蝦青素的保存穩定性高的綠藻提取物的製作方法
2023-06-02 15:27:31
專利名稱：蝦青素的保存穩定性高的綠藻提取物的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有具有高保存穩定性的蝦青素的綠藻提取物。
背景技術：
已知蝦青素是紅色的類胡蘿蔔素的一種，具有很強的抗氧化作用。為此，作為魚類等的色染飼料、食用色素、化妝品、健康食品等使用。
蝦青素除了由化學合成，也來自天然產物。來自天然產物的蝦青素，例如可以從磷蝦、甜蝦等的蝦類、紅髮夫酵母、藻類等提取。但是，由於磷蝦、甜蝦、蟹等的甲殼類、紅髮夫酵母等的蝦青素含量低，從這些中提取蝦青素的收率非常低。為此，一般從蝦青素含量高的藻類、例如雨生紅球藻屬的綠藻中提取。
蝦青素對熱、氧、光等不穩定，不適合直接保存藻體的培養液。為此，通常將含有蝦青素的藻體以乾燥形態保存(例如，參考特開平7-8212號公報和特開2004-129504號公報)。但是，這些例如特開平7-8212號公報和特開2004-129504號公報中，沒有研究在乾燥時蝦青素本身對熱、氧、光的穩定性。例如，根據本發明人的研究，在使用特開2004-129504號公報中所記載的乾燥方法，僅使藻體乾燥的情況下，藻體中的蝦青素分解，蝦青素含量降低。
或者，蝦青素作為從藻體的提取物保存。由於蝦青素的不穩定性，其提取在藻體培養後馬上進行的情況居多(例如，參照特開平9-111139號公報和特開昭53-38653號公報)。從綠藻提取蝦青素，利用有機溶劑萃取法、超臨界萃取法等進行。
使用有機溶劑從雨生紅球藻類提取蝦青素時，提出使用乙醇、丙酮、或者己烷作為溶劑。將得到的提取物用作食品添加劑時，必須考慮提取物中殘留溶劑的濃度。另外，有在雨生紅球藻類培養液中混入營養源、化學藥品類、葉綠素類、磷脂類、固醇類等的問題(參照特開2004-41147號公報)。
特開2004-41147號公報中，以避免通過有機溶劑萃取法提取蝦青素的缺點為目的，研究了用超臨界萃取法提取蝦青素的方法。通過適當的選擇輔助溶劑，用超臨界萃取法提取的蝦青素中，幾乎沒有混入在使用有機溶劑萃取法時不可避免的上述磷脂、蛋白質、葉綠素、固醇等。但是，與有機溶劑萃取法相比，成本提高，不適用於工業生產。
而且，不論利用哪一種方法進行提取，由於蝦青素對熱、氧、光等不穩定，因此在以往的方法中，優選提取物在氮環境下、避光、低溫操作。
發明內容
本發明的目的在於提供一種提高綠藻提取物中的蝦青素的保存穩定性的方法，以及含有具有高保存穩定性的蝦青素的綠藻提取物。
本發明是基於發現通過在含有蝦青素的綠藻提取物中，調整以往認為是雜質的磷脂使之以適當的水平含有，可使蝦青素更加穩定化。
本發明提供一種綠藻提取物，含有換算成游離態(非酯化物)時濃度為0.5～20質量％的蝦青素和至少一種磷脂，該磷脂的濃度為0.1～15質量％。
在某實施方式中，上述磷脂的濃度為1質量％以上、2質量％以上或2.5質量％以上，或者上述磷脂的濃度為10質量％以下、7質量％以下、或5質量％以下。
在一個實施方式中，所述綠藻提取物為屬於雨生紅球藻屬的單細胞綠藻類的提取物。
在進一步的實施方式中，所述綠藻提取物為綠藻雨生紅球藻的提取物。
在其他的實施方式中，所述磷脂為磷脂醯膽鹼。
本發明還提供提高綠藻提取物中蝦青素的保存穩定性的方法，該方法包括綠藻提取物至少含有一種磷脂的測定工序；本來不含至少一種磷脂時，向該綠藻提取物中添加至少一種磷脂的工序；以及將綠藻提取物的磷脂濃度調整到0.1～15質量％的工序，其中，該綠藻提取物，含有換算成游離態時濃度為0.5～20質量％的蝦青素。
本發明還提供含有上述任意的綠藻提取物的食品。
發明效果根據本發明，通過調整含有一定濃度的蝦青素的綠藻提取物中的磷脂的量使之為一定的比例，就可以提高綠藻提取物中的蝦青素的保存穩定性。因此，可以將蝦青素作為提取物長期保存，由於沒有必要在低溫下保存，因此提取物的操作也變得容易。
圖1是表示在60℃保存一周後本發明的綠藻提取物中的蝦青素的殘存率和磷脂(卵磷脂)濃度的關係的圖。
圖2是表示在60℃保存一周後稀釋的本發明的綠藻提取物中的蝦青素的殘存率和磷脂(卵磷脂)濃度的關係的圖。
具體實施例方式
(綠藻)本發明使用的綠藻只要是有能力生產蝦青素的綠藻即可，沒有特別限制。例如，優選使用屬於雨生紅球藻(Haematococcus)屬的單細胞藻類。作為優選的綠藻，可以列舉雨生紅球藻(H.pluvialis)、湖泊紅球藻(H.lacustris)、兔球藻(H.capensis)、ヘマトコツカス·ドロエバケンシ(H.droebakensi)、ヘマトコツカス·ジンバブエンシス(H.zimbabwiensis)等。
作為雨生紅球藻(H.pluvialis)，可以列舉保藏在獨立行政法人國立環境研究所中的NIES144株、保藏於美國德克薩斯大學藻類保存設施中的UTEX 2505株，在丹麥的哥本哈根大學的Scandinavian CultureCenter for Algae and Protozoa，botanical Institute中保存的K0084株等。
作為湖泊紅球藻(H.lacustris)可以列舉保藏於ATCC的ATCC30402株和ATCC30453株，保藏於東京大學分子細胞生物學研究所的IAM C-392株、IAM C-393株、IAM C-394株和IAM C-339株或者UTEX 16株以及UTEX 294株等。
作為兔球藻(H.capensis)可以列舉UTEX LB 1023株等。
作為ヘマトコツカス·ドロエバケンシ(H.droebakensi)可以列舉UTEX 55株。
作為ヘマトコツカス·ジンバブエンシス(H.zimbabwiensis)，可以列舉UTEX LB 1758株等。
在本發明中優選使用雨生紅球藻。
(綠藻的培養)
含有蝦青素的綠藻，通過在能夠生產蝦青素的條件下培養上述綠藻而得到。蝦青素的生產條件沒有特別限制。例如，可以列舉在光照射下，不斷通入二氧化碳，在含有氮源和微量金屬類的培養基中使藻體的營養細胞增殖後，通過對增殖後的藻體單獨或組合施以由光照引起的物理應激、由營養飢餓引起的生物學應激、由於過氧化氫和/或鐵化合物的添加引起的化學物質應激等的應激，將營養細胞進行包囊化的方法。另外，也可以添加醋酸等作為碳源進行暗培養使之營養增殖，接著進行包囊化。培養的綠藻經離心分離而回收，根據需要水洗後提供給以下詳述的提取工序。
(綠藻提取物)本發明中的「綠藻提取物」是指上述綠藻中含有的油分，是沒有進行蝦青素的濃縮、提純的油分。這裡的濃縮、提純是指利用色譜法等本領域人員通常用於進行分離、提純的方法，從提取的油分中進一步選擇性地得到蝦青素。
提取含有蝦青素的油分的方法沒有特別的限制，可以使用本領域人員通常使用的方法。例如，對如上述培養的綠藻，(1)在通過機械破碎(例如，珠磨式等)進行破碎的同時或破碎後，經溶劑萃取，(2)在機械破碎後通過壓榨提取，以及(3)組合上述(1)和(2)來進行提取。或者，蝦青素也可以使用超臨界萃取法進行提取。作為在提取中使用的溶劑，可以列舉氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇等的有機溶劑。在提取中利用溶劑時，提取後，用本領域人員通常使用的方法除去溶劑。
在蝦青素的提取中一般使用的有機溶劑萃取中，蝦青素和藻體中存在的其他成分，例如中性脂質一起被萃取出來。得到的綠藻提取物中的蝦青素的濃度根據萃取溶劑的種類、萃取操作等而不同，通常換算成游離態時約為0.5～20質量％，更常見的為約0.5～18質量％。需要說明的是，綠藻提取物中的蝦青素根據培養條件，以蝦青素脂肪酸單酯為主要成分。在全部蝦青素中，蝦青素脂肪酸二酯的濃度為約15～約30質量％，游離的蝦青素濃度為1質量％以下的情況居多。蝦青素能以酯化物和游離態存在，如本發明所述，蝦青素質量的比例通過換算成游離態來表示。
(磷脂)在本發明中，磷脂是指選自磷脂醯膽鹼(卵磷脂)、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油和鞘磷脂中的一種以上的磷脂。這些的來源沒有特別的限定，既可以是來自天然產物，也可以是化學合成的。本發明中在添加以下說明的磷脂時，適合採用磷脂醯膽鹼(卵磷脂)。磷脂可以存在於藻體中，並與蝦青素一起被提取出來，或者也可以通過其他途徑向綠藻提取物中添加。
(提高綠藻提取物中的蝦青素的保存穩定性)本發明中提高綠藻提取物中的蝦青素的保存穩定性的方法，包括綠藻提取物至少含有一種磷脂的測定工序；本來不含至少一種磷脂時，向該綠藻提取物中添加至少一種磷脂的工序；以及將該綠藻提取物中的磷脂濃度調整到0.1～15質量％的工序。
本發明的綠藻提取物中調整的磷脂的濃度為0.1質量％以上、通常為0.2質量％以上、優選為0.3質量％以上、進一步優選為0.45質量％以上、更優選為1質量％以上、更加優選為2質量％以上、進一步更優選為2.5質量％以上、或者調整的磷脂的濃度為15質量％以下、優選為10質量％以下、更優選為7質量％以下、更加優選為5質量％以下。綠藻提取物中的磷脂的比例(或者是濃度)過高時，在低溫下提取物中有產生沉澱的情況，因此不優選。
磷脂的濃度調整好的綠藻提取物中的蝦青素的濃度換算成游離態時為0.5質量％以上、優選為2質量％以上、更優選為3質量％以上、進一步優選為5質量％以上、更加進一步優選為7質量％以上，或者為約18質量％以下、優選為15質量％以下、更優選為12質量％以下。
綠藻提取物中的蝦青素(換算成游離態)和磷脂的比例以質量比計為1∶30～1∶0.005，優選為1∶5～1∶0.05、更優選為1∶3～1∶0.1。
經超臨界萃取法得到的綠藻提取物中，幾乎不含有磷脂。為此，通過向綠藻提取物中添加適量的磷脂，調整磷脂的比例。另一方面，經溶劑萃取得到的綠藻提取物，由於在綠藻中存在的磷脂可以與蝦青素一起被萃取出來，含有磷脂的情況居多。因此，根據向綠藻提取物中預先含有磷脂的量(或者濃度)，適當決定應當添加的磷脂的量。在任何一種情況中，調整最終的磷脂的比例使之在上述範圍內。本發明中確認的綠藻提取物中的磷脂的濃度為適宜的情況也包含在磷脂比例的調整中。因此，也可以通過適宜選擇萃取溶劑，得到分別以本發明所期望的濃度含有蝦青素和磷脂的綠藻提取物。
為了增加經溶劑萃取得到的綠藻提取物中含有的磷脂的濃度，優選在溶劑中將藻體破碎成更小。通過在溶劑中將藻體破碎得更細小，構成細胞膜的磷脂變得更容易萃取。藻體的破碎可以使用珠磨機、均質機等裝置。萃取使用的溶劑優選單獨使用乙醇，或者組合使用乙醇和其以外的有機溶劑。
根據本發明如上所述的方法，可以得到含有具有高保存穩定性的蝦青素的綠藻提取物。該綠藻提取物在60℃、避光下保存一周時，該綠藻提取物中的蝦青素至少可以殘存為初期濃度的50％、優選為75％、更優選至少為80％，更加優選至少為85％，進一步優選至少為90％。這樣，適當調整了磷脂的濃度的綠藻提取物，抑制了對熱不穩定的蝦青素的分解，提高綠藻提取物的保存穩定性。
磷脂不僅是生物體的成分，而且是作為食品添加劑、乳化劑以及食品使用的物質。為此，即使綠藻提取物中存在一種以上的磷脂，也沒有特別的問題，保存後也可以不除去磷脂。
(含有綠藻提取物的食品，該綠藻提取物含有具有高保存穩定性的蝦青素)本發明的食品，含有將磷脂的濃度調整至一定範圍的綠藻提取物。這樣的綠藻提取物，可以直接作為食品而攝取，或者例如可以用適當的植物油等稀釋成為含有一定的濃度的蝦青素的食品，以使作為食品的攝取量容易調節。這時，也可以進一步添加磷脂，提高蝦青素的保存穩定性。可以適宜地將保存穩定性提高的綠藻提取物直接或稀釋後加工成膠囊劑的形態。或者，使綠藻提取物與乳化劑或增溶劑一起分散或溶解於水溶液中，可以作為飲料提供。
實施例以下列舉使用雨生紅球藻K0084株的實施例說明本發明，但本發明不被本實施例所限制。需要說明的是，在本實施例中，蝦青素量、磷脂量、和水分量用以下的方法測定。
(蝦青素量的測定)綠藻提取物中的蝦青素量，用以下的方法測定。首先，將規定量的綠藻提取物用DMSO進行適當稀釋之後，在492nm下測定吸光度，用以下的式子求出稀釋液中的蝦青素濃度(換算成游離態)，從該值求出稀釋前的提取物中的蝦青素濃度。
蝦青素濃度(質量％)＝(A*100*F)/(W*2085)這裡，A為稀釋液在492nm下的吸光度(光路長1cm)、F為稀釋液的稀釋倍數、以及W為稀釋液的質量(g)。
(磷脂(卵磷脂)量的測定)利用對磷定量時一般所使用的鉬藍法(例如，《衛生試驗法·註解2005》(日本藥學會編，金原出版)中記載的用磷鉬酸的磷定量法)得到的測定值(磷量)，乘以26.03後得到值作為卵磷脂量。
(水分量的測定)水分量利用常壓乾燥法(例如，《食品衛生檢查指南理化學編》(厚生勞動省主編，社團法人日本食品衛生協會，2005年)中記載)測定。亦即，將稱量容器和蓋子一起放入調節至一定溫度的恆溫乾燥機中，加熱1小時後移入乾燥器中。放冷，當稱量容器的溫度達到室溫後，直接稱重至0.1mg單位。反覆進行加熱、放冷、和稱重的操作，直到達到恆重(W0g)。接著，迅速取試樣1～2g，鋪平於稱量容器上，蓋上蓋子，準確稱重(W1g)。錯開蓋子將稱量容器放入恆溫乾燥機中。恆溫乾燥機達到105℃之後，乾燥3小時，在乾燥機中迅速將稱量容器蓋上蓋子，移入乾燥器中放冷。達到室溫之後，直接稱重(W2g)。試樣中的含水量用以下的式子求出。
試樣中的水分(％)＝(W1-W2)/(W1-W0)×100實施例1綠藻提取物的製備-1使用生產蝦青素的雨生紅球藻K0084株(以下，僅稱為K0084株)。在1.5L容積的光徑為25mm的密閉式扁平培養瓶中，如下表1所示加入具有成分的MBG-11培養基1L，接種K0084株到培養基中使初始濃度達到0.6g/L。
表1
以600ml/分鐘的速度(即，以0.6vvm)通入含有3體積％CO2的氣體，培養溫度為25℃，pH調整為6～8之間，在以下所示的光照條件下培養K0084株5天。光照使用白色螢光燈(松下電器產業株式會社制，FL40SSW/37)作為光源。調整光照強度，使之用LICOR-190SA平面光量子感測器測定培養槽的受光方向的光合成有效光量子流密度(PPFD)為100μmol-p/m2s。培養後的K0084株，由綠色變為茶色～茶褐色，確認K0084株已經包囊化。
接著，向和上述同樣的扁平培養瓶中加入相同培養基(MBG-11培養基)，初始濃度為0.6g/L，接種包囊化後的K0084株，在和上述相同的培養條件下培養200小時。
將得到的綠藻經離心回收，水洗，放入珠磨機。加入己烷，用珠磨機破碎5分鐘。這樣，通過在溶劑中將綠藻破碎變小，作為細胞膜成分的卵磷脂被更多的提取出來。將得到的混合物用離心機分為上清和沉澱，回收上清。向沉澱中再次加入己烷，反覆和上述同樣的操作，直至沉澱的顏色幾乎完全變為白色。將回收後的己烷相合併，蒸餾除去己烷，得到綠藻提取物。得到的綠藻提取物中的蝦青素的濃度換算成游離態為9質量％，磷脂濃度為0.9質量％，水分量為0.2質量％。
實施例2磷脂含有量的研究-1向上述實施例1中得到的綠藻提取物(磷脂0.9質量％，蝦青素9質量％)中，分別添加磷脂(來自大豆卵磷脂、和光純藥工業株式會社制)至濃度為2.7質量％、4.5質量％、10質量％、和15質量％，製備試樣。將各試樣各約500mg分別裝入2個10ml容積的管形瓶，如上述測定蝦青素的初期濃度。接著，將上述放入設定為60℃的恆溫器中。保存一周後，再次測定蝦青素的濃度，算出殘存率。結果如圖1所示。
由圖1可知，當綠藻提取物以2.7質量％的比例含有磷脂時，即使在60℃的嚴酷條件下保存1周，仍有90％的蝦青素殘存，當綠藻提取物以0.9質量％的比例含有磷脂時，至少有75％的蝦青素殘存。特別地，可知向綠藻提取物中追加磷脂的情況下，蝦青素的殘存率非常高。
實施例3磷脂含有量的研究-2將上述實施例1得到的綠藻提取物的一部分用大豆油(日清奧利友株式會社制)稀釋至2倍，得到換算成游離態以4.5質量％的濃度含有蝦青素的稀釋提取物。向稀釋後的綠藻提取物(磷脂0.45質量％)中分別添加磷脂(來自大豆卵磷脂，和光純藥工業株式會社制)至濃度為0.9質量％、2.7質量％、4.5質量％、10質量％、和15質量％，製備試樣。另外，將上述實施例1得到的綠藻提取物的一部分用大豆油稀釋至3倍和9倍，得到各自的磷脂濃度為0.3質量％(蝦青素3質量％)、和0.1質量％(蝦青素1質量％)的稀釋提取物。將各試樣各約500mg分別裝入2個10ml容積的管形瓶，如上述測定蝦青素的初期濃度。接著，將上述放入設定為60℃的恆溫器中。保存一周後，再次測定蝦青素的濃度，算出殘存率。結果如圖2所示。
由圖2可知，當綠藻提取物以0.45質量％的比例含有磷脂時，即使在60℃的嚴酷的條件下保存1周，仍有約80％以上的蝦青素殘存。另一方面，磷脂濃度越低，蝦青素的殘存率越低。需要說明的是，對換算成游離態以12質量％的比例含有蝦青素的綠藻提取物進行同樣的試驗時，得到同樣的結果。
比較例1對不含磷脂的試樣中的蝦青素穩定性的研究將經過和上述實施例1同樣的操作培養得到的包囊化的K0084株，經離心回收。將5g乾燥藻體和等量的硅藻土混合，用乳缽破碎，用超臨界CO2萃取裝置Spe-ed SFE(朝日ライフサイエンス株式會社)進行超臨界萃取。萃取在壓力為400bar，萃取溫度為50℃，二氧化碳流量為1L/分鐘下供給CO2。得到的超臨界萃取物中的蝦青素的濃度換算成游離態為30質量％，磷脂濃度在檢測限(0.01質量％)以下。
將得到的超臨界萃取物各約500mg分別裝入2個10ml容積的管形瓶，如上述測定蝦青素的初期濃度。接著，將上述放入設定為60℃的恆溫器中。保存一周後，再次測定蝦青素的濃度。其結果可知，蝦青素的殘存率為0.2％，該提取物中蝦青素的穩定性非常差。
實施例4對於UV照射穩定性的研究將上述得到的綠藻提取物的一部分用橄欖油(日清奧利友株式會社制)稀釋至2倍，得到含有換算成游離態時濃度為4.5質量％的蝦青素的稀釋提取物。向綠藻提取物(磷脂0.9質量％，蝦青素9質量％)和稀釋提取物(磷脂0.45質量％，蝦青素4.5質量％)中各加入磷脂至其濃度為0.9質量％、2.7質量％、4.5質量％、10質量％、和15質量％，製備試樣。將各試樣各約500mg分別裝入2個10ml容積的管形瓶。接著，將這些管形瓶放在UV照射裝置(臺式照射裝置DT-35LPアト一株式會社制)上，在365nm下照射一周。保存一周後，測定蝦青素的濃度。其結果可知，在添加磷脂的情況下蝦青素的殘存率都高(殘存為約80％以上)，顯示出與上述實施例2和3同樣的趨勢。
實施例5綠藻提取物的製備-2除了使用乙醇代替己烷作為萃取溶劑，進行與和上述實施例1同樣的操作，得到綠藻提取物。得到的綠藻提取物中的蝦青素濃度換算成游離態為8.1質量％，磷脂濃度為1.7質量％，水分量為0.3質量％。接著，放入設定為60℃的恆溫器中保存一周後，再次測定蝦青素的濃度。其結果可知，蝦青素的殘存率高(85％)。
產業上的利用可能性根據本發明，可以提供一種通過將綠藻提取物中的磷脂的濃度調整到特定的水平而含有具有高保存穩定性的蝦青素的綠藻提取物。因此，蝦青素作為提取物可以長期保存，由於沒有必要在低溫下保存，因此操作也變得容易。
權利要求
1.一種綠藻提取物，含有換算成游離態時濃度為0.5～20質量％的蝦青素和至少一種磷脂，該磷脂的濃度為0.1～15質量％。
2.如權利要求1所述的綠藻提取物，其中，所述磷脂的濃度為1質量％以上。
3.如權利要求2所述的綠藻提取物，其中，所述磷脂的濃度為2質量％以上。
4.如權利要求3所述的綠藻提取物，其中，所述磷脂的濃度為2.5質量％以上。
5.如權利要求1～4中任一項所述的綠藻提取物，其中，所述磷脂的濃度為10質量％以下。
6.如權利要求5所述的綠藻提取物，其中，所述磷脂的濃度為7質量％以下。
7.如權利要求6所述的綠藻提取物，其中，所述磷脂的濃度為5質量％以下。
8.如權利要求1～7中任一項所述的綠藻提取物，是屬於雨生紅球藻屬的單細胞綠藻類的提取物。
9.如權利要求8所述的綠藻提取物，為綠藻雨生紅球藻的提取物。
10.如權利要求1～9中任一項所述的綠藻提取物，其中，所述磷脂為磷脂醯膽鹼。
11.一種提高綠藻提取物中的蝦青素保存穩定性的方法，包括綠藻提取物至少含有一種磷脂的測定工序；本來不含至少一種磷脂時，向該綠藻提取物中添加至少一種磷脂的工序；以及將該綠藻提取物的磷脂濃度調整到0.1～15質量％的工序，其中，該綠藻提取物含有換算成游離態時濃度為0.5～20質量％的蝦青素。
12.一種含有如權利要求1～10中任一項所述的綠藻提取物的食品。
全文摘要
本發明提供一種提高綠藻提取物中的蝦青素保存穩定性的方法，以及含有具有高保存穩定性的蝦青素的綠藻提取物。本發明提供一種綠藻提取物，含有換算成游離態時濃度為0.5～20質量％的蝦青素和濃度為0.1～15質量％的至少一種磷脂。上述綠藻提取物，其中蝦青素的保存穩定性高，即使在60℃保存一周後，仍有約80％以上的蝦青素可以殘存。
文檔編號C07C403/00GK101023966SQ200710005810
公開日2007年8月29日 申請日期2007年2月25日 優先權日2006年2月21日
發明者村神渚, 石倉正治 申請人:山葉發動機株式會社