一種製備組培用無菌玫瑰枝條的方法
2023-06-13 15:48:11
專利名稱：一種製備組培用無菌玫瑰枝條的方法
技術領域：
本發明涉及玫瑰組織培養技術，特別涉及組培用無菌玫瑰枝條的製備方法。
背景技術：
玫瑰(Rosa rugosa)為薔薇科、薔薇屬植物，其花形美色鮮、芳香濃鬱，具有食用、 藥用、保健、美容、觀賞等多種用途，是我國十大名花之一，也是世界四大切花之一。玫瑰還是水土保持和城市園林建設的優勢樹種。當前，玫瑰繁育仍以扦插或嫁接等傳統方式為主， 長期存在繁殖係數低、新品種選育難、病菌感染嚴重、產量和品質難以提高等一系列急需解決的問題。利用組織培養技術可以實現玫瑰優良品種的快速繁育、結合誘發突變等其它技術選育新品種、脫除現有品種中的內生病菌等，進而從種質資源創新這一農業與生物產業的基點出發，極大推進當前玫瑰產業的發展[科技情報開發與經濟，2008，18(28) :1 125 ；北方園藝，2009，6 48 50]。製得無菌外植體既是開展植物組織培養的基礎，更是決定植物組織培養能否成功的關鍵。國內外已有研究表明，玫瑰枝條是用於組培快繁的較理想外植體。但因玫瑰體內往往存有種類與數量均較多的真菌和細菌，且難以利用一般的脫毒方法完全去除、獲得組培所需用的無菌外植體，而使組培無法繼續並最終導致失敗。這是目前玫瑰組培快繁中存在的最大難題[科技情報開發與經濟，2008，18(28) :1 125 ；中國園藝文摘，2009，12 31 32 ；北方園藝，2009，6 48 50]。為此，迫切需要建立一套行之有效、高效、經濟的組培用無菌玫瑰枝條製備技術。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種製備組培用無菌玫瑰枝條的方法。本發明提供了一種製備組培用無菌玫瑰枝條的技術方法，包括以下步驟(1)取長有飽滿腋芽的健壯玫瑰枝條，修去刺、葉柄和葉片後清洗乾淨；(2)將玫瑰枝條在25% (ν/ν)的PTC水溶液中浸泡5min，然後用蒸餾水衝洗；(3)在IOOOml具蓋組培瓶底部墊入10層濾紙、加入IOml蒸餾水淋溼後蓋好瓶蓋， 放入高壓蒸汽滅菌鍋中於121°C滅菌20min，待瓶子冷卻後將玫瑰枝條正向豎直裝入其中並蓋好瓶蓋；(4)將裝有玫瑰枝條的組培瓶置於37°C恆溫箱中放置Mh，然後轉至4°C冰箱中放置48h，重複該步驟1次；(5)在無菌條件下將玫瑰枝條切成2cm的帶腋芽的小段，用70%酒精浸泡並搖動殺菌Imin後取出，用無菌水衝洗5次，再以0. 2%升汞(氯化汞)浸泡9min後取出，用無菌水衝洗10次，即獲得組培用無菌玫瑰枝條；所述PTC水溶液的配製方法為將15g十二烷基磺酸鈉(SDS)、2.5g多菌靈(又名棉萎靈、苯井咪唑44號，一種廣譜性殺菌劑)、6ml吐溫-20 (聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯)和細1 1Triton-XlOO (聚乙二醇辛基苯基醚)依次溶於水，並以水定容至100ml。本發明步驟(1)中，清洗玫瑰枝條時先用流水衝洗lh，再用試管刷蘸PTC水溶液洗刷乾淨，然後用蒸餾水衝洗2次。本發明步驟(1)中，修理玫瑰枝條時，將其切成約IOcm長的小段。本發明的有益效果在於本發明所建立的組培用無菌玫瑰枝條製備方法，其主要特點在於提供了 PTC水溶液及採用37°C和4°C這兩種溫度交替處理，與現有常規方法相比，具有無菌化效果好、發芽率高、操作簡便、省時省力、成本低、生產應用性強等優點。
具體實施例方式本發明的技術方案可以通過以下步驟實現。選用樣本材料為公知的紫枝玫瑰(Rosa rugosa Purple Branch)和大馬士革玫瑰(Rosa damascena Mill)，這兩個玫瑰品種在我國各地都有廣泛栽培，在發明人所在的浙江九九紅玫瑰科技有限公司也有大量栽培，可隨時提供樣本。試劑和儀器本發明中所用的SDS (十二烷基磺酸鈉)、吐溫-20和Triton-XlOO均為美國安發碼西亞公司產品，其它試劑均為國產分析純。無菌操作臺由江蘇蘇淨集團有限公司生產，型號為SW-CJ-1BU。實施例1 本發明製備組培用無菌玫瑰枝條的方法的主要步驟如下(1)將15g SDS,2. 5g多菌靈、6ml吐溫-20,4ml Triton-XlOO依次溶於水並定容至IOOml配成PTC水溶液；25%的PTC水溶液由25ml的PTC水溶液和75ml的水配製成，保
存於4°C冰箱待用。(2)取長有飽滿腋芽的健壯玫瑰枝條，修去刺及葉柄和葉片並切成約IOcm長的小段。(3)流水衝洗Ih後，用試管刷蘸PTC水溶液洗刷乾淨並用蒸餾水衝洗2次，再在 25%的PTC水溶液中浸泡5min並用蒸餾水衝洗5次。(4)在IOOOml具蓋組培瓶底部墊入10層濾紙、加入IOml蒸餾水淋溼後蓋好瓶蓋， 放入高壓蒸汽滅菌鍋中於121°C滅菌20min，爾後取出並自然冷卻；(5)將枝條豎直裝入步驟(4)準備好的組培瓶中並蓋好瓶蓋，於37°C恆溫箱中放置Mh，再轉至4°C冰箱中放置48h ；再轉入37°C恆溫箱中放置Mh，再轉至4°C冰箱中放置 48h。(5)在無菌操作臺內用手術刀將枝條切成約2cm帶腋芽的小段，用70%酒精浸泡搖動殺菌Imin後取出，用無菌水衝洗5次。(6)用0. 2%升汞浸泡9min後取出，用無菌水衝洗10次。(7)用無菌濾紙吸乾，接種於 MS+6-BA (0. 5mg/L) +NAA (0. 2mg/L) +Vc (0. 2g/L)， PH5. 5的無菌培養基中，每瓶接1小段。(8)觀察並統計外植體的生長和汙染等情況。作為實例，我們分別選取浙江九九紅玫瑰科技有限公司浙江衢州基地及山東平陰玫瑰研究所平陰基地的紫枝玫瑰(Rosa rugosa Purple Branch)和大馬士革玫瑰(Rosadamascena Mill)為試驗材料，利用本發明的方法對兩地、兩品種四個玫瑰樣本各製備了 200個枝條小段，結果顯示，無菌率和發芽率均達到100%。
權利要求
1.一種製備組培用無菌玫瑰枝條的方法，包括步驟(1)取長有飽滿腋芽的健壯玫瑰枝條，修去刺、葉柄和葉片後清洗乾淨；(2)將玫瑰枝條在25%(ν/ν)的PTC水溶液中浸泡5min，然後用蒸餾水衝洗；(3)在IOOOml具蓋組培瓶底部墊入10層濾紙、加入IOml蒸餾水淋溼後蓋好瓶蓋，放入高壓蒸汽滅菌鍋中於121°C滅菌20min，待瓶子冷卻後將玫瑰枝條正向豎直裝入其中並蓋好瓶蓋；(4)將裝有玫瑰枝條的組培瓶置於37°C恆溫箱中放置Mh，然後轉至4°C冰箱中放置 48h，重複該步驟1次；(5)在無菌條件下將玫瑰枝條切成2cm的帶芽的小段，用70%酒精浸泡並搖動殺菌 Imin後取出，用無菌水衝洗5次，再以0. 2%升汞浸泡9min後取出，用無菌水衝洗10次，即獲得組培用無菌玫瑰枝條；所述PTC水溶液的配製方法為將15g十二烷基磺酸鈉、2. 5g多菌靈、6ml吐溫-20和 4ml iTriton-XlOO依次溶於水，並以水定容至100ml。
2.根據權利要求1所述的製備組培用無菌玫瑰枝條的方法，其特徵在於，所述步驟(1) 中，清洗玫瑰枝條時先用流水衝洗lh，再用試管刷蘸PTC水溶液洗刷乾淨，然後用蒸餾水衝洗2次。
全文摘要
本發明涉及玫瑰組織培養技術，旨在提供一種組培用無菌玫瑰枝條的製備方法。該方法，包括將玫瑰枝條修剪清洗後浸泡在25％(v/v)的PTC水溶液，然後用蒸餾水衝洗；將玫瑰枝條正向豎直裝入經高壓蒸汽滅菌的組培瓶中並蓋好瓶蓋，然後置於37℃恆溫箱中放置24h，然後轉至4℃冰箱中放置48h，重複該步驟1次；在無菌條件下將玫瑰枝條切成帶腋芽的小段，用70％酒精浸泡並搖動殺菌後取出，用無菌水衝洗，再以升汞浸泡9min後取出用無菌水衝洗，即獲得組培用無菌玫瑰枝條。本發明提供了PTC水溶液及採用37℃和4℃這兩種溫度交替處理，與現有常規方法相比，具有無菌化效果好、發芽率高、操作簡便、省時省力、成本低、生產應用性強等優點。
文檔編號A01H4/00GK102283119SQ20111018905
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月6日 優先權日2011年7月6日
發明者餘霞曉, 傅小豐, 劉新穎, 孫霖潤, 朱曉波, 汪志平, 王葉明, 藍瑾瑾, 高長平 申請人:浙江九九紅玫瑰科技有限公司