溶栓酶基因、重組蛋白及其製備方法
2023-06-02 15:28:21
專利名稱：溶栓酶基因、重組蛋白及其製備方法
技術領域：
本發明涉及血栓溶解物質；具體地說，涉及一種溶栓酶基因及由其表達產生的蛋白質、製備方法；本發明還涉及一種溶栓酶基因的來源菌株和兩種含有該基因的重組菌株。
背景技術：
血栓栓塞性疾病的致殘率和病死率都很高，嚴重威脅人類生命和健康，全世界約有病人1500萬。目前，由於各種原因引起的血液栓塞疾病，如腦血栓、心肌梗塞、冠心病、肢體血管栓塞等的發病率呈上升趨勢，僅我國每年用於防治和康復等方面的費用高達數千億元人民幣，此類疾病嚴重危害了患者的生存質量，增加了患者家庭及社會的負擔。溶栓治療是治療血栓疾病的有效手段，因此溶栓和溶栓輔助藥物的研製進展迅速。
目前，國內外上市或在研的溶栓藥物很多，從原料來源上，可分為3類(1)基因重組產品，如重組鏈激酶、重組水蛭素、t-PA等；(2)生物工程產品，如葡激酶、納豆激酶等；(3)生化藥品，如尿激酶、降纖酶、蛇毒溶栓酶、蚓激酶等。
國內外已正式批准臨床使用的主要溶栓藥物有鏈激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase-type plasminogen activator，u-PA)、重組組織型溶栓酶原激活劑(Recombinan tissue-type plasminogen activator，rt-PA)、對-甲氧苯甲醯溶栓酶原鏈激酶激活劑複合物(Anisoylated plasminogenstreptokinase activator complex，APSAC)和重組鏈激酶(Recombinantstreptokinase，r-SK)。
目前來看，各類溶栓藥物療效可以肯定，但是還存在一些缺陷，阻礙了溶栓療效的進一步提高。主要問題有以下幾方面
(1)伴隨著血栓形成的機體的氧化損傷蛋白質和脂質的氧化是伴隨著心血管疾病而發生的，氧化的蛋白質和脂質使機體的損害加重，至今未見報導現有溶栓藥物具有對機體氧化損傷的保護作用。
(2)出血是最常見的不良反應，與其藥理作用和使用的劑量有一定關係。表現為單純穿刺部位滲血，輕度皮下，呼吸道，泌尿道或消化道出血，顱內出血發生率為0.5％～1％。
(3)再梗塞急性心肌梗塞治療後，發生再梗塞是國內外至今未能解決的難題。再梗塞的主要原因是①纖溶系統被激活後可活化血小板，使血小板膜糖蛋白受體Gp IIb/IIIa發生構象變化，使纖維蛋白原和Von Willebrand因子聚集於血小板上Gp IIb/IIIa受體，促進血栓形成。同時血小板對溶栓酶的作用不敏感，現有溶栓藥物對富含血小板的血栓治療效果較差。
②rt-PA，rscu-PA等溶栓藥物半衰期很短，在血循環中被肝臟快速清除。
③溶栓治療後殘留血栓表面吸附有大量凝血酶，溶栓治療後啟動凝血過程，導致血栓再次形成。
(4)由於有一些被批准的溶栓藥物成本很高，因而治療費用也不菲，給患者和社會增加了負擔。
為克服現有溶栓藥物的上述局限性，有許多新型溶栓藥物正在研製開發中。增強纖維蛋白選擇性，延長半衰期，抗PAI-1抑制作用，尋找低成本的溶栓藥物等是主要的研究目標。
發明內容
在我們的研究中，用水稻葉包裹大豆發酵和纖維蛋白平板測定纖溶活性的方法獲得了一株能高效分泌溶栓酶的枯草桿菌。經中國典型培養物保藏中心鑑定，該菌株為一種新的枯草桿菌，命名為Bacillus subtilis QK02。隨後擴增了QK蛋白酶的基因qk，並製備了含該基因的重組質粒和重組菌株，利用重組表達菌株表達了重組QK蛋白酶。用纖維蛋白平板法測得重組QK蛋白酶的纖溶活力達到41000IU/mg，後來我們詳細地研究了該酶的基本酶學性質，值得一提的是，我們的實驗表明，該酶還具有抗氧化的功能。由於該酶是首次發現的兼具氧化功能的候選溶栓劑，對血栓栓塞性疾病的預防、治療、診斷是一次具有重大意義的突破。
本發明的目的是提供蛋白酶QK的基因、重組蛋白及其製備方法。
本發明提供的溶栓酶基因最初來源於枯草桿菌Bacillus subtilis QK02菌株。在本發明中，發明者取湖北武漢地區的水稻葉85℃熱處理10分鐘，用其包裹滅過菌的大豆，42℃培養24小時後用培養液浸泡培養過的大豆，再將培養液作適當稀釋後塗布營養瓊脂平板，從營養平板上獲得的菌落接種到5ml培養液中37℃培養24小時，離心後用纖維蛋白平板法測定上清液的溶栓酶活性，選取酶活性最高的菌株，再重複篩選過程而獲得枯草桿菌Bacillus subtilis QK02菌株，保藏號CCTCC M203078。
本發明是基於發明人的下述發現而完成的通過檢測降解纖維蛋白能力的方法篩選到了枯草桿菌Bacillus subtilisQK02菌株，進而發現培養該菌能夠產生大量的溶栓酶QK，纖維蛋白平板實驗表明該酶具有很高的溶解纖維蛋白的能力。除此之外，發明人還發現該酶在體內外及血管內皮細胞中具有拮抗由血紅素、NaNO2和H2O2帶來的氧化損傷的能力。
本發明通過檢測纖維蛋白降解的方法篩選到了株枯草桿菌Bacillussubtilis QK02，它經中國典型培養物保藏中心鑑定並保存，保存序號為CCTCCNoM203078。
從該菌中利用PCR的方法得到編碼溶栓酶QK的基因qk，它是一個828bp的DNA分子，其DNA序列即蛋白酶QK的基因qk的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
SEQ ID NO1GCG CAA TCT GTT CCT TAC GGC ATT TCT CAA ATT AAA GCG 39CCG GCT CTT CAC TCT CAA GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA 78AAA GTA GCT GTT ATC GAC AGC GGA ATT GAC TCT TCT CAT 117CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA GCA AGC TTC GTA CCT 156TCT GAA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC AGT TCT CAC GGC 195ACA CAC GTA GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT AAT AAC ACA 234ATC GGT GTT CTG GGC GTA GCG CCA AAC GCA TCG TTA TAT 273
GCA GTA AAA GTT CTT GAC TCA ACA GGA AGC GGC CAA TAC 312AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCT ATT TCC AAC 351AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT TCT 390GGA TCT ACA GCT CTG AAA ACA GTC GTT GAT AAA GCA GTT 429TCC AGC GGT ATC GTC GTT GCT GCC GCT GCC GGA AAC GAA 468GGT TCA TCG GGC AGC ACA AGC ACA GTC GGC TAC CCT GCA 507AAA TAT CCT TCT ACC ATT GCG GTA GGT GCG GTA AAC AGC 546AGC AAC CAA AGA GCT TCA TTC TCA AGC GCA GGT TCT GAG 585CTT GAT GTA ATG GCT CCT GGC GTG TCC ATC CAA AGC ACA 624CTT CCT GGA GGC ACT TAC GGT GCT TAC AAC GGA ACG TCA 663ATG GCG ACT CCT CAC GTT GCC GGA GCA GCA GCG CTA ATT 702CTT TCT AAG CAT CCG ACT TGG ACA AAC GCG CAA GTC CGT 741GAT CGT TTA GAA AGC ACT GCA ACA TAT CTG GAA ACG TTT 780CTA CTA TGG AAA AGG GTT AAT CAA CGT CAA GCA GCT GCA 819CAA TAA TAG 3′ 828編碼一個由274個胺基酸組成的纖溶蛋白酶，其胺基酸序列即蛋白酶QK的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
SEQ ID NO2AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHP 40DLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNTIG 80VLGVAPNASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMD 120VINMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSG 160STSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSAGSELDVMA 200PGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPT 240WTNAQVRDRLESTATYLETFLLWKRVNQRQAAAQ * *274
通過常規的分子生物學基因克隆的方法獲得了含有該基因的重組表達質粒，轉化大腸桿菌使重組菌表達溶栓酶QK。因此本發明同時提供了一種可能性，即通過基因工程或分子生物學手段，將本發明涉及的酶的基因克隆到其它載體，由其它菌株在其它培養條件下產生本發明涉及的溶栓酶QK。本發明涉及的溶栓酶QK特別適合用來溶解血栓中的纖維蛋白，同時還可以化解機體的氧化危機。使血栓栓塞性疾病和機體氧化損傷的治療成為可能。
本發明涉及的QK蛋白酶的基因及其蛋白的製備方法包括下述步驟(1)從枯草桿菌Bacillus subtilis QK02菌株中提取總DNA，並利用PCR方法擴增得到DNA片斷(即qk基因)。
(2)將qk基因克隆到pBlueScript M13 KS(-)載體上獲得重組克隆質粒pBS-qk，以重組質粒pBS-qk轉化大腸桿菌TG1獲得重組大腸桿菌菌株TG1PBSqk。
(3)從重組克隆質粒pBS-qk中分離出溶栓酶QK的基因qk，再將其連接到pRSET A載體上獲得重組表達質粒pRA-qk，以重組質粒pRA-qk轉化大腸桿菌BL21獲得重組大腸桿菌菌株BL21PRAqk。
(4)培養重組大腸桿菌BL21PRAqk使其表達QK蛋白，然後離心獲得菌體。
(5)破碎菌體後利用His親和層析樹脂將重組QK蛋白酶分離出來。
本發明所涉及的溶栓酶QK與目前國內外上市或在研的溶栓藥物比較有以下幾個優點(1)高活性。該酶具有更高的纖溶活性，達到41000IU/mg，比納豆激酶的溶栓能力高出3倍以上。
(2)抗氧化。我們通過實驗發現它除有纖溶作用以外還兼有保護由血紅素、NaNO2和H2O2引起的人血管內皮細胞氧化損傷的功能。
(3)抗PAI-1抑制作用。由於該酶通過直接水解血栓中的纖維蛋白來溶栓，因而避免了PAI-1對t-PA等溶栓藥物的抑制作用。
(4)纖維蛋白特異性。該酶只水解纖維蛋白，而對纖維蛋白原沒有作用，因此在一定程度上避免了出血現象的發生。
(5)在血液中的半衰期長，降低了再梗塞的機率。
(6)成本低。該酶來源於枯草桿菌，可以通過較為廉價的發酵方法大量生產，降低了成本。這些都充分說明該酶具有廣闊的應用前景。
中國典型培養物保藏中心用於專利程序的培養物保藏受理通知書(收據)分類命名Bacillus subtilis QK02保藏日期2003年11月17日保藏單位 中國.武漢.武漢大學 郵編 430072保藏編號CCTCC NOM 203078圖1—蛋白酶QK的基因qk的重組克隆質粒pBS-qk的構建流程圖；圖2—蛋白酶QK的基因qk的重組表達質粒pRA-qk的構建流程圖；圖3—蛋白酶QK基因qk在大腸桿菌中的表達的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜；圖4A—纖維蛋白平板上測定在不同表達時間下蛋白酶QK的纖溶活性圖；圖4B—纖維蛋白平板上測定純化的重組蛋白酶QK的纖溶活性圖；圖5—蛋白酶QK的在體內各種器官組織中抗蛋白質的氧化作用測定圖；圖6—蛋白酶QK的在體外抗牛血清白蛋白中酪氨酸氧化作用的螢光光譜圖(295nm螢光激發)；圖7—枯草桿菌Bacillus subtilis QK02菌株的顯微照片圖；圖8—枯草桿菌Bacillus Subtilis QK02菌株的生理生化特性。
其中3.1—蛋白質分子量標準；3.2—含重組質粒pRA-qk的大腸桿菌在表達2個小時以後全細胞蛋白；3.3—含重組質粒pRA-qk的大腸桿菌在表達4個小時以後全細胞蛋白；3.4—含重組質粒pRA-qk的大腸桿菌在表達6個小時以後全細胞蛋白，箭頭所指為QK蛋白(分子量約33.8KD)；3.5—含空載體質粒pRSETA的大腸桿菌在表達6個小時以後全細胞蛋白。
6.1-6.4—含空載體質粒pRSETA的大腸桿菌BL21表達2，4，6，8個小時以後細胞裂解液(作為對照)；
6.5-6.8—含重組表達質粒pRA-qk的大腸桿菌BL21PRAqk表達2，4，6，8個小時以後細胞裂解液；6.9—尿激酶(5000IU/ml)；6.10—純化的Subtilisin QK(10μg)6.11—純化的Subtilisin QK(5μg)6.12—尿激酶(5000IU/ml)7.1—天然BSA；7.2—QK(2μg)存在下BSA的氧化；7.3—QK(1μg)存在下BSA的氧化；7.4—QK不存在下BSA的氧化。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明進行詳細描述。
為達到本發明的目的，製備本發明涉及的蛋白酶QK及其重組質粒和菌株的方法包括如下步驟(1)從枯草桿菌Bacillus subtilis QK02中提取基因組DNA，並利用PCR擴增得到DNA片斷稱為qk，將其連接到pBlueScript M13 KS(-)載體上並轉化大腸桿菌TG1獲得含qk片斷的重組質粒pBS-qk及重組大腸桿菌菌株TG1PBSqk；(2)重組質粒pBS-qk經PstI和EcoRI雙酶切得到qk片斷，再將其連接到表達質粒pRSET A上並轉化大腸桿菌BL21，獲得含qk片斷的重組表達質粒pRA-qk及重組大腸桿菌菌株BL21PRAqk。
(3)在可使上述qk基因表達的條件下培養該重組大腸桿菌BL21PRAqk，然後離心獲得菌體，破碎菌體後利用His親和層析樹脂將重組QK蛋白酶分離出來。
在含有50mg/ml纖維蛋白的平板上打孔並加入上述純化得到的重組QK蛋白酶，置37℃，15小時後在孔的周圍形成了透明的纖維蛋白溶解圈，經過與已知的尿激酶標準品比較計算該酶的纖維蛋白溶解活性達到每毫克41000IU，說明該酶有強的降解纖維蛋白的能力，可用於血栓塊的溶解。而且實驗表明該酶的最適PH8.5，最適溫度55℃。
溶栓酶QK的體外抗氧化作用實驗步驟如下在溶栓酶QK存在或不存在(作為對照)的條件下用螢光光譜儀[LS-55luminescence spectrometer(PerkinElmerLife Sciences，Shelton，CT)]檢測牛血清白蛋白BSA氧化過程中酪氨酸的螢光變化。檢測條件為激發光譜295nm，記錄光譜300-420nm，狹縫寬度(emissionslits)10nm和6nm，掃描速度100nm min-1。反應液是由1μM的BSA、50μg的血紅素、100μM的NaNO2、100μM的H2O2、1或2μg的QK蛋白組成的。結果見圖5，從圖中可以看出QK蛋白在體外條件下可以抑制由血紅素、NaNO2和H2O2引起的蛋白質氧化。
溶栓酶QK在體內的抗氧化作用實驗步驟如下每個實驗組由10隻昆明鼠組成，對照組是沒有任何藥物注射的，氧化組用0.5ml氧化劑(NaNO25mM，H2O25mM，血紅素25μM)肌肉注射，抗氧化組用氧化劑和溶栓酶QK(1600IU，40μg)各0.5ml肌肉注射。2小時後處死動物，按常規方法製作各器官組織的抽提液，然後利用鼠抗NO2-酪氨酸的單克隆抗體、羊抗鼠IgG-AP標記二抗的標準ELISA方法檢測各種器官組織的抽提液中NO2-酪氨酸的含量。結果見本說明附圖6，從圖中可以看出在多種組織和器官中QK蛋白均可以拮抗由血紅素、NaNO2和H2O2引起的蛋白質氧化。
本發明涉及的溶栓酶QK是一種新的絲氨酸蛋白酶。根據胺基酸的相似性比較分析發現，本發明涉及的酶與以前發現的納豆激酶等枯草桿菌中的蛋白酶有比較高的同源性，與納豆激酶的同源性高達96.8％。通過酶學性質研究表明該酶屬於Subtilisin家族。雖然有如此高的同源性，但本發明涉及的溶栓酶QK除比納豆激酶的纖溶活性高以外，還具有自己的特性，比如它有抗蛋白質氧化的功能，這是目前的溶栓酶(NK、SK等)所不具備的。
本發明涉及的枯草桿菌Bacillus Subtilis QK02菌株具有如下特徵(1)在NA平板上生長24h，菌落近似圓形、扁平、呈凹形、邊緣不整齊；培養時間稍長，在平板上可見部分菌落邊緣出現毛髮狀，菌苔較厚，表面呈乳白色，基質未見明顯的水溶性色素分泌。
(2)革蘭氏陽性，菌體為杆狀，細胞兩端鈍圓，多以單個形式出現(見圖7)；培養8h以上可見明顯的內生孢子形成，內生孢子為端生或次端生，孢囊不膨大；培養時間稍長，可見大量的芽孢脫落，芽孢為卵圓形。
(3)接酶試驗為陰性，其生理生化特性見圖8。
而本發明涉及的QK蛋白酶具有如下特徵(1)由枯草桿菌Bacillus Subtilis QK02或其衍生菌產生，衍生菌是指轉化有本發明涉及的DNA片段的重組菌株。
(2)由具有如SEQ ID NO1所示的DNA序列編碼。
(3)具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。
(4)其特性包括具有纖維蛋白溶解酶活性(40000IU/mg以上)；最適PH8.5；最適溫度55℃；分子量(天然蛋白30，306道爾頓、重組蛋白33，800道爾頓)。
(5)可以在體內外及細胞中拮抗由血紅素、NaNO2和H2O2引起的氧化損傷。
進一步地，本發明涉及一個DNA分子，該DNA分子編碼本發明所涉及的溶栓酶QK，該DNA分子的核苷酸序列(1)由SEQ ID NO1所示的DNA序列可編碼部分組成；(2)編碼一個蛋白質，其胺基酸序列為SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。
下面通過實施例對本發明進行進一步詳細的說明，應該理解的是，所述的實施例僅僅是用於說明而不是限制本發明。
實施例1 枯草桿菌Bacillus Subtilis QK02的製備過程(1)取水稻葉85℃熱處理10分鐘，用其包裹滅過菌的大豆，42℃培養24小時，後用培養液(大豆抽出液當中含有0.5％食鹽、0.5％Na2HPO4、2％液化澱粉)浸泡培養過的大豆，將浸泡過大豆的培養液作10-2-10-6稀釋，塗布營養瓊脂平板，37℃倒置培養後在平板上長出菌落。
(2)所獲的菌落分別接種在5ml培養液中37℃、250rpm培養24小時後，6000rpm離心5min。取20μl上清液在纖維蛋白平板上測定溶栓酶活性，然後選酶活性最高的菌株。
實施例2編碼溶栓酶QK的基因qk的PCR擴增和克隆及序列測定(1)枯草桿菌Bacillus Subtilis QK02的基因組DNA提取按照常規的方法(Saito，H.et al，1963，Biochim.Biophys.Acta 72619-629)來進行。
(2)PCR擴增用的引物根據溶栓酶QK的N末端20個胺基酸(AQSVPYGISQIKAPALHSQG，在湖南師範大學測序)和枯草桿菌aprN基因的C末端序列設計而成。擴增出片段的大小為828bp。
引物P85』CGC CTG CAG ATG GCG CAA TCT GTT CCT TAT GGC ATT引物P95』GCG GAA TTC TTA CTA TTA TTG TGC AGC TGC TTG上述引物由上海基康生物工程公司合成。PCR擴增反應50μl體系中9μl枯草桿菌基因組DNA作為模板；引物總濃度各0.8pmol/μl；dNTP 1mM；10×PCR緩衝液5μl；Taq polymerase 2.5U。反應程序為94變性1min，，55℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環。擴增產物在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳檢測。
(3)擴增產物和pBluescript M13載體都經PstI和EcoRI雙酶切，回收後連接，用連接產物轉化CaCl2法製備的E.coli TG1感受態細胞，轉化產物塗布在含有氨苄青黴素(Amp)的LB瓊脂平板上篩選重組子，37℃培養，挑選菌落，快速法提取質粒，用雙酶切法鑑定重組子。具體過程見圖1。
(4)重組質粒pBS-qk插入片段的核苷酸序列由上海博亞生物技術有限公司以T7和T3啟動子序列為引物測定。
實施例3編碼溶栓酶QK的基因qk的重組表達質粒的構建和表達(1)用PstI和EcoRI從pBS-qk質粒上切下並回收qk基因，並將該基因與經過PstI/EcoRI雙酶切並回收的pRSET A質粒DNA加T4DNA連接酶於18℃連接10小時，連接產物轉化CaCl2法製備的E.coli BL21(DE3)感受態細胞，塗布平板以篩選重組子，快速法提取質粒，進一步用PstI/EcoRI雙酶切鑑定陽性重組子。具體過程見圖2。
(2)表達載體pRSET受T7啟動子控制，用該載體構建的表達質粒在37℃或室溫下加IPTG誘導表達。挑單個陽性菌落接種於2ml LB培養基中，置搖床37℃過夜活化，然後以1∶50的比例稀釋到新鮮LB培養基中，37℃培養至A600＝0.8～1.0立即添加IPTG至終濃度為0.4mM，誘導2、4、6、8小時後，離心收集菌體，用1×SDS裂解液裂解，採用SDS-PAGE法鑑定表達產物。結果見圖3。
(3)採用纖維蛋白平板法測定枯草桿菌溶栓酶活性。將2ml纖維蛋白原溶液(50mg/ml)加入40ml瓊脂糖溶液(0.75％)中，混勻後取8ml加到裝有40μl凝血酶溶液(100NIH/ml)的塑料平板裡，然後立刻混勻並放置30分鐘後即製成纖維蛋白平板。用合適孔徑的吸管在纖維蛋白平板上打孔，以不同濃度的尿激酶作為標準品，各取20μl加到打好的孔中，IPTG誘導表達的菌液0.5ml經超聲波破碎後取20μl加到孔中，37℃溫箱中放置15h後取出測定纖維蛋白溶解面積，測定結果見本說明附圖4A。
實施例4重組溶栓酶QK的純化及其纖溶活性的測定重組菌E.coli BL21PRAqk的菌體懸於10mM甘氨酸緩衝液(PH9.6)中，利用超聲波破碎細胞，離心上清液為重組QK蛋白酶的粗酶液。此上清液經His-Bond鎳親和層析後，得到的蛋白酶在SDS-PAGE上顯示一條帶。純化後的溶栓酶QK的溶纖活性按照本說明實施例3中(3)的方法進行。測定結果見圖4B。
實施例5溶栓酶QK的體外抗氧化作用實驗在溶栓酶QK存在或不存在(作為對照)的條件下用螢光光譜儀(LS-55luminescence spectrometer)檢測牛血清白蛋白BSA氧化過程中酪氨酸和色氨酸的螢光變化。檢測條件為激發光譜295nm，記錄光譜300-420nm，狹縫寬度(emission slits)10nm和6nm，掃描速度100nm min-1。反應液是由1μM的BSA、50μg的血紅素、100μM的NaNO2、100μM的H2O2、1或2μg的QK蛋白組成的。結果見圖5，從圖中可以看出QK蛋白在體外條件下可以抑制由血紅素、NaNO2和H2O2引起的蛋白質氧化。
實施例6溶栓酶QK的體內抗氧化作用實驗每個實驗組由10隻昆明鼠組成，對照組是沒有任何藥物注射的，氧化組用0.5ml氧化劑(NaNO25mM，H2O25mM，血紅素25μM)肌肉注射，抗氧化組用氧化劑和溶栓酶QK(1600IU，40μg)各0.5ml肌肉注射。2小時後處死動物，按常規方法製作各器官組織的抽提液，然後利用鼠抗NO2-酪氨酸的單克隆抗體、羊抗鼠IgG-AP標記二抗的標準ELISA方法檢測各種器官組織的抽提液中NO2-酪氨酸的含量。結果見圖6，從圖中可以看出在多種組織和器官中QK蛋白均可以拮抗由血紅素、NaNO2和H2O2引起的氧化損傷。
權利要求
1.一種具有SEQ ID NO1所示核酸序列的溶栓酶基因。
2.一種具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的溶栓酶蛋白。
3.含有SEQ ID NO1所示核酸序列的重組質粒，其特徵是或為重組克隆質粒pBS-qk，或為重組表達質粒pRA-qk。
4.一種含有SEQ ID NO1所示核酸序列的溶栓酶基因的枯草桿菌菌株Bacillus subtilis QK02，其特徵是該菌株為CCTCC M203078。
5.含有權利要求3所述的重組質粒的重組菌株，其特徵是或為大腸桿菌TG1菌株TG1PBSqk，或為大腸桿菌BL21菌株BL21PRAqk。
6.一種製備具有溶栓酶活性的重組QK蛋白的方法，其特徵是有下列步驟(1)從枯草桿菌Bacillus subtilis QK02菌株中提取總DNA，並利用PCR方法擴增得到DNA片斷，將其克隆到pBlueScript M13 KS(-)載體上獲得重組克隆質粒pBS-qk，以該重組質粒轉化大腸桿菌TG1獲得重組大腸桿菌菌株TG1PBSqk；(2)從重組克隆質粒pBS-qk中分離出溶栓酶QK的基因qk，再將其連接到pRSET A載體上獲得重組表達質粒pRA-qk，以該重組質粒轉化大腸桿菌BL21獲得重組大腸桿菌菌株BL21PRAqk；(3)培養重組大腸桿菌BL21PRAqk使其表達QK蛋白。然後離心獲得菌體，破碎菌體後利用His親和層析樹脂將重組QK蛋白酶分離出來。
全文摘要
本發明公開了一種溶栓酶基因、重組蛋白及其製備方法；涉及血栓溶解物質；具體地說，涉及一種溶栓酶基因及由其表達產生的蛋白質和製備方法；還涉及一種溶栓酶基因的來源菌株和兩種含有該基因的重組菌株。通過核苷酸序列和胺基酸序列比較以及功能研究，表明該酶為一種新的纖維蛋白溶解酶，用纖維蛋白平板法測算酶的活力為41000 IU/mg。該酶兼有拮抗機體氧化損傷的功能，對血紅素、NaNO
文檔編號C07H21/00GK1563378SQ200410012978
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月6日 優先權日2004年4月6日
發明者齊義鵬, 高柱虎, 閻俊鵬 申請人:武漢大學