轉基因水稻pa110-15外源插入片段旁側序列及應用的製作方法
2023-06-13 16:54:21
轉基因水稻pa110-15外源插入片段旁側序列及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了轉基因水稻PA110-15外源插入片段旁側序列及應用。本發明首先提供了轉基因水稻PA110-15品系外源插入基因的5』端序列以及3』側翼序列，其核苷酸序列分別為SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。本發明以所述側翼序列為靶基因提供了轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性的PCR檢測引物以及品系特異性定性檢測方法。特異性實驗表明，本發明建立的轉基因水稻PA110-15品系特異性定性PCR檢測方法具有高度的特異性。靈敏度測試結果表明，本發明建立的檢測方法靈敏度達到0.1%。
【專利說明】轉基因水稻PA110-15外源插入片段旁側序列及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及轉基因水稻品系的外源插入片段旁側序列，尤其涉及轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15外源片段和側翼水稻序列的連接區序列，本發明進一步涉及轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性PCR檢測引物、定性檢測方法及檢測試劑盒，屬於轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性檢測領域。
【背景技術】
[0002]隨著轉基因植物的廣泛種植，轉基因食品的安全性問題也引起人們極大的關注，已有50多個國家和地區相繼實施轉基因產品標識制度，其中也包括中國。轉基因標識制度的實施依賴於對轉基因植物及其加工產品的成分檢測。PCR技術是目前國內外檢測轉基因產品中應用最廣泛的方法。在應用這種技術進行轉基因作物定性檢測時，根據其特異性，將其分為篩選檢測法、基因特異性方法、構建特異性方法和品系特異性方法。品系特異性檢測是通過檢測插入載體與植物基因組的連接區序列實現的，由於每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區序列，和前三種方法比較，品系特異性具有更高的特異性和準確性，最適合做轉基因產品檢測。
[0003]目前，已有部分專利和文獻報導了轉基因植物的品系特異性檢測方法。例如:張大兵等人於2006年建立了轉基因M0N863玉米的品系特異性檢測方法；謝家建等人建立了轉基因水稻克螟稻、Bt汕優63、科豐6號和科豐8號等一系列品系特異性檢測方法；盧長明等人於2007年建立了一系列轉基因油菜的品系特異性檢測方法。
[0004]PA110-15是以兩系溫敏不育系培矮64S (PA64S)為受體，通過農桿菌介導獲得的轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻。迄今為止，缺乏一種特異性強、靈敏度高的轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PAl 10-15品系特異性PCR檢測方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一是提供轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15外源片段和側翼水稻序列的連接區序列；
[0006]本發明的目的之二是提供轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性的PCR檢測引物；
[0007]本發明的目的之三是建立轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性PCR定性檢測方法；
[0008]本發明的目的之四是提供轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性PCR定性檢測試劑盒。
[0009]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0010]本發明根據轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系中插入的目的基因為LRP基因(SEQ ID N0.19)通過H1-TAIL PCR獲得外源插入基因和5』端水稻側翼序列的連接區序列(SEQ ID N0.1)，該連接區序列的長度為1451bp，其中，第1-1144位為水稻基因組序列(位於水稻第4染色體的1063000 - 1064144位，GenBank登記號:NC_008397)，第1146-1336位為質粒pSBLRP584骨架序列，第1337-1451位為水稻穀蛋白基因Gtl的啟動子序列。
[0011]本發明進一步獲得了外源插入基因和3』端水稻側翼序列的連接區序列(SEQ IDN0.2)，該連接區序列的長度為783bp，其中，第1-262位為NOS終止子序列，為263-569位為質粒pSBLRP584骨架序列，第570-783位為水稻基因組序列(位於水稻第4染色體的第1064179-1064392 位，GenBank 登記號:NC_008397)。
[0012]本發明根據SEQ ID N0.1所示的5』端旁側序列為靶基因設計了 4對檢測引物，4 對引物分別為:引物對 1:PA110-5_F1/R1 (SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4);引物對 2:PA110-5-F2/R2CSEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6);引物對 3:PA110-5_F3/R3(SEQ ID N0.7 和SEQ ID N0.8);引物對 4:PA110-5-F4/R4(SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10);本發明分別以上述4對引物建立PCR擴增體系對PAl 10-15進行擴增檢測，擴增結果發現引物PA110-5-F1/Rl (SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)和 PA110-5-F2/R2 (SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6)特異性好、擴增條帶清晰；本發明進一步通過體系優化，設計引物終濃度和退火溫度的正交實驗，最終發現引物組合PA110-5-F1/R1作為5』端轉化體特異性檢測引物特異性最好，擴增效率最聞，引物二聚體也最少。
[0013]本發明進一步以SEQ ID N0.2所示的3』端旁側序列為靶基因設計了 4對檢測引物，4對引物分別為:引物對5:PA110-3_F1/R1 (SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12);引物對
6:PA110-3-F2/R2 (SEQ ID N0.13 和 SEQ ID N0.14);引物對 7:PA110-3_F3/R3 (SEQ IDN0.15 和 SEQ ID N0.16);引物對 8:PA110-3_F4/R4 (SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.18);本發明分別以上述四對引物建立PCR擴增體系對PA110-15進行擴增檢測，擴增結果發現引物PA110-3-F1/R1和PA110-3-F3/R3特異性好、擴增條帶清晰；本發明進一步通過體系優化，設計引物終濃度和退火溫度的正交實驗，最終發現引物組合PA110-3-F3/R3作為3』端轉化體特異性檢測引物具有最佳的檢測效果。
[0014]本發明的目的之二是提供一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性PCR檢測方法，該方法包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ; (2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.1所示的5』端旁側序列為靶基因設計特異性引物對，建立PCR擴增體系並進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果從待檢測的樣品中未能擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系。
[0015]其中，所述的特異性引物對選自以下4對引物中的任意一對:核苷酸序列為SEQID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物對I ;核苷酸序列為SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物對2 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示引物對3 ;核苷酸序列為SEQID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物對4。
[0016]優選的，一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PAl 10-15品系特異性的PCR定性檢測方法，包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ；(2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物對建立PCR反應體系並進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出262bp的目的條帶，則待檢測的水稻樣品是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果從待檢測的樣品中未能擴增出262bp的目的條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系。
[0017]本發明還提供另一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性PCR檢測方法，該方法包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ; (2)以提取的DNA為模板，以SEQ IDN0.2所示的3』端旁側序列為靶基因設計特異性引物對，建立PCR擴增體系並進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果從待檢測的樣品中未能擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系。
[0018]其中，所述的特異性引物對選自以下4對引物中的任意一對:核苷酸序列為SEQID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物對5 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物對6 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示引物對7 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物對8。
[0019]優選的，一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性PCR檢測方法，該方法包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ；(2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物對建立PCR擴增體系並進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出376bp的條帶，則待檢測的水稻樣品是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果從待檢測的樣品中未能擴增出376bp的條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PAl 10-15品系。
[0020]其中，所述的 從待檢測水稻樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA的各種常用方法，例如可以是CTAB法、異硫氰酸胍法或鹽酸胍法等各種方法。
[0021]PCR反應體系中引物的終濃度以及退火溫度對於檢測結果的特異性和靈敏度均有一定的影響；本發明考察了 PCR反應體系中引物的終濃度以及退火溫度對於檢測的特異性和靈敏度的影響，實驗結果發現在引物終濃度為0.2 μ M、退火溫度為58°C時，檢測結果的特異性最強，靈敏度最高。
[0022]本發明中所述的PCR擴增體系可參考以下方法建立:反應體系的總體積為25.0 μ L，其中，10XPCR 緩衝液 2.5 μ L, 25mmol/L 氯化鎂溶液 1.5 μ L，IOmmoI/L dNTPs 混合溶液(各 2.5mmol/L)2 μ L，10 μ mol/L 上遊引物 0.5 μ L, 10 μ mol/L 下遊引物 0.5 μ L, 5U/μ L Taq 酶 0.125yL，25mg/L DNA 模板 2.0 μ L，餘量為雙蒸水。
[0023]所述的PCR擴增條件優選為:95°C變性5min ;95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共進行35次循環；72°C延伸7min。
[0024]本發明進一步的目的是提供一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性的PCR定性檢測試劑盒，包括:10 XPCR緩衝液，氯化鎂溶液，dNTPs混合溶液，PCR定性檢測引物對，Taq酶和雙蒸水；其中，所述PCR定性檢測引物對優選自以下8對引物中的任意一對:核苷酸序列為SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物對I ;核苷酸序列為SEQID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物對2 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示引物對3 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物對4 ;核苷酸序列為SEQID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物對5 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物對6 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物對7 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物對8。
[0025]採用本發明建立的品系特異性PCR定性檢測方法對轉基因水稻科豐6號、科豐8號、克螟稻、M12、TT51-1以及其它的轉基因植物和非轉基因植物材料進行了定性檢測，定性PCR擴增結果表明，僅在轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15陽性材料基因組中擴增得到了預期大小的目的片段條帶，在其它轉基因水稻和其它轉基因植物以及常規水稻PA64S等基因組中沒有擴增得到預期目的片段；
[0026]本發明分別用5 』特異性檢測引物(PAl 10-5-F1/R1)和3，特異性檢測引物(PA110-3-F3/R3)對轉基因水稻PA110-15、其他轉基因水稻材料(M12、TT51-1、科豐6號、科豐8號和克螟稻)以及非轉基因水稻PA64S進行PCR擴增，結果顯示，這2對引物能特異性區分轉基因水稻PA110-15，而在其他轉基因水稻和非轉基因水稻中沒有任何擴增，實驗結果表明，本發明所建立的轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性定性PCR檢測方法特異性強。
[0027]靈敏度測試結果表明，本發明的5』端檢測引物PA110-5-F1/R1或3』端檢測引物PA110-3-F3/R3都能從0.05%含量的PA110-15轉基因樣品中得到有效擴增，本發明檢測靈敏度可以穩定達到0.1%。
【專利附圖】
【附圖說明】[0028]圖1H1-TAIL PCR 擴增結果。
[0029]圖25』端轉化體特異性檢測引物篩選結果；M:100bp Marker; 1-3:PA110-15;4:受體材料-CK; 5:空白對照。
[0030]圖3 引物體系優化；M:100bp Marker; 1-6:PA110_15; 7:受體材料 _CK;8:空白對照。
[0031]圖43』端轉化體特異性檢測引物篩選;M:100bp Marker; 1-3:PA110-15;4:受體材料-CK; 5:空白對照。
[0032]圖5 引物體系優化；M:100bp Marker; 1-6:PA110_15; 7:受體材料 _CK;8:空白對照。
[0033]圖6轉化體5 』端檢測方法特異性測試；M: IOObp Marker; 1-3:PA110-15; 4:M12;5:TT51-1;6:科豐6號；7:科豐8號；8:克螟稻；9:轉基因玉米混合樣；10:轉基因油菜混合樣；11:轉基因大豆混合樣；12:轉基因棉花混合樣；13，14:非轉基因水稻PA64S;15:空白對照。
[0034]圖7轉化體3 』端檢測方法特異性測試；M: IOObp Marker; 1-3:PA110-15; 4:M12;5:TT51-1;6:科豐6號；7:科豐8號；8:克螟稻；9:轉基因玉米混合樣；10:轉基因油菜混合樣；11:轉基因大豆混合樣；12:轉基因棉花混合樣；13，14:非轉基因水稻PA64S;15:空白對照
[0035]圖8PA110-5-F1/R1 檢測靈敏度；M:100bp Marker; 1，2:PA110-15 質量分數為10%; 3, 4:PA110-15 質量分數為 1%;5，6:PA110-15 質量分數為 0.5%; 7, 8:PA110-15 質量分數為 0.1%;9，10:PA110-15 質量分數為 0.05%; 11, 12:PA110_15 質量分數為 0.01%; 13, 14:受體材料-CK; 15，16:空白對照。
[0036]圖9PA110-3-F3/R3 檢測靈敏度；M:100bp Marker; 1，2:PA110-15 質量分數為10%; 3, 4:PA110-15 質量分數為 1%;5，6:PA110-15 質量分數為 0.5%; 7, 8:PA110-15 質量分數為 0.1%;9，10:PA110-15 質量分數為 0.05%; 11, 12:PA110_15 質量分數為 0.01%; 13, 14:受體材料-CK; 15，16:空白對照。
[0037]實施例1轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15外源插入基因的側翼序列的獲取
[0038]轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15外源插入目的基因為LRP基因，其鹼基序列為SEQ ID N0.19所示。
[0039]通過H1-TAIL PCR獲得外源插入基因和5』端水稻側翼序列的連接區序列(SEQ IDN0.1)以及外源插入基因和3』端水稻側翼序列的連接區序列(SEQ ID N0.2)。
[0040]TAIL-PCR技術的基本原理是利用目標序列旁的已知序列設計3個嵌套的特異性引物(special prime,簡稱spl, sp2, sp3,約20bp),用它們分別和I個具有低T值的短的(14bp)隨機簡併引物(Arbitrary degenerate primes,簡稱AD)相組合，以基因組DNA作為模板，根據引物的長短和特異性的差異設計不對稱的溫度循環，通過分級反應來擴增特異引物；TAIL-PCR分為3次反應。第1次PCR反應由5次高特異性反應、I次低特異性反應、10次較低特異性反應和12次熱不對稱的超級循環構成。通過5次高特異性的反應，使spl與載體上LRP的序列退火併延伸，提高目標序列的濃度。I次低特異性的反應使簡併引物結合到較多的目標序列上，10次較低特異性的反應使兩種引物均能與模板退火，隨後進行12次TAIL循環。經過上述反應得到了不同濃度的3種類型的產物:特異性產物(I型)和非特異性產物(II型和III型)。第2次反應則將第一級反應的產物稀釋40倍作為模板，通過10次熱不對稱的超級循環，使特異性的產物被選擇性地擴增，而非特異性的產物被壓制到極低的含量。第3次反應又將第2次反應的產物稀釋40倍作為模板，設置為普通的熱不對稱PCR超級循環。通過上述3次PCR反應可獲得與已知序列鄰近的目標序列。挑取比較理想的條帶直接用PCR產物測序，最後由SP3和ADl獲得了 LRP基因啟動子一邊的旁側序列，對獲得的目標序列 進行DNA測序，並將測序結果在NCBI上進行Blast比對，則可得知LRP基因插入的具體位置。
[0041]終止子一邊旁側序列的驗證:一條引物設在NOS (終止子)序列上，一條設在已測出的左側旁側序列上，預期長度為777bp，引物為6F/6R。引物都擴增到了預期長度的產物(圖1)，將這片段的PCR產物進行測序，測序結果證明本發明獲得的旁側序列是正確的。具體PCR引物序列見表1。
[0042]表1PCR引物序列
[0043]
【權利要求】
1.轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系外源插入基因和5』端水稻側翼序列的連接區序列，其特徵在於:其為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系外源插入基因和3』端水稻側翼序列的連接區序列，其特徵在於:其為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
3.權利要求1所述的連接區核苷酸作為檢測轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系靶基因中的應用。
4.權利要求2所述的連接區核苷酸作為檢測轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系靶基因中的應用。
5.轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性的PCR檢測引物，其特徵在於，選自以下8對引物中的任意一對:核苷酸序列為SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物對I;核苷酸序列為SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物對2 ;核苷酸序列為SEQ IDN0.7和SEQ ID N0.8所示引物對3 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物對4 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物對5 ;核苷酸序列為SEQID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物對6 ;核苷酸序列為SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物對? ;核苷酸序列為SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物對8。
6.一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性的PCR定性檢測方法，其特徵在於，包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ；(2)以提取的DNA為模板，以權利要求5所述PCR檢測引物對建立PCR反應體系並進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出預期的目的條帶，則待檢測的水稻樣品是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系；相同條件下，如 果從待檢測的樣品中未能擴增出預期的目的條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系。
7.一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性的PCR定性檢測方法，包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ；(2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示的引物對建立PCR反應體系並進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出262bp的目的條帶，則待檢測的水稻樣品是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系；相同條件下，如果從待檢測的樣品中未能擴增出262bp的目的條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系。
8.一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系特異性PCR檢測方法，該方法包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ；(2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.15和SEQ IDN0.16所示的引物對建立PCR擴增體系並進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出376bp的條帶，則待檢測的水稻樣品是轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15品系或其衍生系；相同條件下，如果從待檢測的樣品中未能擴增出376bp的條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉聞賴氣酸儲減蛋白基因水稻PAl 10_15品系或其衍生系。
9.按照權利要求6-8任何一項所述的PCR定性檢測方法，其特徵在於，所述的PCR反應體系為:反應體系的總體積為25.0 μ L，其中，10XPCR緩衝液2.5 μ L, 25mmol/L氯化鎂溶液 1.5 μ L，IOmmoI/L dNTPs 混合溶液(各 2.5mmol/L)2 μ L，10 μ mol/L 上遊引物 0.5 μ L,1(^11101/1下遊引物0.5 4 1^，5~4 1^ Taq 酶 0.125μ L,25mg/L DNA 模板 2.0 μ L，餘量為雙蒸水； 所述的PCR擴增條件為:95°C變性5min ;95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共進行35次循環；72°C延伸7min。
10.一種轉高賴氨酸儲藏蛋白基因水稻PA110-15的品系特異性PCR定性檢測試劑盒，包括=IOXPCR緩衝液，氯化鎂溶液，dNTPs混合溶液，檢測上下遊引物對，Taq酶和雙蒸水；其特徵在於:所述 檢測上下遊引物為權利要求5所述的PCR檢測引物。
【文檔編號】C12N15/11GK103966208SQ201410081893
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】楊劍波, 馬卉, 李莉, 凃巨民, 沈平, 汪秀峰, 宋貴文, 倪大虎, 魏鵬程, 段武德, 陸徐忠, 宋豐順, 李 浩, 王淑雲 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所