來自間充質飼養細胞的旁分泌信號以及使用該旁分泌信號調節肝祖細胞的擴增和分化的製作方法

2023-06-13 12:38:31 3

專利名稱：來自間充質飼養細胞的旁分泌信號以及使用該旁分泌信號調節肝祖細胞的擴增和分化的製作方法
技術領域：
本發明總體上涉及肝祖細胞的先體外後體內繁殖和/或分化。更具體地，本發明 涉及來自間充質細胞的可溶性旁分泌信號和不溶性旁分泌信號的識別和選擇以及它們在 體外調節肝祖細胞(包括肝幹細胞)的擴增和/或分化方面的應用。
背景技術：
肝幹細胞和它們的後代細胞(例如，成肝細胞和定向祖細胞)具有相當大的擴增 潛力。因此，這些細胞群是用於細胞療法的理想的候選細胞，所述細胞療法包括生物人工肝 髒或細胞移植。儘管具有這樣的前景，然而肝細胞療法的全部潛能仍有待實現。已證實肝幹細胞和它們的後代細胞的體外繁殖是富有挑戰性的，部分地是因為體外培養條件對於從實驗臺到臨床的轉變並非總是最佳的。例如，一些培養條件不利於存活、 可大大阻礙細胞分裂或可促進細胞向不期望的細胞結局分化。同樣，一些培養條件需要添 加因子(例如血清)，這些因子可引入汙染物，從而限制了它們在治療人類方面的應用。正常細胞(尤其是祖細胞)的維持需要間充質伴胞的飼養細胞，眾所周知該飼養 細胞提供對於祖細胞的存活和功能至關重要的旁分泌信號。需要識別間充質飼養細胞的類 另|J，然後使用所述間充質飼養細胞作為模型以識別它們的旁分泌信號、細胞外基質成分和 可溶性信號，這些信號和成分介導擴增、向特定細胞結局的譜系限制或肝祖細胞向它們的 成熟細胞結局(膽上皮細胞和肝細胞)的分化。限定信號使人們能夠在無飼養細胞的情形 下以合適的組合方式使用信號本身，以從肝祖細胞誘導期望的生物響應，所述生物響應包 括生存、擴增、向細胞結局的譜系限制以及向成熟肝細胞的完全分化。因此，需要限定培養 條件以便消除此前所述的飼養細胞的需求。

發明內容
在本發明的一種實施方式中，其提供體外繁殖肝幹細胞而不誘導它們分化的方 法，所述方法包括在無血清培養基中和基質組分(matrix components)層上培養分離 的肝幹細胞群，所述基質組分選自透明質酸、其他未硫酸化或少量硫酸化的糖胺聚糖 (GAG)、未硫酸化或少量硫酸化的蛋白聚糖、胚膠原蛋白(例如III型膠原蛋白)和胚基底 粘附分子以及它們的組合物，其中所述層基本不含成熟膠原蛋白(例如I型膠原蛋白)並 且其中所述培養使所述肝幹細胞繁殖而不誘導它們分化。所述基質組分中的任何一種或者全部可由成血管飼養細胞、休眠肝星形飼養細 胞、HUVEC飼養細胞或者它們的組合提供。所述基底粘附分子可包含主要在胎兒組織中發現的層粘連蛋白的亞型，並且所述GAG(非透明質酸)可以是硫酸軟骨素的形式。所述肝幹 細胞可以是人肝幹細胞，並可從胎兒肝臟、新生兒肝臟、兒童肝臟或成人肝臟中獲得。可以 約0. 1 μ g/cm2至約2 μ g/cm2的濃度提供所述層粘連蛋白，優選地，以約1 μ g/cm2的濃度提 供。類似地，III型或IV型膠原蛋白的濃度各自為約0. 1 μ g/cm2至約15 μ g/cm2。
在本發明的另一種實施方式中，其提供在體外將肝幹細胞分化至成肝細胞的方 法，所述方法包括在無血清培養基中和基質組分層上培養分離的肝幹細胞群，所述基質組 分選自胚膠原蛋白、基底粘附分子、CS-PG和它們的組合，其中所述層基本不含成熟膠原 蛋白並且其中所述培養使所述肝幹細胞繁殖而不誘導它們分化。所述基質組分中的任何一種或者全部可由活化的內皮細胞、活化的肝星形飼養細 胞或它們兩者提供。所述胚膠原蛋白可以是IV型膠原蛋白並且所述基底粘附分子可包含 層粘連蛋白的胎亞型(fetal isoform)，可以約0. 1 μ g/cm2至約2 μ g/cm2的濃度提供所述 胎亞型，優選地，以約1 μ g/cm2的濃度提供。在一些實施方式中，所述層還包含透明質酸。 所述肝幹細胞可從胎兒肝臟、新生兒肝臟、兒童肝臟或成人肝臟中獲得，優選地，從人肝臟 中獲得。 在本發明的又一種實施方式中，其提供在體外將肝幹細胞或成肝細胞分化成定向 肝祖細胞或膽祖細胞以及它們的後代細胞的方法，所述方法包括在無血清培養基中和基 質組分層上培養分離的肝幹細胞群，所述基質組分選自硫酸化的蛋白聚糖、成熟膠原蛋 白、纖連蛋白以及它們的組合物，且其中所述培養誘導所述肝幹細胞或成肝細胞分化為定 向肝祖細胞或膽祖細胞以及它們的後代細胞。所述基質組分中的任何一種或全部可由基質 飼養細胞、活化的肝星形飼養細胞、成肌纖維飼養細胞或它們的組合提供。在一些實施方 式中，所述層基本不含透明質酸並且所述硫酸化的蛋白聚糖可以是硫酸乙醯肝素-PG或肝 素-PG或者它們兩者。在本發明的再一種實施方式中，其提供一種用於肝祖細胞繁殖或分化的容器。所 述容器包含基質組分層，該基質組分選自透明質酸、其他未硫酸化的或其他少量硫酸化的 糖胺聚糖、未硫酸化或少量硫酸化的蛋白聚糖、胚膠原蛋白和胚基底粘附分子以及它們的 組合；其中所述層基本不含成熟膠原蛋白；並且其中所述基質組分層基本覆蓋所述容器的 至少一個表面。可選地，所述層可包含選自胚膠原蛋白、基底粘附分子、CS-PG以及它們的組合的 基質組分，其中所述層基本不含成熟膠原蛋白；並且其中基質組分的所述層基本覆蓋所述 容器的至少一個表面。最後，所述層可包含選自硫酸化的蛋白聚糖、成熟膠原蛋白、纖連蛋 白以及它們的組合的基質組分，其中所述基質組分層基本覆蓋所述容器的至少一個表面。 所述容器可以是組織培養平板、生物反應器、實驗用細胞或實驗用晶片。同樣，本領域技術人員將意識到，本發明公開的內容所依據的思想可容易被用作 設計用於實現本發明的數個目的的其他結構、方法和系統的基礎。因此重要的是，權利要求 被認為包括了不背離本發明的精神和保護範圍的這種等同解釋。


圖1顯示培養基中hHpSC和人成肝細胞的集落hHpSC集落(A)和人成肝細胞(B) 都表達EpCAM(顯示為綠色)。NCAM(顯示為紅色，A)沿集落的外圍區域和集落的中心表達。成肝細胞高強度地表達甲胎蛋白(AFP，顯示為紅色，B)。兩種細胞均用DAPI (藍色)染色。 標尺，100 μ m0圖2顯示hHpSC集落周圍的細胞是α SMA+hHpSC 典型的人肝幹細胞集落㈧對集落內部的NCAM(B，D)和在集落邊緣的伴胞中的α SMA(C，D)呈陽性。放大倍數，10χ。圖3顯示具有成血管細胞的hHpSC的原代培養物KDR+選擇的細胞在EGM-2中培 養7天表達vWF (綠色)(A和B)。⑶31+選擇的細胞在EGM-2中培養4天表達vWF (綠色) 和⑶31 (紅色)(C)。標尺100μπι。在培養基中成血管細胞與hHpSC集落結合(D)。放大 倍數=IOx0圖4比較休眠hHpSTC與活化的hHpSTC 休眠hHpSTC表達低水平的結蛋白、 α SMA+,⑶146、I型膠原蛋白和其他基質分子(纖連蛋白、蛋白聚糖)。損傷過程(injury processes) 一例如，暴露於血清或某種因子(例如PDGF和TGF-B1) —導致hHpSTC活化並 且轉變至成肌纖維細胞樣基質細胞並提高了 α SMA和基質組分的產量以及釋放各種生長 因子(例如HGF)。圖示的是由間充質伴胞包圍的hHpSC集落(成血管細胞和休眠hHpSTC) 表達低水平的CD146。在相同的平板上，鄰近的集落與間充質伴胞一同顯示，該鄰近集落經 過激活導致產生高水平的⑶146。圖5顯示不同飼養細胞的形態學和免疫組織化學A :hMSC ；B :hUVEC ；C-D :4天 (C)和7天(D)的來源於人胎肝的飼養細胞；E-H 磁性免疫選擇的KDR+細胞(E-F)和去成 纖維細胞的上層細胞(G-H)在無血清條件下的第11天培養物對於α SMA呈陽性(F和H)。 放大倍數10χ。圖6顯示在EGM-2培養基中培養8天的去成纖維細胞的上層細胞的免疫組織化 學細胞對結蛋白(B和H)、α SMA(I)、層粘連蛋白(C)、纖連蛋白(F)、I型膠原蛋白(L)和 IV型膠原蛋白(E)呈陽性，並且對內皮細胞標記物vWF(K)呈陰性。值得注意的是，表達 α SMA的細胞較表達結蛋白的細胞多。圖示了每一個雙重染色的相差影像(A、D、G*J)。 標尺50 μ m。圖7顯示與不同飼養細胞共培養的hHpSC的一些影響。A-F 單獨培養hHpSC (A)， 與hUVEC共培養(B)，與hMSC共培養(C)或與人胎肝來源的飼養細胞共培養(D)。放大倍 數:10x。圖8顯示了與α SMA+上層細胞共培養的人hHpSC，所述α SMA+上層細胞從人胎兒 肝臟中獲得，成纖維細胞已從該上層細胞中去除。這些飼養細胞的使用導致譜系限制為成 肝細胞。人肝幹細胞集落上的人AFP免疫組織化學(Α和B)和在hHpSC和人胎肝來源的飼 養細胞上共培養八天的人AFP免疫組織化學(C和D)。放大倍數10x。圖9顯示了用於mRNA編碼基質分子的標準化mRNA表達在每種細胞類型中mRNA 表達水平的倍數變化以相同細胞類型中核糖體RNA(ISS)的含量被標準化。圖10顯示了在純化的基質組分的基底上hHpSC的行為在塑料或III型膠原蛋白 上hHpSC維持幹細胞特性(A和B)。當在IV型膠原蛋白上或層粘連蛋白上培養hHpSC時， hHpSC譜系限制為成肝細胞(C和D)。當在I型膠原蛋白上培養hHpSC時，hHpSC進一步分 化為成熟肝細胞。D使用更高的放大倍數。圖11提供分化期間hHpSC和它們的間充質伴胞在基質化學和基質受體方面的變 化。
圖12提供在共培養中和在人胎肝細胞培養中產生的人細胞因子之間的比較。在 人胎肝細胞單一培養中產生的人細胞因子的濃度(pg/ml)低(上部)，在STO飼養細胞與人 胎肝細胞的共培養中產生的人細胞因子的濃度(Pg/ml)高(底部)。圖13提供在共培養中和在STO飼養細胞培養中產生的小鼠細胞因子之間的比較。 在STO飼養細胞單一培養中產生的小鼠細胞因子的濃度(pg/ml)低(上部)，在STO飼養細 胞和人胎肝細胞的共培養中產生的小鼠細胞因子的濃度(Pg/ml)高(底部)。
圖14顯示細胞因子對rter6細胞集落形成的影響。圖示了具有細胞因子和不具 有細胞因子的激素限量培養基(HDM)中大鼠肝祖細胞(rter6)的集落數量(上部)和面積 (底部，以像素表示)。
具體實施例方式在本發明的一種實施方式中，細胞外基質組分已被識別，其有利於貼附、存活、先 體外後體內繁殖以及誘導肝幹細胞及其後代細胞的分化的其他基質組分。在此使用的術語 「肝祖細胞」被寬泛地定義為包含肝幹細胞和它們的後代細胞。「後代細胞」可包括肝幹細 胞或成肝細胞、它們兩者的多能祖細胞以及僅可分化成一個譜系(導致產生特定成熟細胞 類型(例如，肝細胞))的定向祖細胞。「克隆擴增」是指細胞生長的以下性質可從單一細胞擴增並且可被繼代培養和重 復擴增並保持親代細胞的表型。「集落形成」是指二倍體實質細胞的以下性質可在一星期 或兩星期內經過有限次的細胞分裂(通常5-7次細胞分裂)，並且「集落形成」涉及具有進 行繼代培養或傳代的有限能力的細胞。「多能」是指細胞可形成具有一種以上細胞結局的子 細胞；「單能」或「定向祖細胞」是指具有單一成熟結局的細胞。肝幹細胞(HpSC)是在胎兒肝臟和新生兒肝臟的管板(ductal plate)(也稱為界 板(limiting plate))以及兒童肝臟和成人肝臟的赫林氏管中發現的多能細胞，並且肝幹 細胞顯示出用端粒酶的表達實現自身複製的證據並且能夠在移植時形成成熟肝細胞。這些 細胞是EpCAM+、NCAM+、ALB+、CK8/18+、CK19+、CD133/l+，並且這些細胞對所測試的所有造血 標記物(例如，⑶34、⑶38、⑶45、CD14)、間充質細胞標記物(CD 146, VEGFr、⑶31)和P450 或甲胎蛋白的表達呈陰性。已發現HpSC產生成肝細胞以及定向(單能)祖細胞。成肝細胞(HB)是在整個胎兒肝臟和新生兒肝臟的實質中發現的雙能(bipotent) 細胞，該成肝細胞作為單一細胞或細胞的小聚集體固定於赫林氏管的末端。HB來源於 HpSC。HB共享HpSC上存在的許多抗原，但具有重要的差異。例如，HB不表達NCAM，反而表 達ICAMl並且HB表達大量的甲胎蛋白和胎兒P450。這些HB產生單能祖細胞、定向肝祖細 胞和膽祖細胞。定向肝祖細胞是肝譜系或膽譜系的單能祖細胞。它們的抗原輪廓(antigenic profile)與HB的抗原輪廓重疊；然而，膽定向祖細胞表達CK19但不表達AFP或ALB，而肝 定向祖細胞表達AFP和ALB但不表達CK19。定向膽祖細胞直接來源於肝幹細胞且也直接來 源於成肝細胞。間充質細胞(MC)包括許多不同間充質細胞類型的處於各種不同譜系階段的細胞 (以成熟細胞的形式列出，括號中是其前體)包括基質(間充質幹細胞)、內皮(成血管細 胞)、星形細胞(星形細胞前體)以及各種不同的造血細胞(造血幹細胞)。
雖然本文的大多數(如果不是全部的話)肝祖細胞的討論和例子將涉及人源細胞 群，但本文的教導內容不應限於人。事實上，可期望本領域的技術人員將本文的教導普遍應 用於從哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、狗等)擴增肝祖細胞。相應地，本發明的範圍預期包括 任何哺乳動物和所有哺乳動物的肝祖細胞。還應注意，根據本發明適於體外繁殖的肝祖細胞不限於那些通過任何特定方法 分離或識別的肝祖細胞。例如，用於肝祖細胞分離和識別的方法已在例如美國專利第 6，069，005號和美國專利申請第09/487，318號、第10/135，700號和第10/387，547號中描 述，通過引用將其中公開的內容全部併入本文。
肝幹細胞和成肝細胞具有特有的抗原輪廓，因而可通過前面描述的方案分離。例 如，肝幹細胞和成肝細胞共享許多抗原(例如，細胞角蛋白8、18和19、白蛋白、CD133/1和 上皮細胞粘附分子(「EpCAM」))並且肝幹細胞和成肝細胞對造血標記物(例如，血型糖蛋 白 A、CD34、CD38、CD45、CD14)和間充質細胞標記物(例如，CD146、CD31、VEGFr 或 KDR)呈 陰性。可選地，肝幹細胞和成肝細胞可通過以下方面而相互區分尺寸(肝幹細胞為7μπι 至9 μ m ；成肝細胞為10 μ m至12 μ m)、在培養基中的形態學(肝幹細胞形成緊密的、形態均 勻的集落，而成肝細胞形成穿插了清晰的通道、假定的小管的帶狀結構)、特定抗原表達模 式的差異(EpCAM在整個肝幹細胞中表達但在成肝細胞中被限制在細胞表面)或不同的抗 原輪廓(在肝幹細胞中存在N-CAM，而成肝細胞表達甲胎蛋白(AFP)和ICAM1)。在胎兒的 肝臟和新生兒的肝臟中，肝幹細胞位於管板(也稱為界板)中，而成肝細胞是實質細胞群的 主要成分(> 80% )。在兒童組織和成人組織中，肝幹細胞存在於赫林氏管中，而成肝細胞 是被固定於赫林氏管的末端的細胞。在正常組織中，成肝細胞由少量細胞組成，但在患病的 肝臟(例如肝硬化)中，成肝細胞由大量細胞組成(例如節(nodule))。本發明提供在體外控制HpSC(優選為人HpSC(hHpSC))的先體外後體內維持的方 法。更具體地，本發明的方法能夠繁殖HpSC(I)而不誘導分化(例如自身更新)；(2)誘導 HpSC分化(例如「譜系限制」)為成肝細胞；或(3)誘導更「廣泛」的分化(例如分化為定 向祖細胞)(本文中集體稱為「先體外後體內維持」)。該方法部分地是通過選擇性地使用 在共培養中使用的間充質飼養細胞的特定類型而實現的。本發明還提供不溶性組分(例如 基質分子)和可溶性組分(例如細胞角蛋白)，這些組分單獨或組合在一起使得HpSC繁殖， 如果優選的話，使得HpSC在不存在飼養細胞的情況下繁殖。表1總結了有關影響上述先體 外後體內維持的模式所發現的不溶性因子。
或肝星形細胞前體組成的伴胞結合時才存活。 *培養形態和抗原輪廓
hHpSC集落是具有均勻形態細胞的單層，核與細胞質的比率高，直徑 ~7-9μηι,被由成血管細胞和hHpSTC組成的伴胞緊密包裝和環繞。獨特的抗 原輪廓NCAM+、密蛋白3+、白蛋白士、AFP-。
成肝細胞表現為更具三維形狀的集落，該集落具有穿插清晰的通道(膽 小管)的帶狀結構並且細胞的直徑略大(10-12μιη)。獨特的抗原輪廊:ICAM+、 密蛋白3-、白蛋白++、AFP++,
hHpSC和成肝細胞之間共享的抗原輪廓對EpCAM、CK8, 18和19、Ihh 蛋白(sonic, India)、端粒酶呈陽性；對造血蛋白標記物(CD34、CD45、 CD38,血型糖蛋白A)、肝星形細胞標記物(結蛋白和aSMA)和內皮細胞 標記物(VEGFr、CD31、vWF )呈陰性。與上面列舉的三種先體外後體內維持的模式一致的三種不同種類的飼養細胞已 被識別。與內皮細胞前體的飼養細胞或無人肝星形細胞(hHpSTC)的成血管細胞(或可選 擇地包含休眠hHpSTC)的共培養允許HpSC的擴增不誘導它們分化。充滿活化內皮細胞和 hHpSTC的飼養細胞將HpSC譜系限制為成肝細胞。最後，包含成熟內皮細胞或鼠科動物基質 細胞(以STO細胞代表)的飼養細胞導致HpSC分化為成熟實質細胞(包括膽細胞和肝細 胞)。目前認為，已識別的共培養行為與在肝臟發展過程中觀察到的共培養行為類似，所述 共培養行為由鄰近上皮細胞的間充質細胞的旁分泌信號調控。基質化學可能與胚胎發育相關。在本發明的一種實施方式中，本發明人已經發現 在肝臟的幹細胞龕(niche)內或附近發現的細胞外基質組分比現有技術更好地提供用於 肝祖細胞的擴增而不誘導分化。如在2006年11月15日提交的美國專利申請第11/560，049 號中描述的(其公開的內容在此通過引用全部併入本文)，在基質組分上培養的細胞(在肝 髒的幹細胞龕內或肝臟的幹細胞龕附近發現大量的這種細胞)聚集以在一些基質組分(例 如層粘連蛋白)上形成類球狀結構並且在其他的基質組分(例如III型膠原蛋白)上展開 為單層。在幹細胞龕內發現的細胞外基質組分的特定類型是肝祖細胞以自身複製模式擴增 所必需的信號的一種，所述自身複製模式是對稱的細胞分裂(子代細胞與親代細胞相同或 幾乎相同)。人們還認為，肝幹細胞的成熟伴隨著至少部分地引導分化的基質組分的特有組 合。一些細胞外基質組分允許肝祖細胞進行帶有不對稱分裂的擴增，這種擴增伴隨一些分 化。其他的位於發現了完全成熟肝臟細胞的肝臟組織區域的細胞外基質組分，誘發細胞生 長抑制和細胞完全分化。所有飼養細胞產生多種基質組分，所述基質組分包括基底粘附分子(纖連蛋白 和/或層粘連蛋白)和幾種膠原蛋白。纖連蛋白被證明是基質組分，其不由成血管細胞或 休眠hHpSTC表達，而由所研究的所有其他飼養細胞表達。纖連蛋白由人臍靜脈內皮細胞(hUVEC)以最高水平產生，但是HpSC不很好地附著至纖連蛋白。因此，纖連蛋白存在於基質中顯得與飼養細胞誘導的生物響應不相關。誘導自身 複製的飼養細胞表達III型膠原蛋白、IV型膠原蛋白、層粘連蛋白和透明質酸(成血管細 胞、休眠HpSTC、HUVEC細胞)。誘導譜系限制為成血管細胞並且具有連續擴增的飼養細胞 產生IV型膠原蛋白和層粘連蛋白(而非III型)、一些透明質酸以及一些硫酸軟骨素蛋白 聚糖(原代培養物充滿活化HpSTC，由升高水平的α SMA和CD146識別)。誘導最大分化的 飼養細胞表達最大量的基質，包括高水平的I型膠原蛋白和IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖 連蛋白和硫酸乙醯肝素蛋白聚糖。硫酸軟骨素蛋白聚糖(CS-PG)蛋白在人成纖維樣的、胎肝來源的細胞和骨髓源間 充質幹細胞(hMSC)中均是明顯的。這兩種類型的飼養細胞導致hHpSC的譜系限制為成肝 細胞。因此，類似於CS-PG的信號至少部分地介導該過程。已經假設，幹細胞龕主要是具有 很少直至沒有硫酸化的糖胺聚糖(GAG)(例如透明質酸)，因此，這些最少硫酸化的CS-PG可 作為將信號最小化地提供給幹細胞的障礙物。當幹細胞從龕中出來時，它們與GAG和具有 較廣泛的硫酸化的蛋白聚糖接觸並結合生長因子，所述生長因子可在生長方面或在趨向於 各種分化細胞結局的譜系限制方面影響幹細胞。在接種於STO飼養細胞上的hHpSC中觀察到了最大程度的分化，在STO飼養細胞上hHpSC進入生長抑制並且分化為成肝細胞和單能祖細胞(例如，定向膽祖細胞和定向肝 祖細胞)。STO飼養細胞產生最高水平的細胞外基質蛋白質並且在產生HS-PG方面是獨一
無二的。已確定I型膠原蛋白誘導最大程度的分化。已發現分化程度取決於細胞是接種於 I型膠原蛋白的上層還是嵌入在I型膠原蛋白內。實際上，在那些嵌入在膠原蛋白內的培養 物中發現了與成熟肝細胞形態上類似的細胞(圖10)。這種現象可能是由I型膠原蛋白的 直接影響和經由通過I型膠原蛋白來穩定HS-PG的間接影響引起的。圖11總結了在基質組分和基質受體中發現的序列變化，所述序列變化與hHpSC經 由成肝細胞最終成為成熟實質細胞的轉變同時發生。因此，所界定的本發明可允許在「無飼 養細胞」的培養基中繁殖HpSC。表2提供了由所研究的不同飼養細胞產生的細胞外基質組 分的詳細資料。
本發明的範圍不應限於任何一種基質組分、可溶性組分或它們的組合。與此處的教導一致，本發明描述並教導任何的和所有的可溶性組分和不溶性組分以及它們的組合在 基底和培養基的生成中的應用，所述基底和培養基可被用於細胞的先體外後體內，以實現 擴增或分化。雖然下文將討論這些組分中的大多數，但為清楚起見，層粘連蛋白、IV型膠原 蛋白和/或III型膠原蛋白僅僅作為在胚胎組織或幹細胞龕內發現的或大量發現的一類細 胞外基質組分的代表被討論。胚胎基質組分的非限制性實例包括特定類型的膠原蛋白，包括IV膠原蛋白(進 一步包括α 1、α 2、α 3、α 4、α 5、α 6)禾口 III型膠原蛋白；層粘連蛋白(包括1、Y 1、β 2、 α3、α5)；透明質酸；硫酸軟骨素蛋白聚糖(PG)的各種形式或它們的糖胺聚糖鏈；以及硫 酸乙醯肝素-PG的各種形式或它們的糖胺聚糖鏈(例如某些黏結蛋白聚糖)。在成熟組織中 發現的基質組分的非限制性實例包括膠原蛋白的穩定形式(例如I型和II型膠原蛋白)、 纖連蛋白的各種形式、硫酸乙醯肝素-PG (例如神經集聚蛋白、串珠蛋白聚糖)、肝素-PG、皮 膚素-PG (例如軟骨相關的硫酸皮膚素-PG)和彈性蛋白。除不溶性因子之外，可溶性生長因子和/或分化因子可影響細胞繁殖和/或分化 的速率。例如，血清的加入可減慢肝祖細胞的生長並且導致向肝細胞結局的譜系限制，同時 導致與疤痕組織形成相關的間充質細胞群(基質和內皮細胞)的快速擴增。表皮生長因子 的加入導致向肝細胞結局的譜系限制。優選地，在一些實施方式中，本文描述的基質組分結合使用無血清培養基。無血清 培養基之前是為HpSC和成肝細胞開發的並且在美國專利申請第09/678，953號中描述，該 專利申請公開的內容在此全部併入本文。本發明人已發現，白介素-Il(IL-Il)和白血病抑制因子(LIF)促進大鼠肝祖細胞 (rter6)在STO飼養細胞上部的集落形成。因為，IL-Il和LIF都是IL-6細胞因子家族的 成員，這些發現支持IL-6細胞因子家族在體外促進肝祖細胞生長的觀點。EGF減緩大鼠成 肝細胞的集落形成但是增加二倍體成年大鼠肝細胞的集落形成(但具有向肝細胞的譜系 限制和對膽上皮細胞的抑制)。同樣，當rter6細胞在STO飼養細胞上部生長時，TGF-β 1 增加rter6細胞的集落數量和面積，但是TGF-β 1抑制H印G2在塑料上的生長。hHpSC和STO飼養細胞的共培養誘導幾種人細胞因子和小鼠細胞因子的較高表 達，主要包括炎症信號和一些已知的刺激肝生長的因子。白介素_4(IL-4)是在共培養中顯 著增加的炎症細胞因子之一。在此更詳細討論這些和其他可溶性因子。不受理論約束或束縛，目前認為，本發明的基質組分和可溶性組分提供許多一般 由飼養細胞提供的存活信號、繁殖信號和/或分化信號。因此，本發明相當程度上可不需要 胚胎基質飼養細胞以維持肝祖細胞的生存能力和擴增潛力。本發明的實施方式將以非限制性實施例的方式被描述。實施例Kubota 氏培養基(KM)所有的培養物都放入KM中，KM是一種為肝祖細胞特製的無血清培養基(除非另有 說明)。該培養基在例如2000年10月3號提交的美國專利申請第09/679，663號中描述， 通過引用將該申請公開的內容全部併入本文。細胞系的來源(sourcim )
hMSC從26 歲男性捐贈者獲得。hUVEC從Cam Patterson博士(University ofNorth Carolina ；Chapel Hill, NC)獲得。鼠科動物胚胎基質細胞(ST0細胞)的克隆由從ATCC 獲得的STO細胞製備。人肝臟組織的來源人胎肝臟(妊娠齡16-20 周)從 Advanced Biological Resources (ABR， SanFrancisco, California)獲得。hHpSC的分離和培養人胎兒肝臟按照以上所述進行處理。將新鮮分離的實質細胞以5，000個細胞/cm2的接種密度放入KM中和培養塑料中或預接種的hUVEC、hMSC、ST0細胞的飼養細胞的頂部或 人胎肝來源的細胞的原代培養物中。所述細胞在加有2% FBS的KM中過夜，隨後轉換到在 KM中。塑料上和KM內的培養物生成被成血管細胞和未激活的hHpSTC前體包圍的hHpSC集落。飼養細胞的製備所有間充質飼養細胞的原種(stock)都在培養塑料上和具有2% FBS的內皮細胞 生長培養基(EGM-2) (Cambrex,ffalkersville,MD)中培養。這些條件的唯一例外是hMSC和 成人肝來源的HpSTC，它們按照以下描述生長。所有細胞生長至匯合，用絲裂黴素C抑制生 長，然後將細胞轉移至KM用於與hHpSC共培養。進一步的詳細信息如下 · hMSC被接種在具有DMEM的組織培養皿上，所述DMEM添加了 1 %抗生素、抗壞血 酸、2mM左旋穀氨酸和10% FBS0 來自成年大鼠和成人肝臟的HpSTC的純化的製備物由Dr. Yiffei Rong製備。飼 養細胞的原種在塑料上和加有5% FBS的KM中培養。· ST05飼養細胞由從ATCC獲得的STO細胞克隆並在齧齒動物肝祖細胞上測試它 們的效力。ST05的冷凍原種在加有5%胎牛血清的KM中解凍並生長。 為製備人胎肝來源的間充質細胞的原代培養物，使用0. 45mg/ml IV型膠原酶和 0. 3mg/ml脫氧核酸酶酶解肝臟，然後通過十字解剖刀機械地將肝臟分離為單細胞懸浮液。 洗滌掉過量的酶之後，所述細胞進行三次持續5分鐘的低速離心(20Xg)。收集上清液並且 將上清液重新懸浮於加有硒(10_9M)、1%抗生素和0. 1% BSA的RPMI-1640中。然後，所述 細胞被接種在培養塑料上和添加有10% FBS的KM中。間充質細胞在幾分鐘至幾小時內貼 附並迅速轉變為基質飼養細胞，該基質飼養細胞由活化的hHpSTC組成，活化的hHpSTC可通 過具有高水平結蛋白、⑶14和α SMA來識別。 使用單克隆抗人KDR小鼠IgGl(Cell Sciences, Canton，ΜΑ)、與磁性微珠偶 聯的山羊抗鼠IgG或與磁性微珠結合的單克隆抗人CD31小鼠IgGl，通過磁激活細胞揀選 (MACS)系統從胎兒肝臟細胞懸浮液中分離KDR+細胞或⑶31+細胞。KDR+細胞和⑶31+細 胞的接種密度是20，000細胞/cm2。 根據生產商的操作指南(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)使用與磁性微珠結合的 單克隆抗人成纖維細胞小鼠IgG2a，通過成纖維細胞的陰性選擇製備無基質細胞的飼養細 胞。無成纖維細胞的上層細胞的接種密度是500，000細胞/cm2。純化的基質基底(matrix substrata)在2006年11月15日提交的美國專利申請第11/560，049號中描述了用於體外培養的基質基底的製備，該專利申請公開的內容在此通過引用全部併入本文。纖連蛋白以0. 5 μ g/cm2、l. 0 μ g/cm2或2 μ g/cm2的濃度將纖連蛋白(Sigmam， F0895)塗覆在培養皿上並接著中和至pH7. 4。層粘連蛋白在pH7. 4條件下以0. 52 μ g/cm2或1. 0 μ g/cm2的濃度將層粘連蛋白 (Sigmam, L2020)塗覆在培養皿上。III型膠原蛋白和IV型膠原蛋白以5種不同的蛋白質濃度(2. lyg/cm2、4.2yg/ cm2、6. 3 μ g/cm2、8. 3 μ g/cm2和10. 4 μ g/cm2)中的一種在培養皿上製備膠原蛋白塗層。將 基質組分以酸性緩衝液的形式添加到培養皿中。允許所述基質在37°C和5% CO2的條件下 貼附超過10小時的時間。10小時後，通過2小時的紫外照射將所述培養皿消毒並接著用 PBS漂洗三次。用pH為3的醋酸形成III型膠原蛋白(Sigma，C-3511)，用0. 5M的醋酸形 成IV型膠原蛋白(Sigma, C-5533)。 I型膠原蛋白通過添加特定比例的IOx DMEM和0. IM NaOH將 VitrogenlOO (Cohesion Technologies, Palo Alto, CA)改性為液態 I 型膠原蛋白。因為氣 泡可使凝膠不穩定，因而防止氣泡的形成。I型膠原蛋白被用於單層細胞或作為「夾層」以 在兩層膠原蛋白之間嵌入細胞。在I型膠原蛋白上的單層細胞在將0. 4ml液體I型膠原蛋白分配到6孔培養板 的每孔內之前，該液態I型膠原蛋白被保持在4°C條件下。塗覆後，所述膠原蛋白在37°C和 5% CO2的條件下凝膠化一小時。夾層(嵌入細胞)模型細胞被夾在膠原蛋白層之間。經過10小時的細胞貼附時 間後，未貼附的細胞被移除並添加第二層0.4ml I型膠原蛋白層。該系統被允許在37°C和 5% CO2的條件下凝膠化一小時以固化上層膠原蛋白。人肝祖細胞和人胎肝來源的飼養細胞的免疫組織化學培養1至2周之後，用4%的多聚甲醛固定細胞用於免疫染色。所使用的抗體如下 結合FITC 的抗人 vWF 羊 IgG (US Biologicals, Swampscott，ΜΑ)、結合PE 的抗人 CD56 (NCAM) 小鼠 IgGl、抗人 CD31 小鼠 IgGl、結合 PE 的抗人 CD54 (ICAM-1)小鼠 IgGl (BD, San Jose, CA)、抗人α SMA小鼠IgG2a、抗人I型膠原蛋白小鼠IgGl、抗人III型膠原蛋白小鼠IgGl、 抗人層粘連蛋白小鼠IgGl、抗硫酸軟骨素蛋白聚糖小鼠IgM(Sigma，St. Louis, M0)、抗人 纖連蛋白小鼠 IgGl (Oncogene Research Products, Cambridge，ΜΑ)、兔抗人 IV 型膠原蛋 白 IgG(Research Diagnostics Inc.，Flanders, NJ)、大鼠抗人串珠蛋白聚糖 IgG2a(Lab Vision, Fremont, CA)、兔抗人 AFP IgG (Zymed-Invitrogen, South San Francisco, CA)、 抗人 KDR 小鼠 IgGl (Cell Sciences, Canton, MA)、Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgGl 和 Alexa Fluor 488 山羊抗 小鼠 IgG2a(Molecularobes-Invitrogen, Eugene, OR)。定量實時PCR使用RNeasy Mini RNA試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從細胞中提取總 RNA。接 著使用 superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA)將所提取的 RNA 逆轉錄為 cDNA。 使用下面表3所示的序列特異性引物和探針進行行實時定量PCR並通過ABI Prism 7000序 列檢測系統(Applied Biosystems,Foster City, CA,USA)分析實時定量PCR。來自每種細 胞類型的核糖體RNA(ISS)被用內部對照。測定mRNA相對於18s的表達水平並使用2_ΔΔετ方法計算倍數變化。所使用的引物如下表所列 用於MdSC的「天然」飼養細胞新鮮分離的hHpSC細胞在存在成血管細胞(VEGFR2+、CD31+、CD133/1+、CD117+)和休眠hHpSTC(⑶146-低、結蛋白和aSM)的情況時(圖1至圖3)，該細胞先體外後體內存 活在KM中的組織培養塑料上。hHpSC的集落由在它們的側邊界彼此緊密結合的細胞構成但 該細胞具有最小的培養皿本身貼附。然而，在集落的周邊(成血管細胞所處的位置)，hHpSC 貼附於培養皿上。因此，貼附或是單獨通過間充質伴胞(例如成血管細胞)來實現的，或是 通過與hHpSC結合而實現的。用於樽擬「天然」飼養細胞的飼養細胞系和原代飼養細胞 製備幾種形式的胚胎間充質細胞(原代培養物或細胞系)作為「天然」飼養細胞 (例如，成血管細胞和HpSTC)的模型。在KM內，在這些飼養細胞上培養hHpSC。儘管最小 化地暴露於血清對於阻止hHpSC的自發分化是必要的，但間充質飼養細胞需要來自血清的 因子來存活。為了克服這個技術困難，本發明人在培養基中接種了間充質飼養細胞的原種， 例如EGM-2(在轉換為無血清培養基(例如KM)之前補充2%血清)，以用於需要飼養細胞 和hHpSC的共培養物的分析。當hHpSTC被維持在無血清培養基內時(圖1-圖3)，發現hHpSTC是休眠的，表達 低水平的⑶146、結蛋白和α SMA。然而，一旦暴露於血清，即使在低血清水平(1_2% )或者 在血清中維持5天，如⑶146、結蛋白和α SMA的高水平所證實的(圖4)，也導致hHpSTC的 活化。hHpSTC暴露於血清也誘導胎肝細胞或免疫選擇細胞(S卩，本文下面討論的KDR+細胞 或⑶31+細胞)的原代培養物分化為hHpSTC。所測試的飼養細胞系是hMSC(圖5A)、hUVEC(圖5B)和鼠科動物胚基質細胞 (STO)，所述飼養細胞系通常用於培養基中ES細胞的維持。通過免疫選擇從16-20周齡的人 胎肝細胞的懸浮液來製備原代培養物。利用MACS來選擇表達KDR (也稱為flk-l/VEGFR2) 或⑶31(也稱為PECAM)的細胞或保持對於成纖維細胞呈陰性分類(negative sorting)從 而減少或消除基質細胞的細胞。整個肝臟分別包含0. 5% KDR+細胞和⑶31+細胞。這 些免疫選擇的細胞群在EGM-2培養基中培養。免疫選擇的KDR+細胞在培養基中迅速變化。在第一周內，細胞在形態上和抗原上 表現為成血管細胞或內皮細胞(圖3D)。然而，到第二周，HpSTC佔培養基的主要部分。實 際上，在11天時培養物匯合，並且大部分細胞對α SMA、hHpSTC的標記物呈陽性和對vWF、 內皮細胞的細胞內標記物呈陰性(圖5F和圖5H以及圖61和圖6K)。即使在接種前所述細 胞懸浮液被陰性分離以消除基質，仍觀察到同樣的現象(圖5C-圖5E以及圖5G)。在培養基中的第一個五天，⑶31+細胞在形態上表現為鋪路石樣細胞並且是vWF 陽性，這表明細胞是內皮細胞。然而，在培養5-7天後，肝星形細胞(高強度表達α SMA和 結蛋白)在培養皿中佔主要成分並且在9到10天時迅速達到匯合。該結果表明儘管EGM-2 是為內皮細胞特別設計的，然而EGM-2允許hHpSTC的生長。成血管細胞的飼養細胞上或hUVEC的飼養細胞上的hHpSC仍為幹細胞培養塑料上和KM內(其中成血管細胞和休眠HpSTC緊密結合)的hHpSC的分離 和克隆擴增導致細胞仍為具有最小分化的hHpSC (圖3)。在接種之後兩周可看到hHpSC集 落並且該集落對NCAM、EpCAM,結蛋白、CK19和CLDN-3呈陽性，但對AFP呈陰性。在KM內 和hUVEC頂部或KDR+飼養細胞上培養的hHpSC緊接在分選後還保持hHpSC為具有EpCAM+、 NCAM+、ICAM-1-、AFP-、CLDN-3+ 的抗原輪廓的幹細胞(圖 7B)。
在活化hHpSTC上培養的hHpSC導致hHpSC在幾小時內快速轉變為成肝細胞(圖 4)。在hMSC上、原代人胎肝基質細胞上、去成纖維細胞的原代人胎肝基質細胞上、原代 KDR+細胞上或者原代⑶31+細胞上培養的hHpSC在培養基中也在一周多後轉變至成肝細 胞。在與這些飼養細胞中的任何一種共培養8-9天之後，肝祖細胞集落形態包含穿插了清 晰的通道、假定的膽小管的帶狀結構(圖7和圖8)並且所述帶狀結構具有指示為成肝細胞 (EpCAM+,NCAM-, ICAM-I+, AFP+)的抗原輪廓(圖1)。此外，成肝細胞集落的形態更加呈三 維結構，導致當通過亮視野(圖7和圖8)評價時，成肝細胞集落髮生折射，這可能是由多層 細胞和/或細胞外基質累積所導致的。接種在STO飼養細胞上的hHpSC
導致最大分化的飼養細胞模擬系統被證明是STO飼養細胞。接種在這些飼養細胞 上的hHpSC顯著減緩它們的生長，並且從集落邊緣處產生成肝細胞和定向祖細胞。通過飼養細胞的基質分子的基因表汰選擇三種飼養細胞類型以代表以下三種飼養細胞維持hHpSC表型(hUVEC細 胞)；導致分化為成肝細胞(人胎肝間充質細胞和CD31+細胞的原代培養物)；或沿著肝細 胞途徑導向更高級的分化(培養一周以上的胎肝來源的內皮細胞，在hHpSTC是主要細胞群 時分析)。使用實時PCR，發現編碼纖連蛋白分子的I型組件的纖連蛋白mRNA是在所分析 的三種飼養細胞(尤其在hUVEC中)中最高表達的基質組分(圖9)。支持hHpSC表型維 持的hUVEC飼養細胞產生IV型膠原蛋白、層粘連蛋白(α4、β 和γ 鏈)且極少或者不 表達I型和III型膠原蛋白、不同於上面提及的那些層粘連蛋白鏈的亞型或者蛋白聚糖核 心蛋白質。誘導譜系限制為成肝細胞的那些細胞(人胎肝來源的α SMA+成纖維樣細胞和 ⑶31+細胞)產生I型、III型和IV型膠原蛋白、層粘連蛋白(β 、但不是V型膠原 膠原蛋白)、其他層粘連蛋白鏈或者所分析的蛋白聚糖核心蛋白質基因中的任何一種(磷 脂醯肌醇蛋白聚糖_3和磷脂醯肌醇蛋白聚糖_5和黏結蛋白聚糖-1和黏結蛋白聚糖_2)。通過飼養細胞的基質分子的蛋白質表達對飼養細胞進行以下七種不同的基質分子的免疫組織化學(IHC) 1型膠原蛋白、 III型膠原蛋白和IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白和硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HS-PG) (即，串珠蛋白聚糖和黏結蛋白聚糖)以及硫酸軟骨素蛋白聚糖(CS-PG)。所有飼養細胞 產生細胞外基質分子的混合物，但在成血管細胞/內皮細胞的原代培養物中發現了水平 最低的總基質分子產量；其次低的是在hUVEC細胞系或者hHpSTC已被培養選擇(culture select)的原代培養物。最高水平的基質分子是由STO細胞產生的。在所有飼養細胞中都 發現基底粘附分子、纖連蛋白並且在STO細胞中水平最高。感興趣的是，之前發現III型膠 原蛋白僅在STO細胞內表達，而通過RT-PCR在其他飼養細胞內發現了 III膠原蛋白。不受理論的約束或束縛，當在包含具有整聯蛋白α 4和整聯蛋白i3 6、IV型膠原蛋 白、CS-PG並且無HS-PG的層粘連蛋白形式的細胞外基質上培養hHpSC時，hHpSC保持它們 的表型。誘導譜系限制為成肝細胞的基質具有高水平的I型膠原蛋白、III型膠原蛋白和 IV型膠原蛋白、層粘連蛋白(無α4且β 亞型無增加)、CS-PG並且無HS-PG。最後，誘導 最顯著分化(即超過成肝細胞階段)的基質也具有所提到的所有基質組分但是水平高於在 其他飼養細胞中觀察到的水平。然而，這些基質均包含HS-PGS (圖11)。純化的基質分子對hHpSC和成肝細胞的影響
在KM內並在被塗覆在塑料培養皿上的以下5種基質組分的每一種上培養hHpSC 纖連蛋白、層粘連蛋白和I型膠原蛋白、III型膠原蛋白或IV型膠原蛋白。很少的hHpSC細 胞貼附在纖連蛋白上，並且那些貼附在纖連蛋白上的細胞不生長。如果在層粘連蛋白和/ 或IV型膠原蛋白上培養hHpSC或者如果在I型膠原蛋白凝膠的表面接種hHpSC，hHpSC譜 系限制為成肝細胞(圖10)。當hHpSC被嵌入I型膠原蛋白內時，hHpSC分化最大，且集落 的形態和抗原輪廓與成熟肝細胞的類似。在門管周帶(periportal zone)內和肝幹細胞龕內的基質組分不同於那些已發現 與成熟實質細胞相關的基質組分，並且誘導不同於人肝幹細胞/祖細胞的純化亞群的生物 響應。這些差別可能提供修飾細胞響應和激活動態表達的各種信號。通過確定不同類型的 細胞外基質組分怎樣在體內和體外誘導細胞活性，可在體外複製微環境以擴增和分化HpSC 群，用於患病組織的替代和恢復。除了基質蛋白質之外，飼養細胞被認為提供對於HpSC存活、繁殖和/或分化是必
需的可溶性因子(例如，細胞因子、生長因子)。相關因子 的非限制性實例列舉如下 間充質細胞,條件培養某對大鼠肝相細胞,(rter6)禾Π人肝母細胞,瘤(HePG2) MM落形成的影響rter6不能在惰性底物(例如塑料)上或在細胞外基質塗覆的平板上有效地生成集落，但當接種在STO飼養細胞上時，rter6可產生集落。因此，進行實驗來確定rter6細胞 在由STO飼養細胞為「條件」的培養基內可生長得怎樣好。為生成「條件」培養基，飼養細胞 (ST0細胞或人胎肺成纖維細胞系(MRC5))的原種在添加了血清的培養基中生長直到匯合， 漂洗以移除任何血清，並接著轉移至無血清的KM。細胞被允許在無血清培養基中生長另外 48小時，因此，用由所述飼養細胞產生的因子「調節」所述細胞。隨後在試驗中使用這種條 件培養基。與STO飼養細胞和STO條件培養基共培養10天的rter6細胞的集落數量與在KM 中培養的rter6細胞的集落數量相比增加2. 39倍(表4和表5)。當與MRC5飼養細胞和 STO條件培養基共培養10天時，rter6集落數量與在KM中培養的rter6細胞的集落數量相 比增加1. 57倍(表4和表5)。與STO飼養細胞相比，在無血清的HDM中，MRC5細胞表現出 促進更多的rter6細胞集落形成。在STO條件培養基中，rter6細胞在MRC5和STO兩種飼 養細胞上具有相似的集落形成能力。
人肝母細胞瘤0fepG2)細胞可在未塗覆的組織培養塑料上形成集落。來自四 種不同飼養細胞類型的無血清條件培養基被用於測試H印G2細胞的集落形成，所述四種不同飼養細胞類型為(I)STO細胞；(2)MRC5細胞；(3)無限增殖的成人肝星形細胞 (h-tert-HpSC)；以及(4)原代人胎肝來源的基質細胞。與HDM相比，無血清的STO條件培 養基增加H印G2細胞的集落形成，而以MRC5細胞、h-tert-HpSC或原代人胎肝來源的基質 細胞為條件的無血清培養基抑制HepG2細胞的集落形成。在來自STO細胞,、人胎肝細胞,和二者的共培養物的條件培養某h^ ELISA在以STO飼養細胞、人胎肝來源的祖細胞以及二者的共培養物為條件的培養基上 測試23個人細胞因子、17個小鼠細胞因子和2個非物種特異性細胞因子的濃度。對於人細 胞因子而言，與人胎肝來源的祖細胞單獨培養相比，在共培養中觀察到可溶性白介素-1受 體 α (IL-IRa)、白介素-Ια (IL-1 a )、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、巨噬細胞趨 化蛋白_2(MCP-2)、嗜酸性粒細胞趨化因子、可溶性腫瘤壞死因子受體-2(sTNF-R2)和正常 T細胞表達和分泌的活性調節蛋白(RANTES)的濃度的增加(圖12，表6)。在共培養中具有 降低濃度的細胞因子是白介素-11 (IL-Il)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨 噬細胞炎症蛋白質-I a (MIP-1 a ) ,MIP-I β、可溶性TNF受體1 (sTNF-Rl)以及肝細胞生長 因子(HGF)(圖12，表6)。
對於小鼠細胞因子而言，與ST0細胞單獨培養相比，在共培養中觀察到白介 素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL_6、IL-10、IL-11、IL-12、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、嗜酸性粒細胞趨化因子、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞炎症蛋白 質-la (10 -10)、幹擾素-￥ (IFN-y)和脂多糖誘導CXC趨化因子(LIX)的濃度增加(圖 13，表6)。在共培養中測試的任何所測試的小鼠細胞因子沒有顯著的濃度降低。對於非物種特異性細胞因子而言，與ST0細胞單獨培養(10. 2pg/ml)相比以及與 人胎肝來源的祖細胞單獨培養(22.3pg/ml)相比，在共培養(532.3pg/ml)中轉化生長因 子l(TGF-3 1)增加。當與ST0飼養細胞共培養時，發現人肝幹細胞分化為成肝細胞。在共培養物中的 人細胞因子和小鼠細胞因子的結合濃度(combined concentration)顯示，與人胎肝細胞單 獨培養相比，IL-4、IL-5、IL-10、CXC趨化因子、小鼠角化細胞源趨化因子(KC)和人IL-8、嗜 酸性粒細胞趨化因子、MCP-1和RANTES的蛋白質濃度顯著增加(彡5倍且> 50pg/ml)(表 6)。可溶t牛細胞』因子對reter6細胞』集落形成和HepG2細胞』集落形成的影口向九種已發現的細胞因子被分別地添加至無血清、激素限定培養基(HDM)中並被測 試。除了培養基之外，細胞在ST0飼養層上生長並培養10天。與對照組相比，白血病抑制因 子(LIF，0. 5ng/ml)、白介素-11 (IL-11，10ng/ml)和轉化生長因子-3 1 (TGF-3 1,0. 05ng/ ml)增加rter6細胞的集落數量和集落面積(圖14)。沒有觀察到白介素_6 (IL-6)、白介 素-13(IL_13)、肝細胞生長因子(HGF)、生長相關致癌基因-a (GR0-a )、巨噬細胞炎症蛋 白質-1 a (MIP-1 a )和腫瘤壞死因子- a (TNF- a )對rter6細胞的集落形成的影響。幾種細胞因子以及候選刺激分子也被分別添加入HDM和ST0條件培養基以測試它 們對H印G2細胞集落形成的影響。與對照組相比，在HDM和ST0條件培養基中，氫化可的松 增加集落形成25%。沒有觀察到胰島素樣生長因子-II (IGF-II)、白介素-6 (IL-6)、白介 素-ll(IL-ll)、白介素-13(IL_13)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)、生長相關致癌因子(GR0 ； CXC趨化因子)、人生長激素以及高密度脂蛋白對IfepG2細胞集落形成的影響。轉化生長因 子l(TGF-0 1)抑制H印G2細胞的生長和存活。表皮細胞生長因子(EGF)顯著降低H印G2 集落形成並且導致細胞從集落遷離。總之，本發明能夠在不存在飼養細胞的情況下使HpSC存活、繁殖和/或控制分化。 下表7列出了用於體外以及先體外後體內繁殖HpSC的「無飼養細胞」條件的非限制性實例。 所有的實例包括透明質酸，透明質酸普遍存在於體內肝臟的幹細胞龕內。目前認為，透明質 酸提高HpSC繁殖的效率。然而，這些實例不應被解釋為需要在體外培養HpSC時存在透明 質酸。參見，例如，2007年3月7日提交的美國臨時專利申請第60/893，277號，其所公開的 內容在此通過引用全部併入本文。
這樣，移植細胞避免了整個器官一起替換。而且，例如生物反應器的體外裝置可與 被包裹在適當細胞外基質和可溶性信號環境中的肝祖細胞一起被接種，因此肝祖細胞使裝 置分空間(subcompartment)群聚活組織結構。這樣，生物人工裝置可被用於藥理學研究、 疫苗研發以及作為器官衰竭和器官移植之間的橋梁。實際上，從這些研究中所得到的結果 表明，使用這些細胞可以是改善細胞資源局限性的途徑，細胞資源局限性目前抑制細胞療 法和生物反應器裝置治療選擇。雖然本發明已經描述了與其相關的特定具體實施方式
，將被理解的是，本發明能 夠被進一步修改並且本發明有意覆蓋任何變化、用途或者本發明的後續修改。總體上，本發 明的原則和對本發明公開的內容作的變更(如在本發明所屬的技術領域的公知或慣例範 圍內作的變更以及在可能被應用的必要特徵上作的變更)在上文中已闡述，所附的權利要 求的保護範圍如下所述。
28
權利要求
一種體外繁殖肝幹細胞而不誘導所述肝幹細胞的分化的方法，所述方法包括在無血清培養基中和基質組分層上培養分離的肝幹細胞的細胞群，所述基質組分選自透明質酸、其他未硫酸化的糖胺聚糖(GAG)或其他少量硫酸化的糖胺聚糖(GAG)、未硫酸化的蛋白聚糖或少量硫酸化的蛋白聚糖、胚膠原蛋白和胚基底粘附分子以及它們的組合物，其中，所述層基本不含成熟膠原蛋白，並且其中所述培養使肝幹細胞繁殖而不誘導它們的分化。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述基質組分中的任何一種或全部由成血管飼養 細胞、休眠肝星形飼養細胞、HUVEC飼養細胞或它們的組合提供。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述胚膠原蛋白是III型膠原蛋白。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述成熟膠原蛋白是I型膠原蛋白。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述基底粘附分子包含主要在胎兒組織中發現的 層粘連蛋白的亞型。
6.如權利要求1所述的方法，其中，除透明質酸外的所述GAG是硫酸軟骨素的形式。
7.如權利要求1所述的方法，其中，所述蛋白聚糖是硫酸軟骨素蛋白聚糖(CS-PG)的形式。
8.如權利要求1所述的方法，其中，所述肝幹細胞從胎兒肝臟、新生兒肝臟、兒童肝臟 或成人肝臟中獲得。
9.如權利要求8所述的方法，其中，所述肝臟是人的肝臟。
10.如權利要求5所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度為約0.1 u g/cm2至約 2 u g/cm2。
11.如權利要求10所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度為約lyg/cm2。
12.如權利要求3所述的方法，其中，所述III型膠原蛋白或IV型膠原蛋白各自的濃度 為約 0. 1 P g/cm2 至約 15 u g/cm2。
13.如權利要求1所述的方法，其中，所述層包含透明質酸。
14.一種在體外分化肝幹細胞為成肝細胞的方法，所述方法包括在無血清培養基中 和基質組分層上培養分離的肝幹細胞的細胞群，所述基質組分選自胚膠原蛋白、基底粘附 分子、CS-PG和它們的組合物，其中，所述層基本不含成熟的膠原蛋白，並且其中所述培養使所述肝幹細胞繁殖而不 誘導它們的分化。
15.如權利要求14所述的方法，其中，所述基質組分中的任何一種或全部由活化的內 皮細胞、活化的肝星形飼養細胞或它們兩者提供。
16.如權利要求14所述的方法，其中，所述胚膠原蛋白是IV型膠原蛋白。
17.如權利要求14所述的方法，其中，所述基底粘附分子包含層粘連蛋白的胎亞型。
18.如權利要求14所述的方法，其中，所述層還包含透明質酸。
19.如權利要求14所述的方法，其中，所述肝幹細胞從胎兒肝臟、新生兒肝臟、兒童肝 髒或成人肝臟中獲得。
20.如權利要求19所述的方法，其中，所述肝臟是人的肝臟。
21.一種在體外分化肝幹細胞或成肝細胞為定向肝祖細胞或膽祖細胞以及它們的後代 細胞的方法，所述方法包括在無血清培養基中和基質組分層上培養分離的肝幹細胞的細胞群，所述基質組分選自硫酸化蛋白聚糖、成熟膠原蛋白、纖連蛋白以及它們的組合物，並 且其中，所述培養誘導肝幹細胞或成肝細胞分化為定向肝祖細胞或膽祖細胞以及它們的 後代細胞。
22.如權利要求21所述的方法，其中，所述基質組分中的任何一種或全部由基質飼養 細胞、活化的肝星形飼養細胞、成肌纖維飼養細胞或它們的組合提供。
23.如權利要求21所述的方法，其中，所述成熟膠原蛋白是I型膠原蛋白。
24.如權利要求21所述的方法，其中，所述層基本不含透明質酸。
25.如權利要求21所述的方法，其中，所述肝幹細胞從胎兒肝臟、新生兒肝臟、兒童肝 髒或成人肝臟中獲得。
26.如權利要求25所述的方法，其中，所述肝臟是人的肝臟。
27.如權利要求21所述的方法，其中，所述硫酸化蛋白聚糖是硫酸乙醯肝素-PG或肝 素-PG，或者它們兩者。
28.一種用於肝祖細胞繁殖的容器，所述容器包括(a)容器，和(b)基質組分層，所述基質組分選自透明質酸、其他未硫酸化的糖胺聚糖(GAG)或其 他少量硫酸化的糖胺聚糖(GAG)、未硫酸化的蛋白聚糖或少量硫酸化的蛋白聚糖、胚膠原蛋 白和胚基底粘附分子以及它們的組合物；其中，所述層基本不含成熟膠原蛋白；並且其中，基質組分的所述層基本覆蓋所述容器的至少一個表面。
29.如權利要求1所述的容器，其中，所述容器是組織培養平板、生物反應器、實驗用細 胞或實驗用晶片。
30.一種用於肝祖細胞繁殖的容器，所述容器包括(a)容器，和(b)基質組分層，所述基質組分選自胚膠原蛋白、基底粘附分子、CS-PG以及它們的組 合物，其中，所述層基本不含成熟膠原蛋白；並且其中，基質組分的所述層基本覆蓋所述容器的至少一個表面。
31.一種用於肝祖細胞繁殖的容器，所述容器包括(a)容器，和(b)基質組分層，所述基質組分選自硫酸化蛋白聚糖、成熟膠原蛋白、纖連蛋白以及 它們的組合物，其中，基質組分的所述層基本覆蓋所述容器的至少一個表面。
全文摘要
本發明提供一種通過使用特定類型的間充質飼養細胞或由那些細胞產生的一種或一種以上旁分泌信號在體外控制肝祖細胞的生存、繁殖和/或分化的方法。
文檔編號C12N5/02GK101868533SQ200880102251
公開日2010年10月20日 申請日期2008年6月13日 優先權日2007年6月15日
發明者喬舒亞·烏羅尼斯, 蘭德爾·E·麥克萊蘭, 埃利亞內·沃蒂耶, 姚興磊, 洛拉·M·裡德 申請人:北卡羅來納大學查珀爾希爾分校