糖肽類的純化的製作方法
2023-06-13 19:42:11
專利名稱：糖肽類的純化的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的和改進的純化糖肽類，特別是糖肽類抗生素的方法。該方法包括使該糖肽的溶液與離子交換色譜法材料接觸。這種方法的產物具有令人意外的高純度。
背景技術：
基於其化學結構，糖肽類抗生素可以分為四組(根據Yao，R.C.and Crandall，L.W.，Glycopeptides，Classification，Occurrence，andDiscovery in Glycopeptide antibiotics，ed.Nagarajan，R.，MarcelDekker，Inc.，N.Y，N.Y.，Chapter 1，pp.1-27(1994))-I組(或萬古黴素型)在1和3位有脂族胺基酸；-II組(或阿伏帕星型)在1和3位有芳香族胺基酸殘基；-III組(或利託菌素型)，如果在1和3位沒有連接芳香族胺基酸的醚鍵，則與II組類似；以及-IV組(或替考拉寧型)具有與III組相同的胺基酸排列，加上附著於氨基糖上的脂肪酸殘基。
在US 4,845,194A和EP 836 619 B1中列出了糖肽類抗生素的例子，其中使用了關於糖肽類抗生素的術語dalbaheptide。可以按照本領域中所公開的方法，例如通過發酵，來生產糖肽類。
替考拉寧是由垣黴素遊動放線菌(Actinoplanes teichomyceticus)產生的糖肽類抗生素，並且是在旨在發現抑制細菌細胞壁合成的新微生物來源的分子的科學研究計劃期間被發現的(Goldstein，B，等，Teicoplanin in Glycopeptide Antibiotics，ed.Nagarajan，R.，MarcelDekker，Inc.，N.Y，N.Y.，Chapter 8，pp.273-307(1994))。1978年對其進行了首次描述並且10年後在義大利將其引入臨床實踐中(Parenti，F.等，J.Chemotherapy，Vol.12，pp.5-14，(2000))。
已經公開了純化糖肽類抗生素的許多方法。根據在EP 479086 B1中公開的方法，為了增加替考拉寧A2的提取效率，在過濾之前，將發酵液的pH調整到10和11.5之間。將發酵液的濾液加載到聚醯胺樹脂上並且用過量的丙酮將替考拉寧從洗脫物中沉澱並放置3小時。潷析上清液並且過濾其餘部分。用丙酮洗滌得到的濾餅，以回收替考拉寧A2。該方法有溶劑蓄積的問題，因為它在多個步驟中使用了過量的丙酮。
美國專利4,845,194公開了回收萬古黴素型糖肽類抗生素(例如替考拉寧和萬古黴素)的方法，其中將有2％或更少交聯的陽離子交換樹脂加到發酵液中以將替考拉寧吸附到樹脂上，並且使用100目篩從樹脂中分離菌絲體。然後，用純化水洗滌樹脂，然後洗脫回收替考拉寧。
韓國專利公開No.2000-0066479公開了生產替考拉寧A2的方法，其中將發酵液調整到pH 11並離心，並且將上清液吸附到合成吸附樹脂例如XAD-16、HP-20和活性炭或矽膠上，用50到80％甲醇溶液洗脫並在減壓下進行回收以獲得粗粉形式的替考拉寧。將粗製替考拉寧溶解於醋酸鈉溶液中並通過糖親和色譜法進行純化。
美國專利申請20040024177 A1公開了純化替考拉寧A2的方法，該方法包括(i)使用合成吸附劑純化菌株發酵液的濾液的最初預純化步驟；(ii)使用具有高度交聯的陽離子交換樹脂、催化樹脂或螯合樹脂純化最初預純化溶液的第二預純化步驟；(iii)使用反相樹脂純化第二預純化溶液的最終純化步驟；和(iv)形成粉末的步驟。
發明概述對可以用於大量生產高純度的糖肽類抗生素的方法仍然存在需求。根據本發明，通過離子交換色譜法的新方法，獲得高純度的糖肽類抗生素是可能的。
本發明的發明人已令人意外地發現，通過使用一種方法獲得高純度的糖肽，特別是糖肽類抗生素是可能的，該方法包括對含糖肽的溶液進行離子交換色譜法，該溶液具有增加的鹽濃度和/或增加的溶液電導率。不希望被理論束縛，預期這種方法可以用來純化共享共同結構，也就是dalbaheptide結構的所有糖肽。
根據這種發現，提供了一種使用離子交換色譜法純化糖肽，特別是dalbaheptide型糖肽的方法，該方法包括將該糖肽的溶液中的鹽濃度升高(並從而升高溶液的電導率)至高於至今所公開的水平，同時允許糖肽與離子交換樹脂結合。
發明詳述本發明涉及一種純化糖肽類抗生素或其衍生物(或含有該糖肽類抗生素或其衍生物的溶液)的方法，該方法包括a)將該糖肽的溶液中的鹽濃度調節到至少0.2M，和/或將該糖肽的溶液的電導率調節到至少20mS/cm；b)使該糖肽的溶液與離子交換材料接觸；c)任選地洗滌該離子交換材料；以及d)使用洗脫劑從該離子交換材料中除去該糖肽。
優選地，糖肽類抗生素是寡肽(舉例來說七肽)抗生素，其特徵在於多環肽核，該肽核任選地被糖基團，例如選自由下列組成的組的抗生素取代dalbaheptide，I組的糖肽(萬古黴素型)；II組的糖肽(阿伏帕星型)；III組的糖肽(利託菌素型)；IV組的糖肽(替考拉寧型)；這些中任意的衍生物；這些中任意的各個因子；以及其組合。包括於該定義中的糖肽類的例子可以在Raymond C.Rao和Louise W.Crandall，″Glycopeptides Classification，Occurrence，andDiscovery″，(″Drugs and the Pharmaceutical Sciences″第63卷，Ramakrishnan Nagarajan編輯，Marcal Dekker，Inc.出版)中發現。糖肽類的其它例子被公開在美國專利Nos.4,639,433、4,643,987、4,497,802、4,698,327、5,591,714、5,840,684和5,843,889；EP 0 802 199、EP 0 801 075、EP 0667 353、WO 97/28812、WO 97/38702、WO98/52589、WO 98/52592和J.Amer.Chem.Soc.，1996，118，13107-13108；J.Amer.Chem.Soc.，1997，119，12041-12047；和J.Amer.Chem.Soc.，1994，116，4573-4590中。代表性的糖肽類包括鑑定為A477、A35512、A40926、A41030、A42867、A47934、A80407、A82846、A83850、A84575、AB-65、阿克拉寧、類放線菌素、阿達星、阿伏帕星、遠青黴素、Balhimycin、Chloroorientiein、氯多孢菌素、Decaplanin、N-去甲萬古黴素、伊瑞黴素、Galacardin、Helvecardin、伊肽菌素、凱勃孢囊菌素、LL-AM374、甘露糖肽素、MM45289、MM47756、MM47761、MM49721、MM47766、MM55260、MM55266、MM55270、MM56597、MM56598、OA-7653、Orenticin、寡子菌素、利託菌素、瑞斯託黴素、Synmonicin、替考拉寧、UK-68597、UK-69542、UK-72051、萬古黴素等的那些，以及這些中任意的衍生物。目前最令人感興趣的待純化的糖肽類抗生素是替考拉寧複合物(包括A2因子)，其由發酵液產生。
更優選地，糖肽選自由A40926、A84575、阿達星、凱勃孢囊菌素、MM55266、寡子菌素、萬古黴素、替考拉寧複合物及其因子和這些的衍生物組成的組。
術語「衍生物」包括仍含有環狀肽骨架(舉例來說dalbaheptide骨架)，但與上述糖肽類具有如下不同的糖肽類直接或間接地與骨架結合的取代基被除去或用其它的取代基替換。衍生物的例子是完全或部分去糖基化的糖肽，例如糖苷配基和本領域中，例如在WO 0198328A、WO 0183521 A、WO 03018607 A、WO 03018608 A、WO 03029270A、EP 201 251 A、US 20040087494 A1、US 5,164,484 A、US 5,916,873A中和在這些專利文獻的任意文獻中引用的參考文獻中公開的衍生物。
預期可以使用陰離子和陽離子交換材料二者，但目前優選離子交換材料是陰離子交換樹脂，優選其中主鏈具有聚合親水性質的陰離子交換樹脂，例如Macroprep High Q Support(BioRad)。
糖肽溶液的電導率優選在15mS/cm以上，更優選在20mS/cm以上，25mS/cm以上，或30mS/cm以上。電導率可以在40mS/cm以上。
優選在離子交換過程中的鹽濃度高於大約0.25M，例如高於0.30M或甚至高於0.35M或0.45M，並且優選在離子交換過程中的鹽濃度低於大約2.0M，例如低於1.5M，低於1.0M或甚至低於0.7M。目前優選鹽濃度在0.4到0.7M的範圍內。NaCl調節可以通過測量所加的鹽來進行。
與本發明聯繫可以用於調節溶液的鹽濃度和/或電導率的鹽類的例子是鹼金屬鹽類，例如選自由下列陰離子Cl-、HSO3-、BrO3-、Br-、NO3-、ClO3-、HSO4-、HCO3-、IO3-、HPO4-、甲酸根、乙酸根和丙酸根之—的鈉、鉀或鋰鹽組成的組。目前，優選NaCl。可以使用不同鹽的混合物。
可以使用(特別是與陰離子交換樹脂聯繫)的洗脫劑的例子是酸，例如選自由下列組成的組的酸A)弱有機酸，優選乙酸或檸檬酸；或B)由弱有機酸和相應的鹼組成的緩衝液，優選低於pH 4.5；和鹽，例如上面限定的鹽(包括其混合物)的溶液。
目前優選洗脫劑是乙酸，和/或該酸的濃度高於0.1M(例如高於0.3M、0.5M、0.8M)，並且目前優選其高於1.0M。然而，酸的濃度應低於6.0M，更優選低於4.0M。可以使用不同酸的混合物。如果將鹽的水溶液用作洗脫劑，鹽的濃度應優選地高於1.5M。適當的是，洗脫劑是乙酸，和/或該酸的濃度從0.1M到6.0M，更優選從1.0M到4.0M。可以使用不同酸的混合物。
本發明的具體實施方式
涉及如上方法，其進一步包括下列步驟a)獲得包含產生糖肽類抗生素的微生物的粗製發酵液；b)調節該粗製發酵液的pH到pH 8和pH 12之間；和c)使發酵液與產生糖肽類抗生素的微生物(菌絲團)分離，舉例來說通過離心或過濾，從而獲得包含糖肽類抗生素的溶液。
優選將pH調節到9-11，並且在0到25℃之間的溫度下；更優選在5和15℃之間的溫度下進行分離。
為獲得更純的糖肽，本發明的方法可以含有一個或多個純化步驟，例如選自由下列組成的組的純化步驟a)反相色譜法，舉例來說HPLC；b)吸收色譜法；c)過濾；d)反滲透；e)通過用活性炭或吸收樹脂處理的脫色；f)陽離子交換色譜法；h)沉澱；i)離心；j)親和色譜法；和k)液-液萃取，或例如選自上面的(a)到(i)。
可以用本領域技術人員已知的方式，舉例來說通過冷凍乾燥，從純化的溶液中分離固體糖肽。
在描述本發明的上下文中(特別是在下列權利要求的上下文中)，術語「a」和「an」和「the」及類似所指的對象的使用應解釋為覆蓋單數和複數二者，除非在此另外指出或清楚地與上下文相矛盾。除非另外提到，術語「含有」、「具有」、「包括」和「包含」應解釋為開放式術語(也就是，含義是「包括，但不限於」)。除非在此另外指出，在此列舉的數值範圍僅僅打算用作個別提及落入該範圍內的每個單獨的數值的速記方法，並且將每個單獨的數值合併入說明書中，好象在此個別地列舉它。
在此定義的所有數值應解釋為「大約」值，例如「2.0M」應理解為「大約2.0M」。
在此描述的所有方法可以以任意適當的順序進行，除非在此另外指出或另外清楚地與上下文相矛盾。在此提供的任意和全部例子，或例舉性語言(舉例來說，「例如」)的使用，僅僅打算更好地闡明本發明並且不造成對本發明範圍的限制，除非另外要求保護。在說明書中沒有語言應解釋為，表示任何未要求保護的要素對實踐本發明來說是必要的。
實驗實施例1獲得替考拉寧的水溶液實施例1a包含替考拉寧的發酵液是以本身已知的方式，例如在美國專利4,239,751中所公開的，通過發酵垣黴素遊動放線菌的培養物獲得的。
將來自實驗室發酵罐的5L包含替考拉寧的全部培養發酵液調節到pH9.5(通過添加1M NaOH)並且在攪拌下進行培養(brought)。在室溫，該溶液通過100μm深的濾器(Polygard，Millipore)進行過濾，然後在12-14℃進行超濾(500000Da，Biomax，Millipore)。殘餘的替考拉寧通過以批方式用4*0.5L水透濾(diafiltration)生物質進行回收。在最終澄清的溶液中，大約80％的存在於發酵液中的替考拉寧得到回收。
實施例1b將在實施例1a中獲得的500ml替考拉寧發酵液用1M NaOH調節到pH9.5，並且通過在10℃實驗室離心機中離心獲得無細胞的溶液。在最終澄清的溶液中，大約85％的存在於發酵液中的替考拉寧得到回收。
實施例2離子交換色譜法純化實施例2a替考拉寧因子A2(T A2)的陰離子交換色譜法純化通過添加1M HCl，將來自實施例1a的包含0.5g產物的澄清替考拉寧溶液調節到pH 8。添加NaCl至終濃度0.5M，得到大約50mS/cm的電導率。將甲基丙烯酸酯共聚物陰離子交換樹脂Macro-prep High Qsupport(Bio Rad)填充到色譜柱(內徑(i.d.)1.6cm，床高12cm，容量24ml)中，並且將製備的替考拉寧溶液以3.4ml/分鐘的流速加到柱上。在用192ml 3M乙酸洗脫產物之前，用48ml 0.5M NaCl溶液清洗柱。在洗脫池中回收了0.42g替考拉寧，並且通過操作，相同池的HPLC純度確實從大約70面積％增加到90面積％TA2，同時清除充分量的有色成分。
任選地，含有高NaCl濃度(也就是直到2M)的清洗步驟包括在色譜法過程中，得到還更高純度和更少顏色的最終產物池，只有較小的替考拉寧損失。
實施例2bTA2的陰離子交換色譜法純化通過加1M HCI，將來自實施例1a的包含0.5g產物的澄清替考拉寧溶液調節到pH8。添加NaCl至終濃度0.5M，產生大約50mS/cm的電導率。將基於瓊脂糖的陰離子交換樹脂Q Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)填充到色譜柱(內徑(i.d.)1.6cm，床高12cm，容量24ml)中，並且將製備的替考拉寧溶液以3.4ml/分鐘的流速加到柱上。在用192ml 3M乙酸洗脫產物之前，用48ml 0.5M NaCl-溶液清洗柱。在洗脫池中回收了0.35g替考拉寧，並且相同池的HPLC純度確實增加到大約85面積％TA2。
實施例2c用於純化TA2的陰離子交換色譜法在來自實施例1a的包含0.5g產物的澄清替考拉寧溶液中，添加NaHCO3至0.7M濃度，並且通過加1M HCl將溶液的pH調節到pH 8。其後，如在實施例2b中所描述，將該溶液應用到柱上。用48ml 0.7MNaHCO3-溶液清洗柱並用192ml 3M乙酸洗脫。在洗脫池中回收純化的替考拉寧。
實施例2d用於純化萬古黴素的陰離子交換色譜法包含萬古黴素的粗製發酵液可以根據美國專利No.5,223,413的程序進行生產並通過離心進行澄清。添加NaCl到包含0.5g產物的澄清萬古黴素溶液中，至濃度為0.5M並且將溶液的pH調節到pH 10(用1M NaOH)。其後，如在實施例2a中所描述，將萬古黴素溶液應用到柱上。用48ml 0.5M NaCl-溶液清洗柱然後用192ml 0.5M乙酸洗脫目的物(target)。在洗脫池中回收純化的萬古黴素。
實施例2e陽離子交換色譜法通過添加1M HCl，將來自實施例1a的包含0.5g產物的澄清替考拉寧溶液調節到pH 2.8。添加NaCl至終濃度為0.3M NaCl。將該溶液應用到用甲基丙烯酸酯共聚物陽離子交換樹脂，也就是Macro-prep High S support(Bio Rad)填充的柱(i.d.1.6cm，床高12cm，容量24ml)上。用48ml 0.3M NaCl-溶液清洗柱然後用192ml 0.2MpH6.0的醋酸鈉洗脫目的物。在洗脫池中回收純化的替考拉寧。
實施例3根據實施例1a中所描述的，通過發酵生產替考拉寧並使之澄清。將包含1.0g替考拉寧的等量澄清培養液與不同量的NaCl(見下表1)混合，以得到溶液中從0到1M的NaCl。在溶解後，如在實施例2a中所描述，將樣品以3.4ml/分鐘的流速應用到柱上。在用192ml 3M乙酸洗脫目的物之後，用與applisate中的相等摩爾濃度的48ml NaCl-溶液清洗柱。通過標準的HPLC方法，測定替考拉寧的結合能力和HPLC純度。選擇該池，使得面積％TA2為大約90％。
現將結果總結於下表1中表1
*應用0.5g產物代替1.0g替考拉寧，也獲得數值0.34並獲得了數值0.36
實施例4進一步純化澄清的(例如過濾的或離心的)發酵液可以在應用離子交換步驟之前進行純化，和/或來自離子交換步驟的溶液可以通過應用一種或多種純化方法，例如本身已知或如下面描述的方法進一步純化實施例4a陰離子交換前的替考拉寧的預純化-裝載到疏水性主鏈上通過添加1M HCl，將來自實施例1a的包含0.5g產物的澄清替考拉寧溶液調節到pH 8，並以0.7ml/分鐘的流速將其應用到用粗網眼脂族交聯的聚合物(XAD7HP，Rohm Haas)填充的柱(內徑(i.d.)1.6cm，高10cm，容量20ml)上。在結合後，在通過用100ml的50/50乙醇和水混合物洗脫回收替考拉寧之前，用80ml水清洗柱。在40℃，80毫巴，使用旋轉式蒸發器裝置，對得到的洗脫物進行蒸發。如在實施例2a中所描述的，對得到的無乙醇的溶液進行處理。
實施例4b通過加載到疏水作用樹脂上，進一步純化離子交換池中的TA2用疏水作用樹脂，也就是Octyl Sepharose Fast Flow(AmershamBiosciences)填充直徑1.6cm和床高10cm(容量20ml)的柱。將來自實施例2a的洗脫池添加硫酸銨至0.1M的濃度，並在pH 2.5並且以2.5ml/分鐘的流速加載到該柱上。用40ml 0.1M硫酸銨溶液清洗柱並用120ml水洗脫。在該操作中，回收了純化的並且顏色較少的替考拉寧溶液。
實施例4c通過加載到陽離子交換樹脂上，進一步純化離子交換池中的TA2將來自實施例2a-2c之一的包含0.35-0.45g替考拉寧的產物的pH2.5的乙酸溶液，以2.5ml/分鐘的流速應用到陽離子交換樹脂(Macro-prep High S support(Bio Rad)，內徑1.6cm，高10cm，容量20ml)上。用40ml 0.1M乙酸溶液清洗柱，接著用120ml 0.2M pH6.0的醋酸鈉洗脫目的物。在洗脫池中回收純化的替考拉寧。
實施例4d通過活性炭過濾對離子交換池中的TA2脫色在通過固定的活性炭過濾器(millistak+，13cm2filterarea，Millipore)過濾之前，將在實施例2a中收集的洗脫池添加75ml乙醇成50/50vol％混合物。該過濾器用25ml 50/50vol％水/乙醇混合物衝洗。在幾乎無色的產物溶液中回收替考拉寧。
實施例4e通過大小排阻色譜法對離子交換池中的TA2脫色將來自實施例2a的10ml洗脫池以1ml/分鐘的流速加載到30ml大小排阻柱(Superdex 30 prepgrade，Amersham Biosciences)上。樣品中大於替考拉寧的有色成分在替考拉寧之前被洗脫並由此被除去。
實施例4f通過添加有機溶劑，沉澱離子交換池中的TA2通過添加1370ml丙酮至終濃度為95％，使來自實施例2a的洗脫池內的替考拉寧從溶液中沉澱。通過過濾收穫沉澱並且隨後用10ml丙酮清洗濾餅兩次。其後在40℃真空爐中乾燥濾餅。在乾燥的濾餅中回收純化的替考拉寧。
在此描述了本發明優選的具體實施方式
，包括發明人已知的實施本發明的最佳方式。那些優選具體實施方式
的變化對本領域的普通技術人員來說，在閱讀了上文描述後可變得顯而易見。熟練的技術人員能提升在此公開的方法。發明人預期熟練的技術人員適當的時候應用這類變化，並且發明人打算以與在此具體描述的不同的實施方式實施本發明。因此，本發明包括按適用法律所允許的、在此附加的權利要求中列舉的主題的所有修改和等價物。此外，本發明包括在所有可能的變化中的上面所述要素的任意組合，除非在此另外指出或另外清楚地與上下文相矛盾。上面提到的專利文獻和科學論文中的每一篇通過參考在此將其全部併入本申請。
權利要求
1.一種純化糖肽類抗生素的方法，該方法包括a)將所述糖肽的溶液中的鹽濃度調節到至少0.2M，和/或將所述糖肽的溶液的電導率調節到至少20mS/cm；b)使所述糖肽的溶液與離子交換材料接觸；c)任選地洗滌所述離子交換材料；以及d)使用洗脫劑，從所述離子交換材料除去所述糖肽。
2.根據權利要求1的方法，其中將所述糖肽的溶液的電導率調節至20mS/cm以上。
3.根據任意前述權利要求的方法，其中所述糖肽類抗生素選自由下列物質組成的組dalbaheptide，I組的糖肽(萬古黴素型)；II組的糖肽(阿伏帕星型)；III組的糖肽(利託菌素型)；IV組的糖肽(替考拉寧型)；這些中任意的各個因子；這些中任意的衍生物；及其組合。
4.根據任意前述權利要求的方法，其中所述糖肽類抗生素選自由替考拉寧和萬古黴素組成的組。
5.根據任意前述權利要求的方法，其中所述離子交換材料是陰離子交換樹脂，優選其中主鏈具有聚合親水性質的陰離子交換樹脂。
6.根據任意前述權利要求的方法，其中所述糖肽的溶液的電導率在30mS/cm以上。
7.根據任意前述權利要求的方法，其中在離子交換過程中鹽濃度高於大約0.3M。
8.根據任意前述權利要求的方法，其中在離子交換過程中鹽濃度低於大約1.5M。
9.根據任意前述權利要求的方法，其中添加鹽，例如選自由下列鹽組成的組的鹼金屬鹽下列陰離子Cl-、HSO3-、BrO3-、Br-、NO3-、ClO3-、HSO4-、HCO3-、IO3-、HPO4-、甲酸根、乙酸根和丙酸根之一的鈉、鉀或鋰鹽；優選NaCl；用於調節溶液的鹽濃度和/或電導率。
10.根據前述權利要求的方法，其中所述洗脫劑是酸或鹽的溶液。
11.根據前述權利要求的方法，其中所述洗脫劑是酸，其選自由下列物質組成的組A)弱有機酸，優選乙酸或檸檬酸；以及B)由弱有機酸和相應的鹼組成的緩衝液，優選地低於pH4.5；並且優選其中該酸的濃度在0.1M至5.0M的範圍內。
12.含有糖肽類抗生素的溶液，其中該溶液的鹽濃度為至少0.2M，和/或其中所述糖肽的溶液的電導率為至少20mS/cm。
13.權利要求12中要求保護的溶液，其中所述糖肽類抗生素選自由替考拉寧和萬古黴素組成的組。
14.一種從權利要求12中要求保護的溶液中沉澱TA2的方法，該方法包括向其中添加有機溶劑，例如丙酮。
15.權利要求14中要求保護的方法，其中所述溶液是無色的。
全文摘要
一種新的和改進的純化糖肽類，特別是糖肽類抗生素的方法。該方法包括使該糖肽的溶液與離子交換色譜法材料接觸。這種方法的產物具有令人意外的高純度。
文檔編號C07K9/00GK101031582SQ200580032804
公開日2007年9月5日 申請日期2005年10月27日 優先權日2004年10月27日
發明者L·阿斯文, K·蘭道格, K·阿斯多普赫斯 申請人:阿爾法馬股份公司