耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因及其編碼的多肽和製備方法

2023-06-02 15:24:21

專利名稱：耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因及其編碼的多肽和製備方法
技術領域：
本發明涉及突變或遺傳工程，尤其涉及一種耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因及編碼的多肽和製備方法。
背景技術：
酪氨醯tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase)是一個典型的半位點激活蛋白酶(half-of-the-sites activity)。這個蛋白酶是一個對稱的二聚物，它由可鑑別的亞基組成，每個都有一個完全的激活位點。酪氨醯tRNA合成酶的功能是將酪氨酸與相應的tRNA連接活化成為酪氨醯tRNA。
酪氨醯tRNA的氨醯化包括兩個步驟首先，酪氨酸和ATP反應，在釋放焦磷酸鹽的同時生成一個中介蛋白酶--酪氨醯苷酸；然後，在酶的作用下，酪氨醯苷酸反應生成酪氨醯tRNA以及一個AMP。
根據簡訊號序列的不同，tRNA合成酶可以分為兩個不同的類型Class I以及Class II。CLASS I通常是單體酶，由20個基本胺基酸中的10個胺基酸組成。它們的alpha-羧基團連結到tRNA分子中腺嘌呤的2′氫氧基上；CLASS II通常是二聚的或者四聚的蛋白酶，而且由20個胺基酸中的另外10個組成，它們把胺基酸連結到tRNA分子的3′氫氧基上。兩種類型在胺基酸激活區域上也是不同的。CLASS I有一個平行的beta區域，CLASS II則相反。
酪氨醯tRNA合成酶屬於Class I而且是一個有47個亞基的二聚體。氨基末端有320個殘基用於活化反應中，然而羧基末端，99個殘基用於tRNA的限定以及酪氨醯tRNA的形成。包括了限制性酪氨酸-AMP的合成酶晶體結構已經被精確測定。這個活性的中介蛋白酶在匹配tRNA的缺乏情況下仍穩定，而且被12個氫鍵限定。
每個蛋白酶的單體有三個區域一個包含6個beta摺疊的alphs/beta區域(殘基1-220)；一個alpha-螺旋的區域(殘基248-318)；一個不規則c′末端區域(殘基319-418)。這個n-末端的319殘基在激活反應來具有首要的作用，而不規則c′末端區域則在tRNA限定中具有作用。酪氨醯tRNA合成酶的結構決定於酪氨酸和酪氨醯苷酸的聯合體中。這個結構包含了一個典型的RossmanFold核苷粘合物區域，這個區域包括了中軸的5-單鏈平行的beta-摺疊，而且酪氨醯tRNA合成酶是這個摺疊末端的粘合物。
細菌的酪氨醯tRNA合成酶，擁有一個靈活連接的C′末端區域，大約80個殘基，這些使蛋白酶的晶體結構混亂。在2.0絕對條件下，已經測定了晶體形態的嗜熱喜熱酪氨醯tRNA合成酶的結構，其中c-末端區域被排序而且發現50個殘基的摺疊與核糖體蛋白S4的部分的c-末端區域是一樣的。也已經鑑定了在2.8絕對條件下的嗜惹喜熱的酪氨醯tRNA合成酶以及轉運酪氨酸的聯合物的晶體結構。在這個結構中，c-末端區域限定於反密碼子的長臂和DNA的不穩定長臂。而且，tRNA交叉限定於二聚酶的兩個亞基，同時顯著限定了class I酪氨醯tRNA合成酶的識別模型於它的同類tRNA相似物classII合成酶。
由1269個鹼基對組成的大腸桿菌酪氨醯tRNA合成酶基因的結構，已經完全測序。這個基因有一個密碼子轉運模型，這個模型是典型的高度表達蛋白而且與其他大腸桿菌中胺基酸轉運合成酶的基因相同。縮氨酸的純化以及排列已經應用於定位N-末端和95％的轉運蛋白序列的確定。後者產出47，403兆拉德(Mr of 47，403)的大腸桿菌酪氨醯tRNA合成酶，而且揭示出與來自於杆狀菌staerothermophilus的類比蛋白酶的初級結構有高度相似性。杆狀菌staerothermophilus中酪氨醯tRNA合成酶的基本結構已經從克隆基因的核苷序列，以及純化蛋白酶的胺基酸肽鏈序列中推斷出來。此酶有分子量為47316的分子以及與大腸桿菌中酪氨醯tRNA合成酶有56％的相同。酪氨酸醯苷的粘合區域，可以定位於部分多肽鏈的N-末端，而且可以在兩種蛋白酶中高度的保存。
騰衝嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)，是生活在我國雲南省騰衝縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細菌(eubacteria)，最適生長溫度為75攝氏度，厭氧生長，革蘭氏染色反應呈陽性。它由中國科學院微生物所首先發現並進行了分類學上的分析。菌種保存在中國微生物保存中心MB4T(Chinese collection of microorganisms AS l.2430T＝JCM 11007T)。該嗜熱厭氧菌是我國特有的一個物種，其體內所具有的耐高溫酪氨醯tRNA合成酶也具有自己特有的結構。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種分離的，編碼具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽的核苷酸序列。
本發明的目的之二是提供一種分離的具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性多肽。
本發明的另一目的還提供了嗜熱厭氧菌的酪氨醯tRNA合成酶重組載體、含有重組載體的宿主細胞，以及製備蛋白的方法。
本發明一方面提供一種能編碼具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽的核苷酸序列。所說的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2中的胺基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與酪氨醯tRNA合成酶相關。核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無義、插入、錯義。
本發明另一方面提供了一種耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽。該多肽具有SEQ ID No.2中的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
本發明還提供了一種製備耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的方法，它包括以下步驟1)分離出編碼耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的核苷酸序列SEQ ID NO.1；2)構建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的重組細胞；4)培養步驟3)中的重組細胞；5)分離、純化得到耐高溫酪氨醯tRNA合成酶。
本發明涉及嗜熱厭氧菌的耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因的分離及表達。以騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析為基礎，克隆分離了耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因。該基因對於製備用於生產耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的轉基因微生物或動植物，並回收穫得該基因編碼的酶有用。另外，本發明還提供了具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽的胺基酸序列及功能等同體。同時，本發明還提供了製備，分離，純化具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽的方法。


圖1是測序文庫構建步驟流程圖；圖2是測序與數據分析流程圖。
具體實施例方式
本發明提供了分離的，編碼耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，該核苷酸分子是通過對騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析而獲得的，具有SEQ.ID NO.1的核苷酸序列，它編碼具有406胺基酸的多肽，該多肽推測分子量為46684道爾頓。
本發明還提供了一種重組載體，該載體包含本發明的分離的核苷酸分子，以及包含有重組載體的宿主細胞。同時，本發明包括構建該重組載體和宿主細胞的方法，以及用重組工程技術生產耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的方法。
本發明進一步地提供了一種分離的耐高溫酪氨醯tRNA合成酶或多肽，它具有SEQ.ID NO.2胺基酸序列，或至少70％相似，更佳地，至少具有90％，95％，99％的相同。
在本發明中，「分離的」DNA是指該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，「耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因」指編碼具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ.ID NO.1的核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指該序列中有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於公知的密碼子的簡併性，所以與SEQ IDNO.1核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的胺基酸序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳地在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
在本發明中，「分離的」蛋白的多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析，PAGE或HPLC法測量多肽的純度。分離的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組份。
在本發明中，「耐高溫酪氨醯tRNA合成酶」指具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括SEQ ID NO.2序列的變異體，這些變異體具有與天然耐高溫酪氨醯tRNA合成酶相同的功能。這些變異體包括(但不限於)若干個胺基酸的缺失，插入和/或取代，以及在C末段和/或N末端添加一個或數個胺基酸，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，為本領域所公知的，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末段和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的活性片段和活性衍生物。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒，粘粒，噬菌體及反轉錄病毒等。在生產本發明的耐高溫酪氨醯tRNA合成酶時，可以將耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因序列與表達調控序列相連，從而形成耐高溫酪氨醯tRNA合成酶表達載體。表達載體含有複製起始點和表達調控序列，啟動子，增強子和必要的加工信息位點。表達載體還必須含有可供選擇的標記基因，如a)提供對抗生素或其它毒性物質(氨苄青黴素，卡那黴素，氨甲蝶呤等)的抗性的蛋白質或b)互補營養缺陷型蛋白質或c)提供複合培養基中沒有的必需營養成分的蛋白質。各種不同宿主的合適標記基因是本領域中所熟知或生產廠商說明書註明的。這些表達載體可以用本領域技術人員公知的重組DNA技術製備，如可參考Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1992。
重組表達載體可以用本領域熟知的方法引入宿主細胞，這些方法包括電轉化法，氯化鈣法，基因槍法等。將外源重組載體導入宿主細胞的過程稱為「轉化」。通過培養宿主細胞，誘導所需蛋白的表達，並通過本領域所熟知的蛋白分離技術，如柱層析等得到所需的蛋白質。也可採用固相技術等人工合成該蛋白質。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核細胞如大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核細胞如酵母細胞，或各種動植物細胞。本發明的耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因全長序列或其片段通常可以用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增法，重組法，或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，用本領域技術人員已知的常規方法製備的嗜熱厭氧菌全基因組DNA為模板，擴增而得到有關序列。一旦獲得了有關序列，就可以將其克隆入有關載體，再轉入宿主細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到大批量的有關序列。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1構建測序文庫測序文庫的構建採用全基因組霰彈法(shotgun)進行。首先培養騰衝嗜熱厭氧菌，培養方法按(Yanfen Xue，2000)改進的MB培養基(Balch et al.，1979)，按Marmur(1961)方法收集細菌，提取總DNA。為了保證測序文庫構建的隨機性，最大程度地避免產生斷裂熱點的問題，採用多種方法、不同條件的建庫原則。先採用物理剪切方法(包括超聲波法及用Hydroshear Machine進行剪切)，其次根據該菌基因組特徵選用AluI進行隨機部分酶切。物理剪切時採用不同強度處理樣品，酶切時通過設置酶量梯度處理樣品。處理後的樣品經平末端處理後，採用電泳分部收集1.5-4kb DNA片段，與去磷酸化的經SmaI酶切的pUC18進行連接，連接產物通過電轉化E.coli DH5α構建了隨機測序的文庫。同時，為了便於以後重疊群(contig)的搭接還構建了長插入片段(10kb左右)的測序文庫(將基因組DNA以Sau3AI隨機部分酶切，電泳收集10kb左右的片段，與去磷酸化的經BamHI酶切的pUC18進行連接、構建文庫)。該文庫經兩個末端的測序在完成圖(finishing)的過程中可以得到contig之間的關係，並可以解決較大的洞(gap)對補洞造成的困難。建庫流程如(見圖1)。
實施例2基因組測序在完成騰衝嗜熱厭氧菌基因組的測序時，主要使用了兩種全自動測序儀ABI377和MegaBACE 1000。這兩種測序儀都是利用電泳原理進行測序(見圖2)，每次可完成96個樣品。ABI377是PE公司的產品，是ABI系列的一種。它屬於平板凝膠電泳測序儀。MegaBACE 1000是法瑪西亞公司的產品，屬於毛細管凝膠電泳測序儀。
實施例3Basecalling和測序質量監控所謂Basecalling是指從測序儀上得到的原始數據文件中得到正確的鹼基序列的過程。由於測序儀上得到的是A，T，G，C四種鹼基對應的不同波長的光的強度變化軌跡(trace)，需要用計算機採取一定的算法從中正確識別出不同的軌跡對應的鹼基。我們使用的是Phred軟體(Ewing B，Hillier L，1998)，原因是其結果更可靠，並且其結果輸出更便於同一軟體包中的其他程序進行進一步的分析。
Phred進行Basecalling的算法原理，是根據軌跡中各個峰的形狀，間距，以及信噪比等因素，判斷鹼基類型，同時對這個鹼基給出可信度信息，即鹼基的測序質量。在大規模測序中，測序質量的監控是十分重要的，它直接影響對測序的決策，包括文庫的構建，覆蓋率的大小。同時對測序實驗中可能出現的失誤能及時反饋。
實施例4序列拼接所謂序列拼接，就是把全基因組霰彈法，又稱鳥槍法隨機測序得到的樣品序列組裝成連續的重疊群(contig)，主要利用它們之間的重疊序列作參考。考慮到測序中存在載體的影響，需要先對樣品序列進行去載體處理。這裡所用的軟體cross_match和後面拼接所用的軟體Phrap都是美國Washington大學的軟體(Gordon D，Abajian C，1998)，其基本原理為Swith-Waterman算法(Waterman MS，1990)。這是一種動態算法，在考慮了兩兩序列之間的比較之後，可以得到一組序列的公有序列(consensus sequence)。去除載體後的樣品序列再用Phrap進行拼接。在拼接時，鹼基的測序質量也被考慮了，所得到的公有序列各鹼基的可信度，由組成該公有序列的樣品的測序質量計算得到。
實施例5基因注釋在大體得到基因組的大部分序列(完成工作框架圖)後，就需要對基因組進行注釋，包括進行開讀框架(Open Reading Frame，ORF)的預測，基因功能的預測，以及特殊RNA片段的分析等。
第一步採用預設參數的GLIMMER2.0(Delcher，A.L.，Harmon，D.1999)和ORPHEUS(Frishman，D.1998)軟體預測基因編碼序列，然後所有預測的開讀框和非編碼區(intergenic region)都用BLAST軟體(Altschul，S.F.et al.1997)與NCBI的無冗餘蛋白資料庫(non-redundant protein database)比較來發現可能漏掉的基因。在判斷一個基因的起始點時，將參考各種相關信息，如序列同源性，核糖體結合位點，可能的信號肽序列和啟動子序列等。如果在一個開讀框內出現多個啟動子時，一般採用第一個啟動子作為基因的起始點。採用TransTerm軟體(Ermolaeva，M.D.2000)在非編碼區預測不依賴於Rho(ρ)因子的轉錄終止子。如果該終止子位於一個基因的下遊區的太遠處，則可能暗示一個小基因的丟失或測序錯誤人為地縮短了該基因，可作為進一步分析的參考。在確定移框突變和點突變時，主要根據與資料庫中的蛋白質的相似性來判斷。如果出現一個蛋白質對應於兩個彼此相鄰的編碼序列的情況，則被認為是一個無活性基因(假基因pseudogenes)，因為這說明這兩個編碼序列之間由於突變而產生異常中止現象，進而使基因失去活性。所有分析結果再用Artemis sequence viewer軟體(Rutherford，K.et al.2000)進行手工分析。一些明顯與其它編碼序列有重疊的開讀框，長度小於150鹼基對並且在已有資料庫中沒有同源性和其中沒有明顯的啟動子或終止區域的開讀框將被去除。
蛋白質的功能片段(motif)和功能區域(domain)分別採用與Pfam、PRINTS、PROSITE、ProDom和SMART資料庫進行比對分析，結果再用InterPro資料庫(Apweiler，R.et al.2001)進行匯總分析。根據NCBI的COGs資料庫(Tatusov，R.L.et al.2001)並且參照其他資料庫的查詢結果來確定蛋白質在COGs分類中的功能分類和可能的代謝途徑。用TMHMM軟體(Krogh，A.et al.2001)來確認膜蛋白、ABC轉運蛋白和跨膜功能域。採用革蘭氏陰性菌為參數，用SIGNALP2.0軟體(Nielsen，H.et al.1999)分析信號肽區域。(4)補洞在完成基因組的工作框架圖之後，就要進行更加困難的補洞工作，即完成整個基因組100％的測序，得到一個環形基因組。主要工作就是把前面得到的contig連接起來。主要方法包括A.利用測序中的正反向測序樣品信息在測序過程中，我們有意對某些樣品進行了雙向測序，即同時測序某個插入片段的兩端，再將所得序列與其他序列一起進行拼接。由於這一對序列在基因組上的關係一定，其之間的距離大致已知，根據這一信息，一可以確認某段contig是否可靠，二是當這一對序列分別位於不同的contig上時，可以確定這兩個contig的方向關係和位置關係，為進一步設計實驗提供參考。
B.長插入片段及Cosmid末端測序基於同樣的原理，我們可以構建不同長度的插入片段文庫，只對其兩端測序，然後拼接，分析其具體位置。這些文庫包括長度為9-12Kb的長插入片段庫和20-40Kb左右的Cosmid文庫。具體分析方法同上所述。
C. PCR和末端延伸Walking實驗根據A和B所提供的contig方向和位置關係，進一步的生物化學實驗就可以進行了。如設計一對引物進行PCR擴增，或以某一contig末端序列合成引物進行末端延伸(Walking)來補洞等。
實施例6酪氨醯tRNA合成酶的製備和提純根據實施例中基因注釋得到的酪氨醯tRNA合成酶全長編碼序列(SEQ IDNO.1)，設計能擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的測序文庫的質粒DNA為模板，經PCR擴增後，在保證閱讀框正確的前提下重組至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。再將重組載體轉化入大腸桿菌DH5α中(轉化方法為CaCL2法或電轉化法)，篩選鑑定得到含有表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-TyrS。
挑取單菌落的工程菌DH5α-pGEX-2T-TyrS於3ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振搖培養37℃過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的LB培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中培養約3小時，至OD600達0.5後，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續於37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2×SDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達所需蛋白的工程菌。
按上述方法誘導表達所需蛋白的工程菌後，將細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS飽和的50％穀胱甘肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了所需蛋白的穀胱甘肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉澱加入100μl還原型穀胱甘肽洗脫液，室溫置10分鐘，上清即為洗脫的蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在46684道爾頓處的蛋白質條帶即為酪氨醯tRNA合成酶。
序列表1. SEQ ID NO.1(1)序列特徵a.長度1221鹼基對b.類型DNAc.鏈型雙鏈d.幾何結構線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述gtgtcggtgctagaggttttaaaagaaagaggatatatcgctcaaatgacccatgaagaagagatagagaagcttttagaaaaagaaaagataactttttacataggttttgaccccactgctgacagcctgcacgtaggtcatttgattcagataatgacaatggctcacatgcagagagccggccacaggccaattgtgcttttgggaggcggaactgcccttataggagatccgagcggtagaactgacatgagaaaaatgctcactaaagaggaaatagatagaaatgctgaagccttcaaaaagcagatggagagattcatcgatttttctgagggcaaagctataatggaaaacaatgctaaatggctccttggcttgaattacatagaatttttgagagatataggtgttcactttactgtaaatcgaatgcttgaggcggaagcttttaagactcgcatggaaagaggccttactttccttgagtttaattacatgctaatgcaggcttatgactttttagagctttacaggcgctatggctgtgtaatgcagatgggaggaaatgatcagtggtctaatataatcgctggagtagagcttatacgcaaaaaagaaggcaagcaggcttatggaatgacttttgtgctccttacaacaagcgaaggaaagaagatgggcaaaactgaaaaaggcgctatatggctggatcctaaaaagacttctccttatgaattttatcagtactggagaaatataggagacgcagatgtggaaaaggctttggctcttttgactttccttcctatggacgaagtgagaaggcttgggagactaagggataaggagataaacgaagctaaaaaggtactggcttttgaggttacaaagcttgtacacggtgaagaagaagccctaaaggctcagaaggcggccgaagctctgtttgaaggcggcggtgaaatggaacacgtgcccagcattgaagtctctcaggacataatcggaaggaaaatagttgatgtgctttttgaagctaaagtcataccttcaaagagcgagggaagaaggcttattcagcagggaggcctttacatcaacgacaagagggtagaaaacgtggatgaatgcataaaagaagagatggtaaaagaaaatgccattcttgtaagaaaagggaaaaaggaatatcacaggttattggtaaaggaatga2. SEQ ID NO.2(1)序列特徵a.長度406胺基酸b.類型多肽c.鏈型單鏈d.幾何結構立體(2)分子類型蛋白質(3)序列描述Val Ser Val Leu Glu Val Leu Lys Glu Arg Gly Tyr Ile Ala Gln Met1 5 10 15Thr His Glu Glu Glu Ile Glu Lys Leu Leu Glu Lys Glu Lys Ile Thr20 25 30Phe Tyr Ile Gly Phe Asp Pro Thr Ala Asp Ser Leu His Val Gly His35 40 45Leu Ile Gln Ile Met Thr Met Ala His Met Gln Arg Ala Gly His Arg50 55 60Pro Ile Val Leu Leu Gly Gly Gly Thr Ala Leu Ile Gly Asp Pro Ser65 70 75 80Gly Arg Thr Asp Met Arg Lys Met Leu Thr Lys Glu Glu Ile Asp Arg85 90 95Asn Ala Glu Ala Phe Lys Lys Gln Met Glu Arg Phe Ile Asp Phe Ser100 105 110Glu Gly Lys Ala Ile Met Glu Asn Asn Ala Lys Trp Leu Leu Gly Leu115 120 125Asn Tyr Ile Glu Phe Leu Arg Asp Ile Gly Val His Phe Thr Val Asn130 135 140Arg Met Leu Glu Ala Glu Ala Phe Lys Thr Arg Met Glu Arg Gly Leu145 150 155 160Thr Phe Leu Glu Phe Asn Tyr Met Leu Met Gln Ala Tyr Asp Phe Leu165 170 175Glu Leu Tyr Arg Arg Tyr Gly Cys Val Met Gln Met Gly Gly Asn Asp180 185 190Gln Trp Ser Asn Ile Ile Ala Gly Val Glu Leu Ile Arg Lys Lys Glu195 200 205Gly Lys Gln Ala Tyr Gly Met Thr Phe Val Leu Leu Thr Thr Ser Glu210 215 220Gly Lys Lys Met Gly Lys Thr Glu Lys Gly Ala Ile Trp Leu Asp Pro225 230 235 240Lys Lys Thr Ser Pro Tyr Glu Phe Tyr Gln Tyr Trp Arg Asn Ile Gly245 250 255Asp Ala Asp Val Glu Lys Ala Leu Ala Leu Leu Thr Phe Leu Pro Met260 265 270Asp Glu Val Arg Arg Leu Gly Arg Leu Arg Asp Lys Glu Ile Asn Glu275 280 285Ala Lys Lys Val Leu Ala Phe Glu Val Thr Lys Leu Val His Gly Glu290 295 300Glu Glu Ala Leu Lys Ala Gln Lys Ala Ala Glu Ala Leu Phe Glu Gly305 310 315 320Gly Gly Glu Met Glu His Val Pro Ser Ile Glu Val Ser Gln Asp Ile325 330335Ile Gly Arg Lys Ile Val Asp Val Leu Phe Glu Ala Lys Val Ile Pro340 345 350Ser Lys Ser Glu Gly Arg Arg Leu Ile Gln Gln Gly Gly Leu Tyr Ile355 360 365Asn Asp Lys Arg Val Glu Asn Val Asp Glu Cys Ile Lys Glu Glu Met370 375 380Val Lys Glu Asn Ala Ile Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Glu Tyr His385 390 395 400Arg Leu Leu Val Lys Glu40權利要求
1.一種分離的DNA分子，其特徵在於它是編碼具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於所說的核苷酸序列編碼具有SEQ.ID NO.2中的胺基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與耐高溫酪氨醯tRNA合成酶相關。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於所說的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無義、插入、錯義。
4.一種分離出的多肽，其特徵在於它具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於它具有SEQ ID No.2中的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
6.一種載體，其特徵在於它含有權利要求1中之DNA。
7.一種宿主細胞，其特徵在於它是用權利要求6所述載體轉化的原核細胞或真核細胞。
8.一種製備耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟1)分離出編碼耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1；2)構建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的重組細胞；4)培養步驟3)中的重組細胞；5)分離、純化得到耐高溫酪氨醯tRNA合成酶。
全文摘要
本發明公開了一種耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因及編碼的多肽和製備方法。它涉及編碼具有活性或其功能等同變異體的分離的DNA和利用重組DNA技術以所述分離的DNA生產具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽或其功能等同變異體。以騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析為基礎,克隆分離了耐高溫酪氨醯tRNA合成酶基因。該基因對於製備用於生產耐高溫酪氨醯tRNA合成酶的轉基因微生物或動植物,並回收穫得該基因編碼的酶有用。另外,本發明還提供了具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽的胺基酸序列及功能等同體。同時,本發明還提供了製備,分離,純化具有耐高溫酪氨醯tRNA合成酶活性的多肽的方法。
文檔編號C12N15/63GK1379094SQ0211073
公開日2002年11月13日 申請日期2002年2月1日 優先權日2002年2月1日
發明者於軍, 李蔚, 張麗敏, 胡松年, 田宇清 申請人:杭州華大基因研發中心