B肝表面抗原－抗體複合物在製備對B肝疫苗無應答或低應答預防製品中的用途的製作方法

2023-06-13 07:29:16 2

專利名稱：B肝表面抗原－抗體複合物在製備對B肝疫苗無應答或低應答預防製品中的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬生物製品領域。涉及B肝表面抗原-抗體複合物的新用途，具體涉及B肝表面抗原-抗體複合物在製備對B肝疫苗無應答或低應答預防製品中的用途。
背景技術：
目前國內外已有的B肝預防性疫苗在預防B肝及肝癌的發生、發展方面做出了重要貢獻(Beasley RP et al，Lancet，21099，1983；Lo KJ et al，J Inf Dis152817，1985；沙慶洪等，病毒學報vol 7 suppl56，1991。現用於預防B肝的疫苗均由B肝表面抗原蛋白(HBsAg)製成，其來源為自血漿純化後滅活、用重組酵母基因工程菌表達或用哺乳類動物細胞表達後純化的B肝表面抗原蛋白(徐志一等，病毒學報vol 7 suppl48，1991；張權一等，病毒學報vol 7 suppl108；6 Sung JL，et al.Vaccine，8(suppl)95，1990)。正常成人、兒童或嬰兒接種上述B肝疫苗後的保護性作用主要表現為血清可產生對B肝表面抗原的抗體(抗-HBs)。然而在疫苗接種者中約有5-10％的健康接種者雖然全程接種了保證質量的B肝疫苗，但對B肝疫苗不產生抗-HBs，或僅產生低滴度的抗-HBs(一般以10mIU/ml，國際單位為最低的有效保護指標)，被稱為對B肝疫苗無應答或低應答者(Chiou SS et al Immunology，64545，1988；Magafuchi S et al.Lancet，21522，1987；Leroux-Roels，G et al.Acta Clin Belg 56209，2001)。曾有報導，這些無應答或低應答者如接觸B肝病毒仍可被感染並可發病(HadlerSC.New Engl J Med 315209，1986)。黑龍江省報導，全人群免疫接種B肝疫苗後抗-HBs陽轉率為81.97％(陳美徵等，病毒學報vol 7 suppl73，1991)，北京市的學者經過多年對疫苗接種的嬰兒隨訪，發現低、無應答的發生率為4.68-8.18％(龔曉紅等，疾病監測13447，1998)，中學生及成人中低、無應答的發生率約佔10-20％(龔曉紅等，中華預防醫學雜誌5(3)，1991)。在江蘇啟東進行的B肝疫苗接種預防肝癌群體現場中，也發現有約5％的疫苗接種者為低、無應答者。Das等也將對B肝疫苗無應答或低應答者定為5-10％(DasK，etal Trop Gastroenterol 25113，2004)。
對於B肝疫苗無應答或低應答的發生機制十分複雜，目前仍在研究中。在排除疫苗質量、接種技術或過程有問題的因素外，多數學者認為主要與個體的免疫應答低下有關。其中既包括整體免疫應答低下者(如腎透析病人)；也包括對其他疫苗可產生正常的免疫應答，僅對B肝疫苗無應答或低應答者。有學者認為與組織相容性抗原的特殊類型相關(De Silvestri et al.Genes Immun 2367，2001；Kremer J，et al.Immunol Lett.59；13，1997；Stachowski J，et al.NephrolDial Transplant 9144，1994)。國內外已採取了用增加現有B肝疫苗免疫用的劑量(由5-10微克加大至20-30微克)，增加注射次數(由3次增加至5-6次)等方法，雖然在部分對於B肝疫苗無應答或低應答者中誘生出合格滴度的抗-HBs.但仍有一定比例的正常人不能產生合格滴度的抗-HBs。另有學者採用了加用佐劑的方法。Decombere用B肝疫苗與佐劑AS04共免疫HLA DQ2型健康人(可能為對於B肝疫苗無應答或低應答者)，但因HLA DQ2不是對於B肝疫苗無應答或低應答的好指標而未能獲得結果(Desobere I，et al.Vaccine 202597，2002)。Mcdermott等用帶有PreS1/PreS2蛋白的HBsAg免疫對於B肝疫苗無應答或低應答者，雖有部分人出現了抗-HBs，在這部分人群中抗-HBs的滴度迅速下降，而且仍有一部分為無應答(McDermott AB，et al.J Viral Hepat Supp；2；9，1998)。Hervas-Stubbs則用了HBsAg加一段肽對無應答小鼠SJL/J免疫結果小鼠產生了抗-HBs，認為可能是一種有希望能改變對於B肝疫苗無應答或低應答者狀態的製品(Hervas-Stubbs S，et al.Vaccine 12867，1994)。Jungers等用HBsAg/Pre-S2/IL-2免疫對於B肝疫苗無應答或低應答者，但未能顯示其效果(Jungers P，et al.Lancet 344856，1994)。迄今，尚未見有關將B肝表面抗原-抗體複合物用於對於B肝疫苗無應答或低應答者使其產生合格滴度的抗-HBs的報導或專利申請。與本發明相關的文件還有Stachowski J，etal.Nephrol Dial Transplant 9144，1994；Desobere I，et al.Vaccine202597，2002；McDermott AB，et al.J Viral Hepat Supp；2；9，1998；Hervas-Stubbs S，et al.Vaccine 12867，1994；Jungers P，et al.Lancet344856，1994；Wen YM et al.Lancet 34567；Wen YM et al.Int Rev Immunol18351，1998；Wen YM et al US patent 6,221,664；Thoma et al US patent6,589,530；聞玉梅等中國發明專利ZL931124093。

發明內容
本發明的目的是提供B肝表面抗原-抗體複合物的預防新用途，具體涉及B肝表面抗原-抗體複合物在製備對B肝疫苗無應答或低應答預防製品中的用途。
本發明採用B肝表面抗原-抗體組成的複合物應用予對B肝疫苗無應答或低應答者，使這一人群產生合格量的抗-HBs，從而保護這一人群不被B肝病毒感染。
本發明在已有的組建B肝表面抗原-抗體複合物作為治療性疫苗技術的基礎，提供B肝表面抗原-抗體複合物的預防新用途。所述B肝表面抗原-抗體複合物的製備技術是已有技術(ZL931124093)，但本發明的應用領域完全不同，作用機理也不同。已有的B肝表面抗原-抗體複合物是治療已經B肝病毒感染，血清B肝表面抗原陽性，並已發病的慢性B肝病人。其機理是通過複合物中的抗體調控原來已對B肝表面抗原處於免疫耐受的抗原呈遞細胞，攝取B肝表面抗原，改變對B肝表面抗原的加工和呈遞，通過這一修飾過程，重新使病人的T，B細胞產生免疫應答，達到清除病毒的作用。因此是作為一種治療用的生物製品，實質是一類藥物。類似的製品邊不僅限於肝炎，還可用於治療腫瘤等。國際上將這類藥物稱為治療性疫苗(Cohen J Science 264503，1994.)。
本發明的的貢獻在於將B肝表面抗原-抗體複合物用於對B肝疫苗無應答或低應答的人體。所述人體並未感染過B肝病毒，因此體內沒有B肝病毒，也沒有B肝表面抗原。這一群體的問題是經過已有的B肝疫苗注射後不能正常應答，不能產生合格的抗-HBs。在這類人群中，B肝表面抗原-抗體複合物中的抗體是作為一種佐劑，通過抗體的輔佐作用，激活機體產生有效的抗-HBs。正如在注射一些已有的預防性疫苗時(如傷寒-副傷寒疫苗等)應選擇體內有抗體時加強注射，從而可以獲得更高的抗體效價。本發明採用B肝表面抗原-抗體複合物在這些對B肝疫苗無應答或低應答人體中可以誘生有效的抗-HBs，保護對B肝疫苗無應答或低應答者預防B肝病毒感染。可作為針對現有B肝疫苗無應答或低應答者特殊人群的一種新的增強免疫的預防製品。
本發明的技術方案是採用基因工程酵母菌表達的B肝表面抗原(HBsAg)，或哺乳類動物細胞表達的重組HBsAg，或滅活血源HBsAg，經純化、與含B肝表面抗原的抗體(抗-HBs)的血清或免疫球蛋白組成複合物，用於對B肝疫苗無應答或低應答者，以促使他們產生有效抗-HBs。其特點為HBsAg與抗-HBs在分別作不同稀釋度的方陣滴定測定法下，根據HBsAg的特性和抗體親和力的不同，確定HBsAg與抗-HBs用量的最適比例。選擇最適比例量的HBsAg與抗-HBs，混合後，在37℃孵育2-4小時後，12,000轉/分，離心30-40分鐘，檢測上清中殘留的HBsAg和抗-HBs量，均應為很低，表示HBsAg和抗-HBs已充分結合。吸去上清液，在沉澱物中再加入原來所用量的HBsAg，以保證複合物含有過量抗原，並加入氫氧化鋁劑及防腐劑。
本發明所述的B肝表面抗原-抗體複合物由B型肝炎病毒包膜抗原與抗B型肝炎病毒包膜抗原的抗體組成。其中所述的B型肝炎病毒包膜抗原為B型肝炎表面抗原，可選自血源、基因工程表達的B型肝炎病毒表面抗原或合成的B型肝炎表面抗原；所述的抗體為B型肝炎表面抗原的抗體，來自人、動物或重組表達的抗B型肝炎病毒表面抗原的抗體；所述的對B肝疫苗無應答或低應答是指正常成人，兒童或嬰兒對常規B肝疫苗注射3針後未能產生＞10mIU/ml的B型肝炎表面抗體；或是患有其他疾病或因治療其他疾病或因年齡、工作環境等因素造成的免疫低下對B肝疫苗無應答或低應答；或是因組織相容性抗原特殊型別而對常規B肝疫苗注射3針後未能產生＞10mIU/ml的B型肝炎表面抗體對B肝疫苗無應答或低應答。
本發明的特點為(1)用這一製品可在對HBsAg無應答的小鼠品系中，如B10.S，或SJL/j，誘生高效價的抗-HBs，證實在因組織相容性抗原型別(HLA)特殊而對B肝疫苗無應答或低應答者中，HBsAg-抗-HBs複合物能誘生合格的抗-HBs。(2)在用環孢菌素A(cyclosporin A)造成免疫低下的小鼠中，用HBsAg-抗-HBs免疫，可以產生比用單純HBsAg免疫更高效價的抗-HBs。環孢菌素A的主要作用是使使機體的細胞因子如IL-2，IFN-gamma水平下降，T細胞增值降低，並繼發地影響B細胞功能。而本發明HBsAg-抗-HBs複合物可以比單純HBsAg誘生更高的抗-HBs，表明本製品可用於製備因免疫功能低下對B肝疫苗無應答或低應答的預防製品。
具體實施例方式
實施例1對兩種不同品系的小鼠B10，B10s(組織相容型均為H2f，(Jackson co.)前者對HBsAg為應答品系，後者為不應答品系)分別用HBsAg及HBsAg-抗-HBs免疫，結果單純HBsAg不能在B10s中誘生與B10品系相當水平的抗-HBs，但HBsAg-抗-HBs可在B10s中誘生與B10品系相當水平的抗-HBs。
根據已進行過的方陣滴定與對殘留的HBsAg，抗-HBs測定結果，取血源純化的HBsAg 27.5μg(分2次加入)，加入1∶30稀釋，效價ELISA為1∶3200鼠抗-HBs 47μl，製成HBsAg-抗-HBs，另取同批HBsAg 27.5μg，加入磷酸緩衝液47μl，為HBsAg注射液對照。分別各取10隻B10，10隻B10s小鼠，不加佐劑，每隻鼠肌肉注射1μg HBsAg或含1μg HBsAg的HBsAg-抗-HBs複合物，共免疫2次，間隔4周。分別在第1、2次免疫後2周採血清，用ELISA測定血清抗-HBs效價。結果見表1。
表1 B10(正常應答鼠)及B10s(低應答鼠)對HBsAg-抗-HBs複合物及HBsAg免疫後產生抗-HBs的效價(不加氫氧化鋁)

由上述表可見經一次單純HBsAg免疫後，無論B10或B10s鼠系血清均未能測及抗體，但用HBsAg-抗-HBs免疫後B10鼠系產生了112±4.24mIU/ml的抗-HBs，但B10s鼠系僅產生了10±4.32mIU/ml的低水平抗體。但經再次免疫後，B10s鼠血清可達到類似B10鼠的抗-HBs效價，分別為52,468±423mIU/ml及52468±423mIU/ml的抗-HBs。單純用HBsAg免疫的B10s鼠系的抗-HBs效價(98±9.19mIU/ml)比B10鼠系的抗-HBs效價低約50倍(98±9.19mIU/ml)。結果說明HBsAg-抗-HBs可提高對B肝疫苗(HBsAg)無應答或低應答鼠產生抗-HBs的能力，可用於因HLA類型特殊而對B肝疫苗(HBsAg)無應答或低應答作為預防製品。
實施例2用對B肝疫苗(HBsAg)有應答的Balb/c鼠，先用環孢菌素A(cyclosporinAclin Exp Immunol 1989，78263-70；World J Gastroenterol 1999，5209-212；)，然後分別用酵母基因工程表達的單純HBsAg或酵母基因工程表達的HBsAg-與鼠抗-HBs免疫，採取血清後用ELISA法測定抗-HBs效價。結果HBsAg-抗-HBs免疫鼠的抗-HBs效價明顯高於單純用HBsAg免疫鼠的抗-HBs效價，說明HBsAg-抗-HBs複合物可用於因免疫低下而對B肝疫苗(HBsAg)無應答或低應答的機體作為預防製品。
取16-20克重的Balb/c鼠24隻，20隻每隻腹腔注射環孢菌素A(cyclosporinA)0.5mg(用生理鹽水稀釋，以後每隻隔日注射0.1-2環孢菌素。另外4隻僅注射生理鹽水為對照。待用流式細胞儀及/或細胞因子檢測證實T細胞數或功能降低後，分別用2微克HBsAg，或含2微克HBsAg的HBsAg-抗-HBs做1-3次腹腔注射。分別採取血清測定抗-HBs效價。結果單用HBsAg免疫的小鼠抗-HBs效價僅為1∶40以下，而經HBsAg-抗-HBs免疫鼠的效價可高達1∶160以上。結果說明HBsAg-抗-HBs複合物比HBsAg能更有效地在因免疫抑制而出現對B肝疫苗(HBsAg)無應答或低應答的機體中誘生出高效價的抗-HBs。因此HBsAg-抗-HBs複合物可用於因免疫低下而對B肝疫苗(HBsAg)無應答或低應答的機體作為預防製品。
權利要求
1.B肝表面抗原-抗體複合物在製備對B肝疫苗無應答或低應答預防製品中的用途。
2.權利要求1所述的用途，其中所述的B肝表面抗原-抗體複合物由B型肝炎病毒包膜抗原與抗B型肝炎病毒包膜抗原的抗體組成。
3.權利要求1所述的用途，其中所述的B型肝炎病毒包膜抗原為B型肝炎表面抗原。
4.權利要求1所述的用途，其中所述的B型肝炎病毒表面抗原為來自血源、基因工程表達的B型肝炎病毒表面抗原或合成的B型肝炎表面抗原。
5.權利要求1所述的用途，其中所述的抗體為B型肝炎表面抗原的抗體。
6.權利要求1所述的用途，其中所述的抗體為來自人、動物或重組表達的抗B型肝炎病毒表面抗原的抗體。
7.權利要求1所述的用途，其中所述的對B肝疫苗無應答或低應答是指正常成人，兒童或嬰兒對常規B肝疫苗注射3針後未能產生＞10mIU/ml的B型肝炎表面抗體。
8.權利要求1所述的用途，其中所述的對B肝疫苗無應答或低應答是患有其他疾病或因治療其他疾病或因年齡、工作環境等因素造成的免疫低下。
9.權利要求1所述的用途，其中所述的對B肝疫苗無應答或低應答是因組織相容性抗原特殊型別而對常規B肝疫苗注射3針後未能產生＞10mIU/ml的B型肝炎表面抗體。
全文摘要
本發明涉及B肝表面抗原－抗體複合物的新用途，具體涉及B肝表面抗原－抗體複合物在製備對B肝疫苗無應答或低應答預防製品中的用途。本發明採用基因工程酵母菌表達的B肝表面抗原，或哺乳類動物細胞表達的重組HBsAg，或滅活血源HBsAg，經純化、與含B肝表面抗原的抗體的血清或免疫球蛋白組成複合物，用於對B肝疫苗無應答或低應答者，動物實驗結果表明可提高對B肝疫苗)無應答或低應答鼠產生抗－HBs的能力，能更有效地在因免疫抑制而出現對B肝疫苗無應答或低應答的機體中誘，生出高效價的抗－HBs。本發明可用於對B肝疫苗無應答或低應答的機體作為預防製品。
文檔編號A61P1/16GK1919341SQ20061008228
公開日2007年2月28日 申請日期2006年5月18日 優先權日2005年8月24日
發明者聞玉梅, 袁正宏, 姚忻 申請人:復旦大學, 上海復旦悅達生物技術有限公司