行的試料溶液。即，根據引物伸長反應進行差異，可判別SNP部位的鹼基種類。例如，比較圖1(d)和圖2(d)的溶液後可知，圖1(d)一方可比圖2(d)一方檢測出更多的焦磷酸量。根據該結果，可判別DNA4的SNP部位S1是與引物7的3′末端鹼基T互補的鹼基A。而且，可判別DNA6的SNP部位S2不是與引物7的3′末端鹼基T互補的鹼基A。在本實施方式中，因為可知SNP部位的鹼基是A或G，所以可確定DNA6的SNP部位S2是G。
另外，通過H+濃度的變化是否達到規定值可確定是否有焦磷酸存在，根據焦磷酸的有無可確定是否有引物伸長反應進行。在本發明說明書中，將通過H+濃度的變化是否達到規定值來決定焦磷酸是否存在的檢測稱為焦磷酸的定性檢測。而將焦磷酸量值(例如濃度)的檢測稱為焦磷酸的定量檢測。
根據引物伸長反應是否進行、即焦磷酸的定性檢測，說明判別試料中所含SNP部位是否為與所用引物相應的鹼基種類的情況。例如，根據圖1(d)，判別引物伸長反應進行，可決定SNP部位是與所用引物3′末端的鹼基T互補的鹼基A。根據圖2(d)，判別引物伸長反應沒有進行，可決定SNP部位不是與所用引物的3′末端的鹼基T互補的鹼基A。在本實施方式中，如上所述，可知SNP部位的鹼基可能是A或G，所以在圖2(d)中，通過判別SNP部位的鹼基不是A，而剩下的可能性就為G，就可由此決定SNP部位的鹼基種類。
另外，如本實施方式所述，即使沒有預先特定SNP部位的鹼基為2種，使用多種引物進行通過判別上述引物的伸長反應有否進行而判別試料中含有的SNP部位是否對應所用引物的鹼基的操作，由此也能最終決定SNP部位的鹼基。
在本發明說明書中的「核酸的鹼基序列中的鹼基的判別」包括SNP部位的鹼基是否為特定的鹼基的判別和SNP部位的鹼基種類的決定。
作為測定H+濃度變化的方法，可以舉出將H+濃度變化轉換為光學變化而測定的方法和電學測定方法。作為將H+濃度變化轉換為光學變化而測定的方法，可以舉出使用pH試紙或pH敏性色素、膜電位敏性色素等方法。作為電學測定方法，可以舉出金屬電極法(氫電極法、醌氫醌電極法、銻電極法等)、玻璃電極法、ISFET電極法、膜片鉗法、LAPS(光可尋址電位傳感器、Light-Addressable Potentiometric Sensor)法等。
通過並用測定上述H+濃度變化的方法和上述H+-焦磷酸酶反應，能將試料溶液中的焦磷酸轉換為光學信號或電信號進行測定。
另外，測定H+濃度變化的方法不限於上述測定方法，只要是可將H+濃度變化轉換為光學變化或電學變化、且該光學變化或電學變化為可測的方法即可。
接著，一邊參照圖4以及圖5一邊說明本實施方式的焦磷酸的檢測方法。圖4以及圖5為焦磷酸的檢測方法示意圖。
如圖4所示，H+-焦磷酸酶存在於膜內，內部含有pH敏性色素或膜電位敏性色素的膜小胞33懸濁液注入反應容器31中，接著，將由圖1(d)或圖2(d)得到的試料溶液32添加到反應容器31中。這時，H+-焦磷酸酶的焦磷酸水解活性部位露出在膜小胞(H+難透性膜)33的外部。只要膜小胞33內部所含溶液不妨礙對由H+-焦磷酸酶輸送引起的H+濃度變化的檢測，就沒有特別限定。另外，將膜小胞33的外面33a作為表面，內面33b作為內面。試料溶液32中也可以添加pH敏性色素或膜電位敏性色素。
試料溶液32中存在焦磷酸時，發生H+-焦磷酸酶的酶反應，此時，膜小胞33內部的H+濃度增大，膜小胞33外部的H+濃度減少。因此，通過膜小胞33內部的H+濃度增大，pH敏性色素或膜電位敏性色素的螢光強度發生變化。通過以光學方法測定該螢光強度的變化，就能進行焦磷酸的定性檢測以及定量檢測。
可將由從細胞分離的液泡調製成的產物用作膜小胞33。另外，作為膜小胞33，也可以使用離析或精製H+-焦磷酸酶後、通過以存在於人工形成的脂質雙層膜或LB膜等不能通過H+或難於通過H+的膜內的方式再構築而形成的產物。
另外，焦磷酸水解活性部位優選為膜小胞33中含有露出在內部的H+-焦磷酸酶。但是，當焦磷酸水解活性部位使用含有露出在內部的H+-焦磷酸酶的膜小胞33時，膜小胞33內部的焦磷酸濃度優選為低於膜小胞33外部的焦磷酸濃度，最優選為膜小胞33內部不含焦磷酸。由此，減少或停止從膜小胞33的內部向外部輸送H+，從膜小胞33的外部向內部輸送H+佔優，膜小胞33的外部以及內部的H+濃度的變化大體上受到試料溶液32中含有的焦磷酸的限定。因此，能正確估計試料溶液32中含有的焦磷酸量。
另外，膜小胞33的膜中也可以含有除H+-焦磷酸酶以外的蛋白質。但是，這些蛋白質優選為與焦磷酸不反應或反應性低的蛋白質。之所以這樣，是因為當焦磷酸與除膜小胞33膜中的H+-焦磷酸酶以外的蛋白質反應時，與H+-焦磷酸酶反應的焦磷酸量減少，隨之H+的輸送量減少。另外，當膜小胞33的膜中含有通過不與焦磷酸反應且與除焦磷酸以外的物質的反應輸送H+的蛋白質時，該蛋白質優選為試料溶液32中幾乎不含有反應物。具體地，當膜小胞33的膜中含有通過與焦磷酸幾乎不反應且與ATP反應輸送H+的蛋白質ATPase時，優選為試料溶液32中幾乎不含ATP。
另外，作為pH敏性色素，例如可以舉出吖啶橙。另外，作為膜電位敏性色素，例如可以舉出OksorV。上述任一種色素都是對微小的pH或膜電位的變化非常敏感的色素。因此，可以高靈敏度檢測焦磷酸。
另外，也可以使用圖5所示的焦磷酸檢測裝置。如圖5所示，焦磷酸檢測裝置50具有容器34、電極35、和設於容器34內的內部槽36。在內部槽36中，形成內部有H+-焦磷酸酶的膜(H+難透性膜)37，內部槽36的底部設有H+敏性電極38。這時，H+-焦磷酸酶的焦磷酸水解活性部位露出在內部槽36的外部。以膜37的上面37a為表面，以膜37的下面37b為內面。
當將試料溶液32注入容器34內、試料溶液32中存在焦磷酸時，產生H+-焦磷酸酶的酶反應，由膜37隔離的內部槽36的內部區域(第二區域)39的溶液中H+濃度增大，而內部槽36外部的H+濃度減少。因此，使用電極35和H+敏性電極38，用電學方法測定H+濃度的變化，由此就能定性或定量檢測焦磷酸。在本實施方式中，預先在容器34和內部區域39內貯留可測定pH的緩衝液(buffer)等溶液後，將試料溶液32注入容器34內，但並不局限於此。例如，也可以預先在內部槽36內的H+敏性電極38上配置膜37，將試料溶液32添加到容器34中。由此，向容器34內注入試料溶液32時，透過試料溶液32中的膜37的成份(即不含焦磷酸的溶液)充滿內部區域39，使用電極35和H+敏性電極38，就可以電學方法測定H+濃度的變化。
另外，焦磷酸水解活性部位優選為膜37中含有露出在內部區域39的H+-焦磷酸酶。但是，當焦磷酸水解活性部位使用含有露出在內部區域39的H+-焦磷酸酶的膜37時，內部區域39的焦磷酸的濃度優選為低於內部槽36外部的焦磷酸濃度，最優選為內部區域39不含焦磷酸。由此，減少或停止從內部區域39向內部槽36外部輸送H+，從內部槽36的外部向內部區域39輸送H+佔優，內部槽36的外部以及內部區域39的H+濃度的變化大體上受到試料溶液32中含有的焦磷酸的限定。因此，能正確估計試料溶液32中含有的焦磷酸量。
另外，膜37中也可以含有除H+-焦磷酸酶以外的蛋白質。但是，這些蛋白質優選為與焦磷酸不反應或反應性低的蛋白質。之所以這樣，是因為當焦磷酸與除膜37中的H+-焦磷酸酶以外的蛋白質反應時，與H+-焦磷酸酶反應的焦磷酸量減少，隨之H+的輸送量減少。另外，當膜37中含有通過不與焦磷酸反應且與除焦磷酸以外的物質的反應輸送H+的蛋白質，該蛋白質優選為試料溶液32中幾乎不含有反應物。具體地，當膜37中含有通過與焦磷酸幾乎不反應且與ATP反應輸送H+的蛋白質ATPase時，優選為試料溶液32中幾乎不含ATP。
另外，焦磷酸檢測裝置50通過電極35和H+敏性電極38，用電學方法測定焦磷酸量，但不局限於此。例如，也可以將含有pH敏性色素或膜電位敏性色素的溶液添加到內部槽的內部區域39中。由此，隨著內部H+濃度的增大，pH敏性色素或膜電位敏性色素的螢光強度產生變化。通過光學方法測定該螢光強度的變化，就能測定焦磷酸量。
如上所述，內部存在有用於檢測焦磷酸的H+-焦磷酸酶的膜形狀既可以是球狀也可以是平面狀。即，可根據由H+-焦磷酸酶使內部存在有H+-焦磷酸酶的膜隔離的兩個區域之間的H+全部移動或大部分移動進行的條件構築。
另外，應用本實施方式的判別試料中的標的DNA的SNP部位的鹼基種類的方法，可判別試料中鹼基序列中是否存在突變部位、決定突變部位以及突變部位的鹼基種類。是否存在突變部位的判別是通過使用與沒有突變部位的目的鹼基序列完全互補的引物進行引物伸長反應，根據由該反應生成的焦磷酸量是少於還是與含有目的鹼基序列的試料和使用與該目的鹼基序列完全互補的引物進行引物伸長反應時生成的焦磷酸量(對照值)同等程度來判別試料中鹼基序列是否存在突變部位。即，當判別為與標準值同等程度時，判別為不存在突變部位；當判別為少於標準值時，判別為存在突變部位。
在決定突變部位的情況下，使用每個鹼基錯開地設計的多個引物進行引物伸長反應，測定生成的焦磷酸量，將對應於使焦磷酸量最小的引物的3′末端的部位進行特別限定，由此能決定突變部位。
突變部位的鹼基種類的決定可在決定突變部位後，通過採用與決定上述SNP部位的鹼基種類同樣的方法決定。
本說明書中核酸的「鹼基序列中的鹼基種類的判別」包括鹼基序列中是否存在突變部位的判別、突變部位的決定以及突變部位的鹼基種類的決定中的任一項。
接著，說明判別試料中標的DNA的SNP部位的鹼基種類的裝置。圖6為本實施方式的鹼基種類判別裝置的示意圖。
如圖6所示，鹼基種類判別裝置60設有具備進行引物伸長反應的反應部51a和檢測焦磷酸的焦磷酸檢測部51b的反應機構51和控制反應部51a與焦磷酸檢測部51b並分析得到的結果的分析機構52。另外，反應機構51具有為導入試料溶液而可插入晶片53的插槽。
反應部51a的結構優選為可根據引物伸長反應的需要進行溫度調節。例如，引物伸長反應使用PCR法時，反應部51a的結構優選設有可通過分別設定的時間來控制試料溶液導入晶片53內的試料溶液的溫度以分別適應核酸改性、引物退火以及通過聚合酶進行引物伸長反應的加熱部以及程序控制部。另外，當使用ICAN法以及LAMP法等恆溫反應時，反應部51a優選設有能保持一定溫度(例如65攝氏度)的加熱部以及溫度控制部。另外，在本實施方式中，採用與PCR法所用熱循環控制裝置相同的結構。
焦磷酸檢測部51b的結構根據測定H+濃度變化的測定機構的不同而不同。如上述圖4所示，在使用pH敏性色素或膜電位敏性色素等的色素用光學方法測定H+濃度變化時，焦磷酸檢測部51b優選設有激發螢光色素的光源部、測定產生的螢光的強度的螢光強度測定部。
另外，如上述圖5所示，當使用電極用電學方法測定H+濃度變化時，焦磷酸檢測部51b優選設有能測定分別與電極35以及H+敏性電極38電接的接點部或端子與電極35以及H+敏性電極38之間的電位差的電位差測定部。
用於導入試料溶液的晶片53設有PCR槽(反應用貯留區域)73、上述圖5所示的焦磷酸檢測裝置(包括檢測用貯留區域)50、連接PCR槽73和焦磷酸檢測裝置50的通路74c。
PCR槽73是用於在含有精製DNA、分型引物、DNA聚合酶以及4種dNTP的試料溶液中進行PCR(引物伸長反應)的槽。另外，可以根據需要預先或在插入鹼基種類判別裝置60之前向PCR槽73中導入各種必要的試劑。
因焦磷酸檢測裝置50具有如上所述結構，所以在此省略說明。另外，也可不使用焦磷酸檢測裝置50，而是採用將H+濃度變化轉換為光變化或電變化、可檢測該光學變化或電變化的裝置。
通路74c中設有開關部件，在開關部件的開狀態下，允許通路74c中流體流通；在開關部件的關狀態下，阻止通路74c中流體流通。根據這種結構，形成分別隔成PCR槽73與焦磷酸檢測裝置50的結構。開關部件為可由上述鹼基種類判別裝置60的反應機構51開關的結構。另外，在晶片53中，通路74c不一定必須具有開關部件，也可以是如下所述結構，即在PCR反應工序中，將反應溶液保持在PCR槽73內，同時，阻止從外部流入溶液；在焦磷酸的檢測工序中，將反應後的溶液保持在焦磷酸檢測裝置50內，同時，阻止從外部流入溶液。
另外，分析機構52與反應機構51相接，具體例為個人電腦(PC)等。
鹼基種類判別裝置60的動作如下。
首先，準備向PCR槽73導入含有具備SNP部位的標的DNA、分型引物、DNA聚合酶以及4種dNTP的試料溶液的晶片53。
接著，將晶片53插入反應機構51的插槽。如圖6所示，將晶片53插入反應機構51的插槽時，分別使PCR槽73位於反應部51a內(PCR槽73和反應部51a也合稱為反應部)、焦磷酸檢測裝置50位於焦磷酸檢測部51b內(焦磷酸檢測裝置50和焦磷酸檢測裝置51b也合稱為焦磷酸檢測部)，而將晶片53配置在反應機構51內。
然後，反應機構51在反應部51a中反覆進行上述圖1(b)～(d)所示工序和圖2(b)～(d)所示工序，在導入到晶片53的PCR槽73中的試料溶液內發生引物伸長反應。另外，先行在分析機構52中設定反覆進行上述圖1(b)～(d)所示工序和圖2(b)～(d)所示工序的次數。
當上述圖1(b)～(d)所示工序和圖2(b)～(d)所示工序結束時，通過反應機構51打開晶片53的通路74c，向焦磷酸檢測裝置50內導入試料溶液。焦磷酸檢測部51b用於檢測由引物伸長反應生成的焦磷酸量。具體的檢測方法如上所述，故在此省略說明。
接著，分析機構52通過分析由焦磷酸檢測部51b得到的結果，判別試料中的標的DNA的SNP部位的鹼基種類。此處所述的鹼基種類的判別包括判別是否為特定鹼基種類以及決定鹼基種類中的任一個。另外，使用圖6所示的鹼基種類判別裝置60也能進行鹼基序列中是否存在突變部位的判別、突變部位的決定以及突變部位鹼基種類的決定。這時，在分析機構52中，通過分析由焦磷酸檢測部51b得到的結果，進行是否存在突變部位的判別、突變部位的決定以及突變部位鹼基種類的決定。
接著，說明可取代晶片53而使用的另一種晶片53a。圖7(a)為本實施方式的另一種晶片的俯視圖，圖7(b)為沿圖7所示X-X線的剖面圖。
如圖7(a)和圖7(b)所示，晶片53a設有樣品注入口70，DNA萃取槽71，DNA精製槽72，PCR槽73，焦磷酸檢測裝置(包括檢測用貯留區域)50，連接DNA萃取槽71和DNA精製槽72的通路74a，連接DNA精製槽72和PCR槽73的通路74b，連接PCR槽(反應用貯留區域)73和焦磷酸檢測裝置50的通路74c。即，晶片53a在圖6所示晶片53的基礎上，還設有樣品注入口70、DNA萃取槽71、DNA精製槽72、通路74a以及通路74b。
樣品注入口70與外部和DNA萃取槽71連接。從樣品注入口70向DNA萃取槽71注入根據需要經藥液處理過的血液、唾液、毛髮以及毛根等試料溶液。
DNA精製槽72是用於精製DNA、進行除去雜質的藥液處理的槽。當然，也可以設製成具有用於精製DNA的柱的結構。
PCR槽73是用於在DNA精製槽72中、在含有精製的DNA、分型引物、DNA聚合酶以及4種dNTP的試料溶液中進行PCR(引物伸長反應)的槽。
另外，可以預先或在插入鹼基種類判別裝置60之前分別向DNA萃取槽71、DNA精製槽72和PCR槽73中導入各種必要的試劑。
焦磷酸檢測裝置50為如上所述結構，故在此省略說明。另外，也可不使用焦磷酸檢測裝置50，而是採用將H+濃度變化轉換為光變化或電變化、可檢測該光學變化或電變化的裝置。
通路74a、74b以及74c中設有開關部件75，形成抬起各開關部件75時、可分別將DNA萃取槽71、DNA精製槽72、PCR槽73、焦磷酸檢測裝置50密封的結構。開關部件75為可由上述鹼基種類判別裝置60的分析機構52開關的結構。
另外，也可以不採用開關部件75，而是例如在通路74a、74b以及74c中設置逆流防止閥等。另外，也可設置與焦磷酸檢測裝置50相通的脫氣孔，並在樣品注入口70安裝排氣泵、在上述脫氣孔安裝吸氣泵，由此形成將試料溶液輸送到DNA萃取槽71、DNA精製槽72、PCR槽73、焦磷酸檢測裝置50各部分的結構。而且，還可將上述排氣泵和吸氣泵用作排出和吸引與試料溶液不相混的油的泵。無論何種結構，只要是在上述鹼基種類判別裝置60的反應機構51中，可將DNA萃取槽71、DNA精製槽72、PCR槽73、焦磷酸檢測裝置50各自隔開的結構即可。此處的「隔開」是指在各槽71、72、73的處理中，各槽71、72、73保持有處理對象溶液，而阻止其它溶液流入的狀態。因此，只要是可將各槽71、72、73隔開的結構，即使不設開關部件也可達到目的。例如，當各槽71、72、73比通路74a、74b、74c凹下一層，在各槽71、72、73中保持有溶液的狀態下，形成可確保只要送液機構等不工作就不會有溶液流出、流入的狀態的結構。由此，在一個晶片上就能進行酶反應條件(例如最適溫度等)互不相同的引物伸長反應和焦磷酸的檢測。
另外，在本實施方式的晶片53a中，也可形成DNA萃取槽71、DNA精製槽72、PCR槽73為各自分離的單個的槽，而DNA的萃取、DNA的精製以及PCR在一個槽內進行的結構。
圖8為本實施方式其它晶片的俯視圖。
如圖8所示，晶片53b與圖7所示的晶片53a一樣，設有樣品注入口70、DNA萃取槽71、DNA精製槽72、PCR槽(反應用貯留區域)73、焦磷酸檢測裝置(包括檢測用貯留區域)50、連接DNA萃取槽71和DNA精製槽72的通路74a、連接DNA精製槽72和PCR槽73的通路74b、連接PCR槽73和焦磷酸檢測裝置50的通路74c。特別是通路74b分為兩股而分設有兩套PCR槽73、焦磷酸檢測裝置50、連接PCR槽73和焦磷酸檢測裝置50的通路74c。
使用晶片53b，與分別向兩個PCR槽73導入互不相同的分型引物，由此就能同時判別兩個SNP部位的鹼基種類。另外，在一個SNP部位，能同時導入兩種分型引物，這有益於SNP部位的鹼基種類的決定。
圖9為本實施方式的另一晶片(縱型晶片)的立體示意圖。
如圖9所示，晶片90設有樣品導入部91、DNA精製部92、PCR部93、焦磷酸檢測裝置50。
樣品導入部91包括樣品導入槽91a和DNA萃取柱91b。將根據需要用藥液處理的血液、唾液、頭髮以及毛根等試料溶液，注入樣品導入槽91a，通過DNA萃取柱91b。另外，血液、唾液等液體也可不經藥液處理注入樣品導入槽91a。
DNA精製部92包括DNA精製槽92a和DNA精製柱92b。將通過DNA萃取柱91b的試料溶液導入DNA精製槽92a，然後再通過DNA精製柱92b。
PCR部93包括PCR槽(反應用貯留區域)93a和隔離部件93b。將含有利用通過DNA精製柱92b而精製的DNA的試料溶液導入PCR槽93a，並添加DNA、分型引物、DNA聚合酶以及4種dNTP。由此，產生PCR(引物伸長反應)。
隔離部件93b形成可由上述鹼基種類判別裝置60的反應機構51開關的結構。在PCR槽93a中，當PCR結束時，反應機構51打開隔離部件93b，使試料溶液通過焦磷酸檢測裝置(包括檢測用貯留區域)。
另外，在上述晶片53a、53b、90中，為具備DNA精製槽72或92a的結構，在此，為防止試料溶液中含有PCR反應阻礙物或使PCR反的阻礙物不具有活性，需要對試料溶液進行充分處理。
因焦磷酸檢測裝置50具有如上所述結構，所以在此省略說明。另外，也可不使用焦磷酸檢測裝置50，而是採用將H+濃度變化轉換為光變化或電變化、可檢測該光學變化或電變化的裝置。
在本實施方式中，通過檢測焦磷酸量，分析引物伸長反應進行差異，當然，不局限於引物伸長反應，還能正確測定存在於試料溶液中的焦磷酸量。
另外，特別是在引物伸長反應中，ATP以及dATP為H+焦磷酸酶的阻礙劑，所以在試料溶液中存在ATP以及dATP且焦磷酸量少的情況下，H+濃度幾乎沒有變化。相反，在通過引物伸長反應消耗了試料溶液中的dATP且焦磷酸量大的情況下，H+濃度變大。即，能將更大的差異作為引物伸長反應進行差異的測定差。因此，能以很高的精度判別鹼基種類。
(實施方式2)在本實施方式中，說明判別試料中是否含有具有特定鹼基序列的DNA的方法，即，具有特定鹼基序列的DNA的檢測方法。一邊參照圖10一邊具體說明使用4種dNTP利用引物伸長反應的方法(例如PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等的放大反應)。圖10為判別本實施方式的試料中是否含有具有特定鹼基序列的DNA的方法的工序示意圖。
在本實施方式的方法中，使用含有可與具有特定鹼基序列的DNA互補結合的鹼基序列的引物。
首先，在圖10(a)所示工序中，將含有可與具有特定鹼基序列的DNA互補結合的鹼基序列的引物101、DNA聚合酶和4種dNTP添加到欲判別是否含有具有特定鹼基序列的DNA溶液中，調製成試料溶液100。另外，使引物101可與具有特定鹼基序列的單鏈DNA完全雜交。
接著，用如圖10(b)所示的工序進行試料溶液100的熱處理。由此，使試料溶液100中所含DNA大部分是單鏈DNA。
接著，用如圖10(c)所示的工序冷卻試料溶液100。由此，當試料溶液100中存在由具有特定鹼基序列的DNA生成的單鏈DNA102時，引物101與單鏈DNA102雜交。
接著，用如圖10(d)所示的工序，調節試料溶液100的溫度到最適於引物伸長反應的溫度。在存在單鏈DNA102的情況下，引物101與單鏈DNA102完全雜交，所以產生引物伸長反應。因此，由DNA聚合酶8消耗dNTP而生成焦磷酸。
另外，此時，在不存在具有特定鹼基序列的單鏈DNA102的情況下，引物101不能雜交。因此，難以產生引物伸長反應。因此，幾乎沒有消耗dNTP，幾乎沒有生成焦磷酸。
接著，通過定性檢測焦磷酸，判別有無進行引物伸長反應。當判別存在焦磷酸時，就可判定進行了引物伸長反應。而且，可判定試料中存在具有特定鹼基序列的DNA。另一方面，當判別不存在焦磷酸時，就可判定引物伸長反應沒有進行。而且，可判定試料中不存在具有特定鹼基序列的DNA。即，能判別是否具有特定鹼基序列的DNA。另外，本實施方式的焦磷酸的定性檢測方法與上述實施方式1完全相同，故此處省略說明。
如上所述，通過使用試料中具有特定鹼基序列的核酸的放大法中生成的焦磷酸、H+焦磷酸酶分析H+濃度變化，就能判別試料中是否存在具有特定鹼基序列的核酸。另外，應用本實施方式的方法，將使用與具有某種特定鹼基序列的核酸互補的引物進行引物伸長反應生成的焦磷酸量，與使用以通過反應生成的焦磷酸量為標準的序列的引物進行引物伸長反應生成的焦磷酸量相比，由此，也能對成為某種特定鹼基序列的標準的鹼基序列進行相對定量。
另外，由本實施方式說明的判別具有特定鹼基序列的核酸是否存在的方法可使用上述實施方式1中說明的焦磷酸檢測裝置50、鹼基種類判別裝置60以及晶片53a、53b或90進行實施。
另外，在上述實施方式1和2中，說明使用4種dNTP利用引物伸長反應的方法，當然，也能利用現有技術中一邊參照圖21和22一邊說明的、使用1種dNTP(或ddNTP)的引物伸長反應。另外，也可以與使用包括分型引物的兩種以上引物的PCR法等具有特定鹼基序列的核酸放大法並用。另外，分型引物也不限於具有3′末端對應於SNP部位、與SNP部位鄰接的鹼基序列完全互補的鹼基序列的引物，只要是根據引物伸長反應進行程度可判別鹼基種類的引物即可。例如，可使用具有3′末端對應於SNP部位、與SNP部位鄰接的鹼基序列除單鹼基之外完全互補的鹼基序列的引物，與3′末端鄰接的部位與SNP部位對應的引物等公知的引物。即，可使用H+焦磷酸酶分析具有含有作為分析對象的SNP部位的鹼基序列的核酸的放大，進行SNP部位的鹼基種類的判別。
當然，根據上述實施方式1的方法，不僅能判別SNP部位的鹼基種類，也能判別特定鹼基序列。
另外，在上述實施方式1和2中，對DNA鹼基序列中的鹼基種類的判別以及DNA的檢測作出了說明，當然，不局限於DNA，同樣也能進行RNA鹼基序列中的鹼基種類的判別以及RNA的檢測。而且，作為試料，使用單鏈DNA、雙鏈DNA均可。
(焦磷酸的檢測實驗1)本實施例以Shizuo Yoshida等人的方法(Masayoshi Maeshima andShizuo Yoshida、1989年、J.Biol.Chem.、264(33)、20068-20073頁)為標準，如下所示進行。
首先，由源自綠豆的液泡膜構成的膜小胞溶於由Tris/Mes緩衝液(濃度5mM、pH7.0)、山梨糖醇(濃度0.25M)、DTT(濃度2mM)構成的溶液中而構成液泡膜的膜小胞懸濁液。
接著，將該懸濁液混合在由MgSO4(濃度1mM)、KCl(濃度50mM)、山梨糖醇(濃度0.25M)、吖啶橙(pH敏性色素、濃度3μM)、二羥乙基呱嗪乙烷磺酸(Hepes)/Bristris propane(濃度25mM、pH7.2)構成的反應液中，作為H+-焦磷酸酶液。
接著，將該H+焦磷酸酶液平均分注於4根試管中，分別添加焦磷酸鈉溶液使其中焦磷酸鈉最終濃度分別為10μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，開始由焦磷酸的H+-焦磷酸酶導致的水解反應。
在本實施例中，向上述各反應液照射493nm的雷射，分析添加焦磷酸鈉溶液前後的540nm的螢光強度變化。其結果如圖11所示。
圖11為焦磷酸鈉的濃度與540nm螢光強度變化的關係曲線圖。在此，用對應於各焦磷酸鈉濃度的反應液中的每單位秒的消光率表示540nm的螢光強度變化。另外，以焦磷酸鈉的最終濃度為100μM的反應液中每單位秒的消光率為100％，換算對應於各焦磷酸鈉濃度的反應液中的每單位秒的消光率。
如圖11所示，得到焦磷酸鈉的濃度與吖啶橙的每秒消光率約呈雙曲線函數關係而變化的結果。由此可知，通過測定吖啶橙的每秒消光率，能定量檢測焦磷酸。
(焦磷酸的檢測實驗2)本實施例，以Masasuke Yoshida等的方法為標準(MasaH.Sato、Masahiko Kasahara、Noriyuki Ishii、Haruo Homareda、Hideo Matsui以及Masasuke Yoshida、1994年、J.Biol.Chem.、269(9)、6725-6728頁)，如下所示進行。
首先，由南瓜種子進行液泡膜H+-焦磷酸酶的精製。
接著，將精製得到的液泡膜H+-焦磷酸酶添加到由大豆的縮醛磷脂醯膽鹼和膽固醇調製的脂質混合液中，調製成液泡膜H+-焦磷酸酶的蛋白核蛋白體液。該蛋白核蛋白體液混合在由山梨糖醇(濃度0.25M)、Tricime-Na(濃度10mM、pH7.5)、EGTA(濃度0.1M)、KCl(濃度50mM)、ォクソノ一ルV(膜電位敏性色素、濃度0.2μM)構成的反應液中後，平均分注於5根試管中。
接著，向5根試管中分別添加焦磷酸鈉溶液使其中焦磷酸鈉最終濃度分別為10μM、20μM、40μM、60μM、80μM以及100μM，開始由焦磷酸的H+-焦磷酸酶導致的水解反應。
在本實施例中，向上述各反應液照射610nm的雷射，通過測定添加焦磷酸鈉溶液前後的639nm的螢光強度變化，分析添加焦磷酸鈉溶液前後各反應液含有的蛋白核蛋白體的膜電位變化。其結果如圖12所示。
圖12為焦磷酸鈉的濃度與639nm螢光強度變化的關係曲線圖。在此，用對應於各焦磷酸鈉濃度的反應液中的每單位秒的消光率表示639nm的螢光強度變化。另外，以焦磷酸鈉的最終濃度為100μM的反應液中每單位秒的消光率為100％，換算對應於各焦磷酸鈉濃度的反應液中的每單位秒的消光率。
如圖12所示，得到焦磷酸鈉的濃度與ォクソノ一ルV的每秒消光率約呈雙曲線函數關係而變化的結果。由此可知，通過測定ォクソノ一ルV的每秒消光率，能定量檢測焦磷酸。
(焦磷酸的檢測實驗3)本實施例是以特開平6-90736號公報提出的方法為標準進行的。
首先，使用與上述實施例同樣的來自南瓜種子液泡膜H+-焦磷酸酶，將含有液泡膜H+-焦磷酸酶的脂質雙層固定在市售的ISFET-pH傳感器上。但是，脂質二重層的外部充滿由MgSO4(濃度1mM)、KCl(濃度50mM)、山梨糖醇(濃度0.25M)、Hepes/Bristris propane(濃度25mM、pH7.2)構成的反應溶液。
接著，使用固定有含有上述液泡膜H+-焦磷酸酶的脂質雙層的ISFET-pH傳感器，測定添加焦磷酸鈉溶液、使上述反應溶液中的焦磷酸鈉的最終濃度分別為20μM、40μM、60μM、80μM以及100μM時的pH值。其結果如圖13所示。
如圖13所示，得到根據焦磷酸鈉的濃度pH值減少的結果。由此可知，通過測定pH值，能定量檢測焦磷酸。
實施例1在本實施例中，進行試料中的λDNA(λDNA的全鹼基序列參照Gen Bank資料庫的Accession No.V00636、J02459、M17233、X00906)的檢測。
首先，準備λDNA(寶酒造(株)制)以10ng/μL的濃度溶解於蒸餾水中的試料溶液A以及只由蒸餾水構成的試料溶液B。另外，如圖14(a)所示，準備將λDNA的特定鹼基序列完全雜交得到的兩種引物C以及引物D分別溶於蒸餾水的引物溶液E以及F(任一種都為20μM)。
分別向上述試料溶液A以及B中添加TaKaRa La Taq(5U/μL、寶酒造(株)制)、TaKaRa La Taq的專用緩衝劑2×GC緩衝液I(寶酒造(株)制)、dNTP混合物(各濃度2.5mM、寶酒造(株)制)以及引物溶液E和F，調製圖14(b)示的組成的PCR反應液G和H。
接著，在圖14(c)所示的反應條件下，分別對PCR反應液G和H進行PCR反應。
PCR反應結束後，使PCR反應液G以及H分別與上述實施例1所述的H+-焦磷酸酶液混合反應。
在本實施例中，分別對PCR反應液G以及H與H+-焦磷酸酶液混合前後的吖啶橙螢光強度變化進行分析。吖啶橙螢光強度分析是照射493nm的雷射、對540nm的螢光強度進行分析。其結果如圖15(a)所示。
圖15(a)表示PCR反應液G以及H分別與H+-焦磷酸酶液混合前後的螢光強度變化率。另外，螢光強度變化率用圖15(b)所示式子表示。
如圖15(a)所示，PCR反應液G與PCR反應液H相比，明顯螢光強度變化率大。即，可知，在PCR反應液G中生成焦磷酸、進行了引物伸長反應。根據該結果，可判定在PCR反應液G中存在標的核酸。因此可知，通過測定吖啶橙的螢光強度能檢測標的核酸。
實施例2在本實施例中，製作人為地將λDNA的鹼基序列內的鹼基置換為其它鹼基變異型λDNA，研究是否能判別通常的λDNA和變異型λDNA。
首先，使用λDNA(寶酒造(株)制)製作變異型λDNA。變異型λDNA是用本領域從業人員都知道的方法將圖16所示的λDNA(以下將通常的λDNA記為野生型λDNA)的雙鏈DNA序列內存在的GC鹼基對(圖中的區域R1)人為地置換為AT鹼基對(圖中的區域R2)。
接著，將野生型λDNA以及變異型λDNA以最終濃度為10ng/μL的方式溶解於蒸餾水中的產物分別作為野生型λDNA液以及變異型λDNA液。
接著，為了判別上述鹼基的不同，準備如圖16(a)所示的分型引物。接著，調製成將分型引物以最終濃度為20μM的方式溶解於蒸餾水中得到的分型引物溶液。
另外，使如圖16(a)所示的分型引物與野生型λDNA的下段所記錄的單鏈DNA完全雜交。但是，該分型引物3′末端的G不能與變異型λDNA的下段所記錄的單鏈DNA雜交。因此，使用該分型引物進行引物伸長反應時，野生型λDNA反應進行良好，但是變異型λDNA不怎麼進行反應。
另外，還準備上述實施例4所用的引物溶液F。
接著，對野生型λDNA液以及變異型λDNA液分別使用TaKaRa LaTaq(5U/μL、寶酒造(株)制)、TaKaRa La Taq專用緩衝劑10×PCR緩衝液(寶酒造(株)制)、dNTP混合物(濃度各2.5mM、寶酒造(株)制)、分型引物溶液E以及引物溶液F，調製圖16(b)所示組成的PCR反應液I以及J。
接著，使PCR反應液I以及J分別在圖16(c)所示的反應條件下進行PCR反應。
PCR反應結束後，使PCR反應液I以及J分別與H+-焦磷酸酶·核蛋白體液混合反應。H+-焦磷酸酶·核蛋白體液是以Masasuke Yoshida等人的方法(Masa H.Sato、Masahiko Kasahara、Noriyuki Ishii、HaruoHomareda、Hideo Matsui、Masasuke Yoshida、1994年、J.Biol.Chem.、269(9)、6725-6728頁)為標準調製的。
具體地是，首先，由南瓜的種子進行液泡膜H+-焦磷酸酶的精製。接著，將精製得到的液泡膜H+-焦磷酸酶添加到由大豆的縮醛磷脂醯膽鹼和膽固醇調製的脂質混合液中，調製成液泡膜H+-焦磷酸酶的蛋白核蛋白體液。該蛋白核蛋白體液混合在由山梨糖醇(濃度0.25M)、Tricine-Na(濃度10mM、pH7.5)、EGTA(濃度0.1M)、KCl(濃度50mM)、ォクソノ一ルV(膜電位敏性色素、濃度0.2μM)構成的反應液中，將此作為H+-焦磷酸酶·蛋白核蛋白體液。
在本實施例中，向上述各PCR反應液照射610nm的雷射，通過測定添加焦磷酸鈉溶液前後的ォクソノ一ルV的639nm的螢光強度變化，分析各反應液所含蛋白核蛋白體液的膜電位變化。其結果如圖17所示。
圖17分別為PCR反應液I以及J混合前後的螢光強度變化率。如圖17所示，明顯地，PCR反應液I比變異型PCR反應液J螢光強度變化率大。這是因為在PCR反應液J中PCR反應沒有良好地進行，但是，在PCR反應液I中進行良好，其結果是，生成的焦磷酸與存在於核蛋白體中的H+-焦磷酸酶反應，H+被輸送到核蛋白體內。
因此可知，通過本實施例能判別DNA特定鹼基序列中的單鹼基對的不同。即，本實施例的方法對於SNP部位的鹼基種類的判別、由突變引起的單鹼基對的變異等特定鹼基種類的判別是非常有效的。
實施例3本實施例與上述實施例5不同，用組合單鹼基伸長反應和H+-焦磷酸酶的反應的方法，研究是否能判別野生型λDNA和變異型λDNA之間的單鹼基對的不同。
首先，與上述實施例5相同，調製將野生型λDNA以及變異型λDNA以最終濃度為5mM的方式溶解於蒸餾水中的野生型λDNA(5mM)液以及變異型λDNA(5mM)液。
接著，準備如圖18(a)所示的引物。該引物是在實施例5中圖16(a)所示的野生型λDNA的下段側單鏈DNA與除去5′末端的C的序列完全雜交而得到的。即，同樣，實施例5所示的變異型λDNA序列的下段側的單鏈DNA序列中，也與除去5′末端的T的序列完全雜交而得到引物。
接著，調製將該引物以最終濃度為0.2mM的方式溶解於蒸餾水中的引物溶液M。
接著，對野生型λDNA(5mM)液以及變異型液λDNA(5mM)液分別使用TaKaRa Taq(5U/μL、寶酒造(株)制)、TaKaRa Taq專用緩衝劑10×PCR緩衝液(寶酒造(株)制)、2.5mM的dNTP溶液以及引物溶液M，調製成圖18(b)所示組成的伸長反應液K和L。
接著，分別對伸長反應液K以及L，在圖18(c)所示的反應溫度條件下進行單鹼基的伸長反應。
單鹼基伸長反應結束後，將各伸長反應液導入到固定H+-焦磷酸酶的修飾ISFET電極。修飾ISFET電極是上述實施例3中所用的電極。
使用該修飾ISFET電極，測定添加各伸長反應液時的各pH值。結果，相對於伸長反應液K時的pH6.89，伸長反應液L的pH為6.02。該結果是因為，在含有野生型λDNA的伸長反應液K中沒有產生伸長反應，但在含有變異型λDNA的伸長反應液L中產生由dATP導致的單鹼基伸長反應，其結果是生成的焦磷酸與修飾ISFET電極上的H+-焦磷酸酶反應，H+被輸送到修飾ISFET電極側。
由此可知，通過本方法能判別標的核酸的鹼基序列中的單鹼基對的不同。即，本方法對於SNP部位鹼基種類的判別、因突變導致的單鹼基對的置換等特定鹼基序列的判別是非常有效的方法。
產業上的可利用性本發明鹼基種類判別方法以及鹼基種類判別裝置可用於SNP部位的鹼基種類的判別，因此，對於基於SNP定型的投藥這樣的專門醫療非常有用。另外，本發明的鹼基判別方法以及鹼基種類判別裝置對DNA鹼基序列中的突變的分析非常有用，其分析結果可用於藥物發明或臨床。
本發明的核酸檢測方法對遺傳病的診斷、由細菌以及病毒等造成的食品汙染檢查和細菌以及病毒等對人體的感染檢查非常有用。
權利要求
1.一種檢測引物伸長反應的引物伸長反應檢測方法，其特徵在於，包括工序(a)，調製含有核酸、具備含有與所述核酸互補結合的互補結合區域的鹼基序列的引物、以及核苷酸的試料溶液；工序(b)，將所述試料溶液置於發生所述伸長反應的條件下，在發生所述伸長反應的情況下生成焦磷酸；工序(c)，使所述試料溶液與具有貫穿H+難透性膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+難透性膜的表面接觸；工序(d)，在將所述H+-焦磷酸酶浸入溶液的狀態下，測定所述H+難透性膜表面側溶液或所述H+難透性膜內面側溶液中至少任一方的H+濃度；和基於工序(d)的測定結果，檢測所述伸長反應的工序(e)。
2.一種判別核酸鹼基序列中的鹼基種類的鹼基種類判別方法，其特徵在於，包括工序(a)，調製含有核酸、具備含有與所述核酸互補結合的互補結合區域的鹼基序列的引物、以及核苷酸的試料溶液；工序(b)，將所述試料溶液置於發生所述引物伸長反應的條件下，在發生所述伸長反應的情況下生成焦磷酸；工序(c)，使所述試料溶液與具有貫穿H+難透性膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+難透性膜的表面接觸；工序(d)，在將所述H+-焦磷酸酶浸入溶液的狀態下，測定所述H+難透性膜表面側溶液或所述H+難透性膜內面側溶液中至少任一側的H+濃度；基於工序(d)的測定結果，檢測所述伸長反應的工序(e)；和基於工序(e)的檢測結果判別所述核酸的鹼基序列中的鹼基種類的工序(f)。
3.如權利要求2所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，在工序(d)中測定所述表面側溶液的H+濃度與工序(b)之後、工序(c)之前的所述試料溶液的H+濃度之差。
4.如權利要求3所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，在工序(e)中，將工序(d)的測定結果與對照值比較，檢測所述伸長反應。
5.如權利要求4所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，所述鹼基種類的判別是指SNP部位的鹼基種類的判別，所述對照值為使用所述SNP部位沒有變異的核酸作為所述核酸進行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)得到的測定結果。
6.如權利要求2所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，在工序(d)中，檢測所述內面側溶液的H+濃度；在工序(e)中，將工序(d)的測定結果與對照值比較，檢測所述伸長反應。
7.根據權利要求6所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，所述鹼基的判別是SNP部位的鹼基的判別；在工序(a)中，使用所述核苷酸作為一種核苷酸；所述對照值為使用與所述SNP部位的鹼基種類不同的核酸作為所述核酸進行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的測定結果。
8.如權利要求2所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，在工序(d)中，採用光學方法測定所述H+濃度。
9.如權利要求8所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，在工序(d)中，將pH敏性色素或膜電位敏性色素添加到所述表面側溶液和所述內面側溶液中的至少任一方中。
10.如權利要求9所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，在工序(d)中，將吖啶橙或OksorV添加到所述表面側溶液和所述內面側溶液中至少任一方中。
11.如權利要求2所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，在工序(d)中，採用電學方法測定所述H+濃度。
12.如權利要求2所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，所述伸長反應是根據PCR法的伸長反應。
13.一種鹼基種類判別裝置，用於判別核酸的鹼基序列中的鹼基種類，其特徵在於，具有引物伸長反應中進行必要的溫度調節的反應部和檢測隨著所述引物伸長反應而生成的焦磷酸的焦磷酸檢測部；所述反應部具有用於貯留溶液的反應用貯留區域；所述焦磷酸檢測部具有用於貯留溶液的檢測用貯留區域、將所述檢測用貯留區域分成第一區域和第二區域的H+難透性膜、用於測定貯留在第一區域和第二區域至少任一方的區域中的溶液的H+濃度的測定機構；所述H+難透性膜具有貫穿膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶；在所述焦磷酸檢測部中，由所述反應部送出的反應溶液貯留於第一區域。
14.如權利要求13所述的鹼基種類判別裝置，其特徵在於，所述測定機構採用光學方法測定H+濃度。
15.如權利要求13所述的鹼基種類判別裝置，其特徵在於，所述測定機構採用電學方法測定H+濃度。
16.如權利要求13所述的鹼基種類判別裝置，其特徵在於，還設有控制所述反應部以及所述焦磷酸檢測部、對由所述測定機構測定的結果進行分析的分析機構。
17.如權利要求13所述的鹼基種類判別裝置，其特徵在於，還設有可插入具有所述反應用貯留區域和所述檢測用貯留區域的晶片的插槽。
18.一種焦磷酸檢測裝置，其特徵在於，具有容器；將所述容器內部分成第一區域和第二區域的H+難透性膜；與貯留於第一區域的溶液相接觸的電極；與貯留於第二區域的溶液相接觸的H+敏性電極。所述H+難透性膜具有貫穿膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶。
19.一種核酸檢測方法，用於檢測具有特定鹼基序列的核酸，其特徵在於，包括工序(a)，調製含有試料、具備含有與所述核酸互補結合的互補結合區域的鹼基序列的引物、以及核苷酸的試料溶液；工序(b)，將所述試料溶液置於發生所述引物伸長反應的條件下，在發生所述伸長反應的情況下生成焦磷酸；工序(c)，使所述試料溶液與具有貫穿H+難透性膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+難透性膜的表面接觸；工序(d)，在將所述H+-焦磷酸酶浸入溶液的狀態下，測定所述H+難透性膜表面側溶液或所述H+難透性膜內面側溶液中至少任一側的H+濃度；基於工序(d)的測定結果，檢測所述伸長反應的工序(e)；和基於工序(e)的檢測結果檢測所述核酸的工序(f)。
20.如權利要求19所述的核酸檢測方法，其特徵在於，工序(d)中測定所述表面側溶液的H+濃度與工序(b)之後、工序(c)之前的所述試料溶液的H+濃度之差。
21.如權利要求20所述的核酸檢測方法，其特徵在於，在工序(e)中，將工序(d)的測定結果與對照值比較，檢測所述伸長反應。
22.如權利要求21所述的核酸檢測方法，其特徵在於，所述對照值為使用不含核酸的所述試料進行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的測定結果。
23.如權利要求19所述的核酸檢測方法，其特徵在於，在工序(d)中，所述H+濃度採用光學方法測定。
24.如權利要求23所述的核酸檢測方法，其特徵在於，在工序(d)中，將pH敏性色素或膜電位敏性色素添加到所述表面側溶液和所述內面側溶液中的至少任一方中。
25.如權利要求24所述的核酸的檢測方法，其特徵在於，在工序(d)中將吖啶橙或OksorV添加到所述表面側溶液和所述內面側溶液中至少任一方中。
26.如權利要求19所述的鹼基種類判別方法，其特徵在於，在工序(d)中，採用電學方法測定所述H+濃度。
27.如權利要求19所述的鹼基種類檢測方法，其特徵在於，所述伸長反應是根據PCR法的伸長反應。
28.一種試料溶液導入晶片，其特徵在於，設有用於進行引物伸長反應的反應槽；用於檢測焦磷酸的焦磷酸檢測槽；用於連接所述反應槽和所述焦磷酸槽的通路。
29.如權利要求28所述的試料溶液導入晶片，其特徵在於，所述通路可開關。
30.如權利要求28所述的試料溶液導入晶片，其特徵在於，所述焦磷酸檢測槽具有由H+難透性膜分離的第一區域和第二區域；所述H+難透性膜具有貫穿膜內外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶；所述焦磷酸檢測槽中，由所述反應槽經所述通路送出的反應溶液貯留於第一區域。
全文摘要
本發明提供一種判別核酸鹼基序列中的鹼基種類的簡便技術。包括工序(a)，調製含有核酸、具備含有與上述核酸互補結合的互補結合區域的鹼基序列引物、以及核苷酸的試料溶液；工序(b)，將該試料溶液置於發生伸長反應的條件下，在該條件下生成焦磷酸；工序(c)，使該試料溶液與具有貫穿H
文檔編號C12Q1/68GK1500887SQ03154499
公開日2004年6月2日 申請日期2003年9月29日 優先權日2002年10月1日
發明者夜久英信, 行政哲男, 岡弘章, 男 申請人:松下電器產業株式會社