一種從紅車軸草製備紅車軸草異黃酮的製備工藝的製作方法

2023-06-02 15:29:46 1

專利名稱：一種從紅車軸草製備紅車軸草異黃酮的製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從紅車軸草製備臨床藥用或功能食品用的紅車軸草異黃酮的製備方法。
背景技術：
現代醫學研究已證明雌激素代謝紊亂與更年期徵候群、骨質疏鬆症、心血管疾病、老年痴呆、雌激素依賴性腫瘤，如子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等密切相關，雌激素替代療法對更年期徵候群、骨質疏鬆症、心血管疾病、老年痴呆、前列腺癌、結腸癌的防治有裨益，但可能增加子宮癌、乳腺癌的發病率。大量研究證明，植物雌激素的補充有助於上述疾病的防治，卻沒有人雌激素替代療法的弊病。因此，植物雌激素的補充療法越來越受到人們重視。
紅車軸草是一種廣泛種植的牧草，又稱紅三葉草、紅花苜蓿。紅車軸異黃酮(Isoflavones)是一類含有與人體雌激素結構相似的、非甾體樣結構的、對人體雌激素及促性腺激素代謝及表達具有雙相調節作用的活性物質。它主要包括「染料木素」、「大豆黃素」、「鷹嘴豆芽素A」、「刺芒柄花素」及其甙類，常被稱為「植物雌激素」(Phytoestrogens)。紅車軸草是一種少見的同時含有四種有效異黃酮的植物，近年來西方先進國家已推薦將紅車軸草總異黃酮製品作為食品補充劑應用於更年期和絕經婦女、骨質疏鬆患者。
目前從紅車軸草製備紅車軸異黃酮的製備方法有以下幾種1.溶劑法用水、甲醇、含水乙醇等極性溶劑作熱提取。水與中、低濃度乙醇適宜於黃酮甙的提取；甲醇與高濃度乙醇則用於甙元的提取。用溶劑法所得的提取物成分複雜，常需將水或醇的流浸膏用不同極性溶劑萃取分離，且提取物異黃酮的含量低，溶劑耗量大。
2.沉澱法用水或醇提取，提取液以醋酸鉛或聚乙烯吡咯烷酮沉澱法獲取黃酮甙及具有鄰二酚羥基或羧基結構的黃酮類成分。此法雖簡便，但異黃酮提取不完全，並且製備物中異黃酮的含量較低。
3.水解法將溶劑法或沉澱法獲得的粗異黃酮甙以鹽酸液加熱水解；或極性溶劑熱提取溶液直接加酸或酶水解，冷卻析出甙元。此法雖簡便，但製備物中異黃酮的雜質含量很高。
4.柱層析法 常採用的有聚醯胺、矽膠、氧化鋁、葡聚糖凝膠、大孔樹脂柱層析法。將溶劑法或沉澱法獲得物，以上述填充劑吸附，後以不同極性梯度的多組多元溶劑系統洗脫，濃縮乾燥後獲取各種不同的異黃酮甙和甙元。此法可以獲得含量相當高的異黃酮製品，但分開不同的異黃酮甙及甙元操作比較複雜，生產周期長，成本高，難以大規模工業化生產。
5.製備型高效液相色譜法是將柱層析法獲得的粗異黃酮製品通過製備型高效液相色譜以製備高純度的某一異黃酮成分的單體，而不適用於總異黃酮製品的製備。
植物中異黃酮成分十分複雜，各種異黃酮成分的理化性質差異甚大，難以採用一個通法。目前，紅車軸草異黃酮製劑的生產工藝一般是採用溶劑法生產異黃酮含量比較低的粗產品——紅車軸草浸膏；採用柱層析法以紅車軸草浸膏為原料製備異黃酮含量比較高的製品。另外，植物中具有雌激素樣作用的異黃酮成分通常包括異黃酮甙元(素)和異黃酮甙二大類。一般認為活性部位是甙元，其甙類不僅活性低而且難以吸收。植物中異黃酮甙含量相當高，特別是在葉和花中。紅車軸草中異黃酮甙的含量超過其總異黃酮的1/3，而紅車軸草總異黃酮製品中追尋的目標是高含量的異黃酮甙元。
《製備紅車軸草提取物的方法》(專利申請號03118845)，該方法包括下列步驟用甲醇或乙醇提取紅車軸草全草；過濾該提取液並濃縮；將濃縮液離心取渣；將藥渣用石油醚或正己烷脫脂乾燥；用脂肪族的酯類萃取濃縮後，析晶得到提取物a；將萃取後渣用50-90％的醇提取、回收醇，得濃縮液；將所得析晶後母液及濃縮液調pH值＝8-10以內，過聚苯乙烯骨架大孔吸附樹脂分離，得提取物b，將提取物a和b合併，用醇再精製，得高含量提取物。該申請提供了一種應用淫羊藿、維生素B↓[1]、B↓[6]及含維生素為組合與紅車軸草提取物配伍，用於補腎、補充植物雌激素，從而能更好地預防乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和防治骨質疏鬆、更年期綜合症。

發明內容
本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種能較簡便、高效率地從紅車軸草中製取四種有效成分異黃酮刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、染料木素、大豆黃素，製備物的總異黃酮含量超過60％，具有很好的藥用或功能食品價值的從紅車軸草製備紅車軸草異黃酮的製備工藝。
本發明目的的實現方式為，一種從紅車軸草製備紅車軸草異黃酮的製備工藝，其具體工藝流程為1)將曬乾儲藏藥材剁成細段，2)製備紅車軸草醇流浸膏紅車軸草細段用6～12倍量低碳醇熱回流提取，減壓回收溶劑並濃縮製得每毫升含生藥1克±0.2克的紅車軸草流浸膏，
3)醇紅車軸草流浸膏的水解處理將流浸膏先用2～5倍量95％乙醇充分攪拌復溶，過濾去沉澱，濾液加礦酸至終濃度為2～5％，熱回流水解處理1.5～3小時，水解液過濾去渣，4)將水解處理的濾液加飽和氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液調pH至中性，過濾去渣，5)中性的濾液減壓濃縮至原體積1/2左右後，或加高溫活化的矽膠粉充分研磨吸附，矽膠用量為溶液量的1/2-1，乾燥，再進行後續洗滌及洗脫處理，或加高溫活化的活性氧化鋁顆粒攪拌1/2～1小時，氧化鋁用量為溶液重量的1/2～2倍，再抽濾去濾液，6)吸附物洗滌去雜先以2～5倍量的、溫度低於15℃的冷石油醚攪拌洗滌，抽濾去醚，後以5～20倍量的，溫度低於15℃的冷水攪拌洗滌抽濾去水，脫去矽膠或活性氧化鋁吸附物中的雜質，7)矽膠或活性氧化鋁吸附物洗脫洗滌處理後的矽膠吸附物以水飽和醋酸乙酯在50～60℃熱攪拌充分洗脫，水飽和醋酸乙酯用量為吸附物重量的2～4倍，氧化鋁吸附、絡合物以水飽和醋酸乙酯-冰醋酸液(1000∶1)熱回流洗脫，水飽和醋酸乙酯用量為吸附物重量的2～4倍，洗脫液過濾、回收溶劑、濃縮、乾燥即得紅車軸草總異黃酮製備物。
採用本發明，將紅車軸草中含量相當高的刺芒柄花甙(Ononin)與印度黃檀甙(Sissoirin)預先水解轉化為刺芒柄花素與鷹嘴豆芽素A，可以較簡便、高效率地從紅車軸草中製取四種有效成分異黃酮——刺芒柄花素(Formonontin)、鷹嘴豆芽素A(Biochanin A)、染料木素(Genistein)、大豆黃素(Daidzein)，製備物的總異黃酮含量超過50％而具有很好的藥用或功能食品價值。


圖1水解前紅車軸草醇流浸膏高效液相色譜分析譜2水解後紅車軸草醇流浸膏高效液相色譜分析譜3吸附物冷石油醚洗滌液高效液相色譜4吸附物冷水洗滌液高效液相色譜5紅車軸草醇浸膏-水解-矽膠吸附-醋酸乙酯洗脫製品液相色譜6紅車軸草醇浸膏-水解-氧化鋁吸附-酸化醋酸乙酯洗脫製品液相色譜圖具體實施方式
本發明具體工藝流程為1)將曬乾儲藏藥材剁成細段，2)製備紅車軸草醇流浸膏紅車軸草細段用6～12倍量低碳醇多次熱回流提取3小時，2～4次，低碳醇如40～95％乙醇、甲醇、水飽和正丁醇。減壓回收溶劑並濃縮製得每毫升含生藥1克±0.2克的紅車軸草醇流浸膏，紅車軸草醇流浸膏中富含刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花甙、印度黃檀甙，並含有少量大豆異黃酮及染料木素。其高效液相色譜分析譜圖見圖13)紅車軸草醇流浸膏的水解處理將紅車軸草醇流浸膏先用2～5倍量95％乙醇充分攪拌復溶，過濾去沉澱，濾液中富含刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花甙、印度黃檀甙，並含有少量大豆異黃酮及染料木素，其高效液相色譜分析譜圖見圖1。濾液加礦酸至終濃度為2～5％，熱回流水解處理1.5～3小時，水解液過濾去渣，甲醇、水飽和正丁醇熱回流提取濃縮製得的流浸膏加3～5倍量原溶劑攪拌稀釋，同上過濾、去沉澱。。濾液加礦酸，如加濃鹽酸水解處理。過濾去渣，濾液樣品乾燥殘渣用甲醇溶解高效液相色譜檢測證實刺芒柄花甙、印度黃檀甙成分峰基本消失，分別轉化為刺芒柄花素與鷹嘴豆芽素A，這從圖2可見，4)將水解處理的濾液加飽和氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液調pH至中性，過濾去渣，如若不加鹼調pH至中性而直接濃縮、吸附將導致部分有效成分碳化失效，5)矽膠粉或活性氧化鋁顆粒吸附處理中性的濾液減壓濃縮至原體積1/2左右後，或加高溫活化的100～200目矽膠粉充分研磨吸附矽膠用量為溶液量的1/2-1，乾燥，再進行後續洗滌及洗脫處理，或加高溫活化的活性氧化鋁顆粒攪拌1/2～1小時，並靜置2小時以上，氧化鋁用量為溶液重量的1/2～2倍，充分吸附絡合後再抽濾去濾液，採用氧化鋁顆粒吸附時部分異黃酮成分將與氧化鋁形成絡合物，6)矽膠或活性氧化鋁吸附物洗滌去雜先以2～5倍量的、溫度低於15℃的冷石油醚攪拌洗滌2次，每次1/2～1小時，抽濾去醚，後以5～20倍量的，溫度低於15℃的冷水攪拌洗滌2～5次，每次1/2～1小時，抽濾去水，冷石油醚攪拌洗滌可以祛除非極性和低極性雜質，這從圖3中可證實其中基本不含所需的6種異黃酮成分，若採用熱石油醚攪拌洗滌將丟失部分有效部分異黃酮成分；冷水攪拌洗滌可以祛除大量高極性雜質，圖4的水洗滌液高效液相色譜證實其中基本不含所需的6種異黃酮成分；若不進行冷水攪拌洗滌則製備物為高光澤泥膏，吸潮性強難以粉碎並明顯降低製品總異黃酮含量。
7)矽膠或活性氧化鋁吸附物洗脫洗滌處理後的矽膠吸附物以水飽和醋酸乙酯在50～60℃熱攪拌充分洗脫，每次攪拌洗脫時間不少於1/2小時，洗脫次數4～5次，水飽和醋酸乙酯用量為吸附物重量的2～4倍，氧化鋁吸附、絡合物以水飽和醋酸乙酯-冰醋酸液(1000∶1)熱回流洗脫，水飽和醋酸乙酯用量為吸附物重量的2～4倍，每次回流洗脫時間不少於2小時，洗脫液過濾，洗脫次數2～4次，再回收溶劑、濃縮、乾燥即得紅車軸草總異黃酮製備物。洗脫液含一定量的醋酸有助於解除絡合，可明顯提高成品率。
紫外分光光度法檢測，本發明方法製備的紅車軸草總異黃酮含量，以刺芒柄花素計用將超過60％，製備物高效液相色譜檢測證實主要含有刺芒柄花素和鷹嘴豆芽素A、並含有少量的大豆異黃酮及染料木素。其中矽膠吸附醋酸乙酯洗脫法成品得率高於活性氧化鋁法；而活性氧化鋁吸附、絡合，酸化醋酸乙酯洗脫法成品中鷹嘴豆芽素A的相對含量較高。兩法所得製品的總異黃酮含量相近，這從圖5、6可看出。
用本發明方法製備的紅車軸草總異黃酮製品的經用14月齡更年期雌性Wistar種大鼠，手術摘除雙側卵巢一周後隨機分為陰性對照組、己烯雌酚組、大中小3個劑量的紅車軸草總異黃酮組，每組10隻，假手術組10隻。每天灌胃給藥1次，分別給以溶劑、己烯雌酚及不同劑量的紅車軸草總異黃酮，連續90天，動物實驗結果見表1表1 紅車軸草總異黃酮對更年期去勢大鼠雌二醇、卵泡生成素、子宮指數的影響

從表中可見本製備物具有良好的植物雌激素作用。
權利要求
1.一種從紅車軸草製備紅車軸草異黃酮的製備工藝，其特徵在於其具體工藝流程為1)將曬乾儲藏藥材剁成細段，2)製備紅車軸草醇流浸膏紅車軸草細段用6～12倍量低碳醇熱回流提取，減壓回收溶劑並濃縮製得每毫升含生藥1克±0.2克的紅車軸草流浸膏，3)醇紅車軸草流浸膏的水解處理將流浸膏先用2～5倍量95％乙醇充分攪拌復溶，過濾去沉澱，濾液加礦酸至終濃度為2～5％，熱回流水解處理1.5～3小時，水解液過濾去渣，4)將水解處理的濾液加飽和氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液調pH至中性，過濾去渣，5)中性的濾液減壓濃縮至原體積1/2左右後，或加高溫活化的矽膠粉充分研磨吸附，矽膠用量為溶液量的1/2-1，乾燥，再進行後續洗滌及洗脫處理，或加高溫活化的活性氧化鋁顆粒攪拌1/2～1小時，氧化鋁用量為溶液重量的1/2～2倍，再抽濾去濾液，6)吸附物洗滌去雜先以2～5倍量的、溫度低於15℃的冷石油醚攪拌洗滌，抽濾去醚，後以5～20倍量的，溫度低於15℃的冷水攪拌洗滌抽濾去水，脫去矽膠或活性氧化鋁吸附物中的雜質，7)矽膠或活性氧化鋁吸附物洗脫洗滌處理後的矽膠吸附物以水飽和醋酸乙酯在50～60℃熱攪拌充分洗脫，水飽和醋酸乙酯用量為吸附物重量的2～4倍，氧化鋁吸附、絡合物以水飽和醋酸乙酯-冰醋酸液(1000∶1)熱回流洗脫，水飽和醋酸乙酯用量為吸附物重量的2～4倍，洗脫液過濾、回收溶劑、濃縮、乾燥即得紅車軸草總異黃酮製備物。
全文摘要
一種從紅車軸草製備紅車軸草異黃酮的製備工藝，涉及一種從紅車軸草製備紅車軸草異黃酮的製備方法。其具體工藝流程為先低碳醇熱回流提取製備紅車軸草醇流浸膏，再用礦酸作水解處理，水解處理的濾液調pH至中性，中性濾液減壓濃縮加高溫活化的矽膠粉或加高溫活化的活性氧化鋁吸附，吸附物洗滌去雜後洗脫，洗脫液過濾、回收溶劑、濃縮、乾燥即得紅車軸草總異黃酮製備物。採用本發明，能將紅車軸草中含量相當高的刺芒柄花甙與印度黃檀甙預先水解轉化為刺芒柄花素與鷹嘴豆芽素A，可以較簡便、高效率地從紅車軸草中製取四種有效成分異黃酮刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、染料木素、大豆黃素，製備物的總異黃酮含量超過60％具有很好的藥用或功能食品價值。
文檔編號C07D311/00GK1693306SQ200410013189
公開日2005年11月9日 申請日期2004年5月21日 優先權日2004年5月21日
發明者薛存寬 申請人:薛存寬