一種半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法
2023-06-13 00:59:36 1
一種半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法
【專利摘要】本發明提供了一種適用於順序操作液滴陣列系統的一種半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，該方法通過精確控制毛細管點樣針的尖端與微孔下表面（或已生成液滴）的距離，利用液滴與表面（或已生成液滴）的親和或界面張力作用，實現快速可靠的液滴連續點樣或連續液體加入，並有效地避免了點樣過程中的交叉汙染問題。該方法適用於高通量藥物篩選、蛋白質結晶條件篩選、酶動力學研究、藥物毒性測定等生化分析篩選研究中。
【專利說明】一種半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的領域為液滴分析領域，特別涉及一種半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法。
【背景技術】
[0002]基於液滴的微流控技術(Droplet-based microfluidics)取得了快速的發展和廣泛的應用。液滴微流控技術的主要優點包括:1)液滴反應器體積可在飛升級至納升級靈活調節，因而樣品和試劑消耗量可降至極低的水平；2)可在短時間內生成大量的液滴反應器，從而顯著地提高分析篩選通量；3)在液滴內可實現組分的快速傳質、傳熱與混合，有效提高了生化反應效率；4)油相的包裹，有效降低了微量生化反應的蒸發、擴散以及交叉汙染問題；5)油相中生物兼容性表面活性劑分子的自組裝效應，可以給液滴中的生化反應提供一個溫和均一的微環境，有利於提高分析篩選的準確性。
[0003]目前，大部分的液滴分析系統採用T型接口或者十字聚焦接口方法生成液滴。然而，這類方法生成的液滴一般具有相同的化學組成和濃度，因此限制了其在大規模不同樣品分析篩選中的應用。近年來，為了在液滴系統中實現大量不同化學組成液滴的生成，浙江大學方群等人發展了一種高密度液滴陣列篩選方法(方群，杜文斌，孫蒙，基於液滴順序組裝技術的微流控液滴生成系統及使用方法，中國發明專利申請，申請號:201010250945.0 ；方群，祝瑩，張雲霞，一種具有皮升級精度的自動化微液滴陣列篩選系統的使用方法，中國發明專利申請，申請號:201210589055.1)。該方法的主要原理是，首先利用三維機械系統完成自動化的樣品管和試劑管的快速切換，將微量的試樣抽取至毛細管取樣探針中形成液滴。然後將毛細管探針移動至微流控晶片的微孔上方，將液滴逐個點樣至晶片微孔中進行長時間靜態反應和下一步檢測。該方法借鑑了微陣列生物晶片液體點樣技術的優點，即可在數平方釐米的晶片上實現大批量不同樣品的分析篩選，試樣試劑消耗也顯著降低。並且，與微陣列生物晶片篩選方法相比，其優點在於，在液滴點樣和孵育反應的過程中，由於不互溶的油相包裹和保護作用，液滴中的生化反應是在溫和的均相環境中進行，更接近於其在自然界的狀態。因此，其篩選結果更為準確可靠。
[0004]在我們的深入研究中發現，由於整個液滴點樣過程是在油相中進行，常規的微量點樣技術，如接觸式點樣和非接觸式點樣技術(Rose, D.Drug Discov.Todayl999，4，411-419)，均難以實現可靠的油相中液滴點樣。這是由於，採用接觸式點樣技術在油相中生成液滴，容易生成大量體積不可控的小體積液滴。而採用非接觸式點樣技術在油相中生成液滴，存在液滴難以脫離點樣針的問題。此外，為了提高生化篩選過程中含有樣品和試劑的液滴反應器生成通量，浙江大學方群等人發展了一種基於毛細管尖端插入液滴的方法來將樣品或者試劑連續注入晶片上的液滴中(方群，祝瑩，張雲霞，一種具有皮升級精度的自動化微液滴陣列篩選系統的使用方法，中國發明專利申請，申請號:201210589055.1)。然而，由於毛細管尖端頻繁地與不同樣品的液滴接觸，容易引起交叉汙染，導致假陽性的篩選結果。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種適用於順序操作液滴陣列系統的半接觸式油下液滴連續點樣和加液方法。該方法通過精確控制毛細管點樣針的尖端與微孔下表面(或已生成液滴)的距離，利用液滴與表面(或已生成液滴)的親和或界面張力作用，實現快速可靠的液滴連續點樣或連續液體加入，並有效地避免了點樣過程中的交叉汙染問題。該方法適用於高通量藥物篩選、蛋白質結晶條件篩選、酶動力學研究、藥物毒性測定等生化分析篩選研究中。
[0006]本發明的具體技術方案如下:
[0007]—種半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，包括毛細管、帶有微孔的微孔陣列晶片、用於驅動毛細管滴液的液體驅動系統，包括如下步驟:
[0008]步驟1:在毛細管中充滿待點樣的樣品溶液或者試劑溶液，並在微孔陣列晶片上
覆蓋一層油相；
[0009]步驟2:利用毛細管在微孔陣列晶片上形成樣品液滴或者試劑液滴的陣列；
[0010]步驟3:將毛細管中充滿待加入的試劑溶液或者樣品溶液；
[0011]步驟4:控制毛細管尖端基本對準待加入液滴所在的微孔的中心，並與微孔中的樣品液滴或者試劑液滴的上表面保持距離d2 ；
[0012]步驟5:啟動液體驅動系統，將預設體積的試劑溶液或者樣品溶液從毛細管的尖端推出，與微孔中的已有的樣品液滴或試劑液滴接觸融合；
[0013]步驟6:控制毛細管脫離微孔，被推出的試劑液滴或者樣品液滴與微孔中已有的樣品液滴或者試劑液滴完全融合，形成存放於微孔中的液滴反應器；
[0014]重複步驟3至步驟6，在微孔陣列晶片上形成液滴反應器陣列。
[0015]所述步驟2可採用現有的其他方法形成樣品液滴或者試劑液滴的陣列，作為優選，所述步驟2的具體步驟為:
[0016]步驟2-1:控制毛細管(I)的尖端基本對準微孔陣列晶片(2)上的某一微孔(3)的中心，並與該微孔(3)的下表面保持距離dl ；
[0017]步驟2-2:啟動液體驅動系統，將預設體積的樣品溶液(5)或者試劑溶液(7)從毛細管(I)的尖端推出，與微孔(3)的下表面接觸；
[0018]步驟2-3:控制毛細管(I)尖端脫離微孔(3)，形成存放於微孔(3)中的樣品液滴
(6)或者試劑液滴(8)；
[0019]重複步驟2-1至步驟2-3，在微孔陣列晶片(2)上形成樣品液滴(6)或者試劑液滴
(8)的陣列。
[0020]步驟2-1中，dl設定時，需要至少滿足步驟2-2中毛細管推出的樣品溶液或者試劑溶液形成完成的液滴前與微孔內表面接觸，以保證形成的液滴能夠順利的進入到微孔內。為提高液滴與微孔內表面的接觸面積，保證液滴迅速進入到微孔內，提高點樣效率，作為進一步優選:dl設定時，需要滿足，步驟2-2中毛細管推出的樣品溶液或者試劑溶液體積為預設體積的一半時，開始與微孔內表面接觸。
[0021]步驟2-1、步驟2-3、步驟4和步驟6中，可通過移動微孔陣列晶片或者通過移動毛細管對毛細管和微孔的相對位置進行控制；一般情況下優選通過移動承載微孔陣列晶片的移動臺對兩者的相對位置進行自動控制。
[0022]步驟2-2、步驟5中，液體驅動系統一般採用注液泵或者加液泵，通過計算機等實現自動控制。樣品溶液或者試劑溶液的體積一般根據實際需要確定。
[0023]步驟2-3、步驟6中，毛細管尖端脫離微孔後，在微孔內表面對微孔的吸附作用下，液滴與毛細管尖端分離，在微孔中形成獨立的樣品液滴，完成一次完整的樣品液滴生成操作過程。
[0024]本發明中更換步驟1、步驟4中毛細管中充滿的待點樣的樣品溶液或者試劑溶液的種類，可生成不同種類的樣品液滴或者試劑液滴，以滿足各種場合檢測的需求。根據實驗目的不同，可選擇先注入試劑溶液、或者先注入樣品溶液；然後再注入另外的樣品溶液或者試劑溶液；步驟I和步驟4中毛細管中充入的溶液只能是試劑溶液和樣品溶液的一種，且互不相同。
[0025]步驟4中，d2設定時，需要至少滿足步驟5中毛細管推出的試劑溶液或者樣品溶液形成完成的液滴前與已經形成的樣品液滴或者試劑液滴外表面接觸，以保證從毛細管的尖端推出形成的試劑液滴或樣品液滴順利與微孔中的已有的樣品液滴或試劑液滴接觸發生融合。
[0026]本發明的點樣和加液方法能夠應用於多樣品體系，即利用步驟I至步驟2的方法分別對不同樣品進行點樣；然後用步驟4至步驟6的方法分別對不同實際進行點樣。其具體操作步驟為:
[0027]I)在微孔陣列晶片上的不同微孔內，形成具有相同體積的不同樣品的樣品液滴，構成樣品液滴陣列；
[0028]2)利用毛細管在每個樣品液滴上方推出相同體積的試劑溶液，形成試劑液滴，並與晶片上的樣品液滴融合形成液滴反應器，構成反應器液滴陣列。
[0029]當需要進行具有多種濃度的樣品或者試劑的實驗時，也可採用本發明的方法，此時所述步驟2-2中毛細管推出的為體積不同、相同樣品的樣品液滴；所述步驟5中毛細管推出的為不同體積的試劑溶液；所述液滴反應器的總體積相同。其具體操作步驟為:
[0030]I)在微孔陣列晶片上的不同微孔內，形成具有不同體積的相同樣品液滴或者試劑液滴；例如體積逐漸增加或者逐漸減小；
[0031]2)利用毛細管在每個液滴上方推出不同體積的試劑溶液或者樣品溶液，並與微孔陣列晶片上的樣品液滴或者試劑液滴融合，形成液滴反應器。通過控制微孔中所形成的液滴的體積和後續加入溶液的體積，使融合後的液滴反應器的總體積相同，且液滴反應器中樣品或試劑的濃度或者樣品與試劑的濃度配比呈一定的規律分布。
[0032]步驟2-1中根據點樣所生成液滴的體積，對毛細管的尖端與微孔的下表面之間的距離dl進行調整，調整範圍是I微米至5毫米，保證點樣所生成的液滴與微孔的下表面接觸。
[0033]步驟4中，根據加液的體積和微孔中已生成的液滴的體積，對毛細管尖端與微孔中已生成的液滴上表面之間的距離d2進行調整，調整範圍是I微米至5毫米，保證加液生成的液滴與微孔中液滴上表面接觸。
[0034]所述毛細管的材質為石英、或者玻璃、或者金屬、或者高分子聚合物；毛細管內徑在I微米至5毫米範圍內；毛細管管壁厚度在I微米至5毫米範圍內；毛細管長度在I毫米至10米範圍內。
[0035]所述微孔陣列晶片上的微孔的深度範圍是I微米至5毫米，容納液體體積範圍是I飛升至100微升。
[0036]為保證液滴順利進入到微孔內，所述微孔內表面與液滴之間的作用力應該大於或者等於毛細管尖端與液滴之間的作用力。為進一步保證液滴迅速形成同時迅速脫離毛細管，作為優選:所述毛細管的尖端進行拉尖處理，並對毛細管的內外壁進行疏水化表面處理；進一步降低液滴與毛細管之間的作用力。另外，也可選擇對微孔陣列晶片的表面進行疏水化處理。為避免液滴沿微孔陣列晶片表面漂移，作為另一種優選，可對微孔陣列晶片進行選擇性疏水和親水化處理，使微孔內表面保持親水性，微孔以外的晶片表面保持疏水性。即，對微孔內表面進行親水化處理，對微孔以外的微孔陣列晶片的其餘表面進行疏水化處理。所述疏水化處理，包括矽烷化、或氟烷化、或聚合物塗層等方法。
[0037]與現有技術相比，本發明的優點主要在於:
[0038](I)半接觸式的油下液滴點樣和加液方法，可有效地提高微孔陣列晶片上液滴點樣的可靠性和均一性；
[0039](2)採用連續式液滴點樣和加液方法，顯著地提高了液滴生成的速度，利於分析和篩選通量的提高；
[0040](3)點樣和加液過程中，毛細管尖端不與晶片或者已有的液滴接觸，避免了交叉汙染；
[0041](4)利用變體積液滴點樣和加液方法，可在晶片上快速生成具有濃度梯度的樣品或者試劑液滴陣列。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]圖1是採用半接觸式油下液滴連續點樣和加液方法進行樣品液滴生成和試劑加入操作的原理示意圖。
[0043]圖2是採用半接觸式油下液滴連續點樣和加液方法進行試劑液滴生成和樣品加入操作的原理示意圖。
[0044]圖3是利用液滴連續點樣方法生成的螢光素液滴陣列圖片，以及利用連續加液方法對螢光素液滴陣列進行等體積稀釋得到的液滴陣列圖片。
[0045]圖4是利用變體積液滴連續點樣和加液方法生成具有濃度梯度的液滴陣列的原理示意圖。
[0046]圖5是利用變體積液滴點樣和加液方法生成的具有濃度梯度的螢光素液滴陣列圖片。
[0047]圖6是液滴內螢光素濃度對應螢光強度的線性曲線圖。
[0048]圖中:1-毛細管，2-微孔陣列晶片，3-微孔，4-油相，5-樣品溶液，6-樣品液滴，7-試劑溶液，8-試劑液滴，9-液滴反應器。
【具體實施方式】
[0049]下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步說明:
[0050]參照附圖，以下將詳細描述根據本發明的優選實施例。[0051]實施例1
[0052]圖1是採用半接觸式油下液滴連續點樣和加液方法進行樣品液滴生成和試劑加入操作的原理示意圖。液滴連續點樣生成樣品液滴6的具體操作過程(圖1 (I) - (4))如下:對毛細管I的取樣端進行拉尖處理來降低取樣過程中的交叉汙染，並對毛細管I的內壁進行疏水化表面處理來防止樣品和試劑在其表面的吸附。在微孔陣列晶片2的上方覆蓋一層與水不互溶的油相4。在毛細管I中吸入一定體積待點樣的樣品溶液5，移動平移臺，使毛細管I置於微孔陣列晶片2的微孔3中心的正上方。根據點樣液滴的體積大小，調整毛細管I的尖端與微孔3下表面的間距dl，使點出的樣品液滴6可與微孔3下表面接觸。啟動液體驅動系統，從毛細管I中推出一定體積的樣品溶液5,首先在毛細管尖端形成樣品液滴6，然後該樣品液滴6與微孔3的下表面接觸，在微孔3中形成樣品液滴6。移動平移臺，使毛細管I離開微孔3。由於微孔3下表面對樣品液滴6的吸附作用，樣品液滴6與毛細管I尖端分離，在微孔3中形成獨立的樣品液滴6。至此，完成一次完整的樣品液滴生成操作過程。重複上述操作，可在微孔陣列晶片2上形成由多個樣品液滴6構成的樣品液滴陣列。
[0053]向已生成的液滴連續加液方法的具體操作過程(如圖1 (5)- (7))如下:在毛細管I中吸入一定體積待加入的試劑溶液7，並移動平移臺，使毛細管I置於微孔3中已生成樣品液滴6的正上方。調整毛細管I尖端與樣品液滴6的上表面的距離d2，使點出的試劑液滴8可與樣品液滴6上表面接觸。啟動液體驅動系統，從毛細管I中推出一定體積的試劑溶液7，首先在毛細管I尖端形成試劑液滴8，再與微孔3中的樣品液滴6接觸，發生融合。移動平移臺，使毛細管I離開微孔3，試劑液滴8與微孔3中的樣品液滴6完全融合形成液滴反應器9。至此，完成一次完整的樣品液滴生成操作過程。重複上述操作，可在已生成的樣品液滴陣列中的每個樣品液滴6內，加入一定量的試劑溶液7，構成液滴反應器9陣列。
[0054]實施例2
[0055]圖2是採用半接觸式油下液滴連續點樣和加液方法進行試劑液滴生成和樣品加入操作的原理示意圖。液滴連續點樣生成試劑液滴8的具體操作過程(圖2 (O- (4))如下:對毛細管I的取樣端進行拉尖處理來降低取樣過程中的交叉汙染，並對毛細管I的內壁進行疏水化表面處理來防止樣品和試劑在其表面的吸附。在微孔陣列晶片2的上方覆蓋一層與水不互溶的油相4。在毛細管I中吸入一定體積待點樣的試劑溶液7，移動平移臺，使毛細管I置於微孔陣列晶片2的微孔3中心的正上方。根據點樣液滴的體積大小，調整毛細管I的尖端與微孔3下表面的間距dl，使點出的試劑液滴8可與微孔3下表面接觸。啟動液體驅動系統，從毛細管I中推出一定體積的試劑溶液7，首先在毛細管尖端形成試劑液滴8，然後該試劑液滴8與微孔3的下表面接觸，在微孔3中形成試劑液滴8。移動平移臺，使毛細管I離開微孔3。由於微孔3下表面對試劑液滴8的吸附作用，試劑液滴8與毛細管I尖端分離，在微孔3中形成獨立的試劑液滴8。至此，完成一次完整的試劑液滴生成操作過程。重複上述操作，可在微孔陣列晶片2上形成由多個試劑液滴8構成的試劑液滴陣列。
[0056]向已生成的試劑液滴連續加液方法的具體操作過程(如圖2 (5) - (7))如下:在毛細管I中吸入一定體積待加入的樣品溶液5，並移動平移臺，使毛細管I置於微孔3中已生成試劑液滴8的正上方。調整毛細管I尖端與試劑液滴8的上表面的距離d2，使點出的樣品液滴6可與試劑液滴8上表面接觸。啟動液體驅動系統，從毛細管I中推出一定體積的樣品溶液5，首先在毛細管I尖端形成樣品液滴6，再與微孔3中的試劑液滴6接觸，發生融合。移動平移臺，使毛細管I離開微孔3，試劑液滴8與微孔3中的樣品液滴6完全融合形成液滴反應器9。至此，完成一次完整的樣品液滴生成操作過程。重複上述操作，可在已生成的試劑液滴陣列中的每個試劑液滴8內，加入一定量的樣品溶液5，構成液滴反應器9陣列。
[0057]實施例3
[0058]圖3利用液滴連續點樣方法生成的螢光素液滴陣列圖片，以及利用連續加液方法對螢光素液滴陣列進行等體積稀釋得到的液滴陣列圖片。實驗選取毛細管的內徑為150微米，外徑為200微米。對其取樣端進行拉尖處理，尖端的尺寸約為30微米。採用十八烷基三氯矽烷對毛細管的內壁和尖端進行疏水化處理。以裝有I微升注射器的注射泵為液體驅動系統，並將注射器與毛細管相連。採用光刻和溼法刻蝕的方法在玻璃基片上加工微孔陣列，每個微孔的尺寸為直徑260微米，深60微米，微孔之間的圓心距為400微米。同樣採用十八烷基三氯矽烷對微孔陣列晶片的表面進行疏水化表面處理。將微孔陣列晶片裝載至三維平移臺上，並在其表面覆蓋一層厚度為2毫米的礦物油。首先在毛細管中吸取100納升的螢光素鈉溶液(10mM)，按照圖1所述的液滴連續點樣方法，分別移動平移臺，保持毛細管尖端與微孔下表面的距離為100微米，在每個微孔中點入1.98納升的螢光素鈉溶液，形成含有50個1.98納升的螢光素鈉液滴的液滴陣列。然後，推出毛細管中多餘的螢光素鈉溶液至廢液管中，並對毛細管進行清洗。最後，在毛細管中充滿100納升的緩衝液(50mM硼砂)，按照圖1所述的液滴連續加液方法，分別移動平移臺，保持毛細管尖端與微孔下表面的距離為150微米,在每個螢光素鈉液滴上方從毛細管內推出1.98納升的緩衝液液滴,並與微孔中的樣品液滴融合，得到50個由體積為3.96納升的稀釋液滴構成的液滴陣列。分別對兩種液滴陣列進行螢光拍照，並計算液滴直徑的相對標準偏差RSD。螢光素鈉液滴陣列和稀釋液滴陣列的液滴直徑RSD分別為1.11%和1.00%，表明液滴連續點樣技術和連續加液技術具有較高的液體處理精度。
[0059]實施例4
[0060]圖4是利用變體積液滴連續點樣和加液方法生成具有濃度梯度的液滴陣列的原理示意圖。變體積液滴連續點樣的具體操作過程如下:首先在毛細管I中吸入一定體積待點樣的樣品溶液5，然後按照圖1所述的液滴連續點樣方法，分別移動平移臺，在每個微孔3中點出體積不同的樣品溶液5，形成樣品液滴6。樣品液滴6的體積V#s按照一定的規律逐漸增大。在點樣的過程中，根據樣品液滴6體積V#s對毛細管I尖端與微孔3下表面的距離進行動態調整，使點出的樣品液滴6可與微孔3的下表面接觸。變體積液滴連續加液方法的具體操作過程如下:在毛細管I中吸入一定體積待加入的試劑溶液7，並移動平移臺，使毛細管I置於樣品液滴6的上方。分別在每個樣品液滴6的上方從毛細管內推出不同體積的試劑液滴8，並調整毛細管I尖端與微孔3下表面的距離，使試劑液滴8與樣品液滴6接觸發生融合，形成液滴反應器9。試劑液滴8的體積Vww根據樣品液滴的體積進行動態調整，使液滴反應器9的體積Vg=Vww+V#s保持不變，從而得到具有不同樣品/試劑濃度和配比的液滴反應器陣列。
[0061]實施例5
[0062]圖5是利用變體積液滴點樣和加液方法生成的具有濃度梯度的螢光素液滴陣列圖片。採用IOyM螢光素鈉作為樣品溶液。按照實施例4所述的變體積液滴連續點樣操作步驟，首先在微孔陣列中生成不同體積的螢光素鈉液滴陣列，液滴體積從左到右分別為
0.42納升、0.84納升、1.26納升、1.68納升、2.10納升、2.52納升、2.94納升、3.36納升和
3.78納升，每個體積重複三個液滴。在液滴點樣的過程中，毛細管尖端與微孔下表面的距離根據液滴大小進行動態調節，從左到由分別為50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、110微米、120微米和130微米。然後按照實施例4所述的變體積液滴連續加液的操作步驟，分別在每個螢光素鈉液滴中加入不同體積的硼砂緩衝液液滴，並與螢光素鈉樣品液滴融合。在每個螢光素鈉液滴中加入的硼砂液滴體積從左到右分別為3.78納升、3.36納升、2.94納升、2.52納升、2.10納升、1.68納升、1.26納升、0.84納升和0.42納升。混合後的液滴總體積為4.20納升,從而使混合後液滴內螢光素鈉濃度按照I μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、
4μ Μ、5 μ Μ、6 μ Μ、7 μ Μ、8 μ Μ、和9 μ M的梯度遞增，形成濃度梯度液滴陣列。如圖6所示，對液滴陣列進行螢光成像，並取液滴的螢光強度值，得到濃度對應螢光強度的線性曲線。線性相關係數為99.96%，證明了利用變體積液滴點樣和加液方法具有較高的液體操控精度。
【權利要求】
1.一種半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，包括毛細管(I)、帶有微孔(3)的微孔陣列晶片(2)、以及用於驅動毛細管(I)滴液的液體驅動系統，其特徵在於:包括如下步驟: 步驟1:在毛細管(I)中充滿待點樣的樣品溶液(5)或者試劑溶液(7)，並在微孔陣列晶片(2)上覆蓋一層油相(4); 步驟2:利用毛細管(I)在微孔陣列晶片(2)上形成樣品液滴(6)或者試劑液滴(8)的陣列； 步驟3:在毛細管(I)中充滿待點樣的試劑溶液(7)或者樣品溶液(5)； 步驟4:控制毛細管(I)尖端基本對準待加入液滴所在的微孔(3)的中心，並與微孔(3)中的樣品液滴(6)或者試劑液滴(8)的上表面保持距離d2 ； 步驟5:啟動液體驅動系統，將預設體積的試劑溶液(7)或者樣品溶液(5)從毛細管(I)的尖端推出，與微孔(3)中的已有的樣品液滴(6)或試劑液滴(8)接觸融合； 步驟6:控制毛細管脫離微孔(3)，被推出的試劑液滴(8)或者樣品液滴(6)與微孔中已有的樣品液滴(6)或者試劑液滴(8)完全融合,形成存放於微孔(3)中的液滴反應器(9)； 重複步驟3至步驟6，在微孔陣列晶片(2)上形成液滴反應器(9)陣列。
2.根據權利要求1所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:所述步驟2的具體步驟為 : 步驟2-1:控制毛細管(I)的尖端基本對準微孔陣列晶片(2)上的某一微孔(3)的中心，並與該微孔(3)的下表面保持距離dl ； 步驟2-2:啟動液體驅動系統，將預設體積的樣品溶液(5)或者試劑溶液(7)從毛細管(O的尖端推出，與微孔(3)的下表面接觸； 步驟2-3:控制毛細管(I)尖端脫離微孔(3)，形成存放於微孔(3)中的樣品液滴(6)或者試劑液滴(8)； 重複步驟2-1至步驟2-3，在微孔陣列晶片(2)上形成樣品液滴(6)或者試劑液滴(8)的陣列。
3.根據權利要求2所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:所述步驟2-2中毛細管(I)推出的為體積不同的樣品液滴(6);所述步驟5中毛細管(I)推出的為不同體積的試劑溶液(7);所述液滴反應器(9)的總體積相同。
4.根據權利要求2或3所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:步驟2-1中根據點樣所生成液滴的體積，對毛細管(I)的尖端與微孔(3)的下表面之間的距離dl進行調整，調整範圍是I微米至5毫米，保證點樣所生成的液滴與微孔(3)的下表面接觸。
5.根據權利要求2或3所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:步驟4中，根據加液的體積和微孔(3)中已生成的液滴的體積，對毛細管(I)尖端與微孔(3)中已生成的液滴上表面之間的距離d2進行調整，調整範圍是I微米至5毫米，保證加液生成的液滴與微孔(3)中液滴上表面接觸。
6.根據權利要求2或3所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:所述毛細管(I)的內徑在I微米至5毫米範圍內。
7.根據權利要求2或3所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:所述微孔陣列晶片(2)上的微孔(3)的深度範圍是I微米至5毫米，容納液體體積範圍是I飛升至100微升。
8.根據權利要求2或3所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:所述毛細管(I)的尖端進行拉尖處理，並對毛細管(I)的內外壁進行疏水化表面處理。
9.根據權利要求2或3所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:對微孔陣列晶片(2)的表面進行疏水化處理。
10.根據權利要求2或3所述的半接觸式的油下液滴連續點樣和加液方法，其特徵在於:對微孔(3)內表面進行親水化處理，對微孔(3)以外的微孔陣列晶片(2)的其餘表面進行疏水化處理。
【文檔編號】G01N35/10GK103954786SQ201410161574
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】祝瑩, 方群, 張雲霞, 朱麗娜 申請人:浙江大學