一種製備蝦青素單體的方法

2023-06-02 15:22:06 2

專利名稱：一種製備蝦青素單體的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地涉及水解蝦青素酯，獲得蝦青素單體的方法。
背景技術：
蝦青素(3，3』 _ 二羥基-3，3 』 _胡蘿蔔素_4，4』 _ 二酮酮式類胡蘿蔔素)是類 胡蘿蔔素的含氧衍生物。它具有極強的抗氧化能力，其自由基猝滅活力是胡蘿蔔素的 10倍，是維生素E的100-500倍。可作為天然著色劑用於水產養殖業；既具有增強免疫反 應及抗癌的活性，還可用於食品、醫藥、化妝品等工業。蝦青素可化學合成或從天然樣品中提取。利用化學手段合成蝦青素時將不可避免 的引入雜質化學物質，如合成過程中產生的非天然副產物等，將降低其生物利用安全性。因 此，不能用在人類市場。天然提取法主要是從法夫酵母、雨生紅球藻和蝦殼廢棄物中提取得 到蝦青素。法夫酵母細胞合成蝦青素以單體為主，但在胞內含量低，目前還難以形成生產規 模。雨生紅球藻內蝦青素含量較高，一般可達細胞乾重的2-3% (w/w) 0但其蝦青素主要以 蝦青素單酯(70% )及蝦青素雙酯(25% )的形式存在。蝦青素酯與油脂性質相近，組分複雜，純化和檢測困難。游離蝦青素不僅具有極強 的抗氧化能力，還可阻止鼠胚成纖維細胞中由致癌原誘導的腫瘤細胞轉移，在藥物開發中 具有重要作用。將蝦青素酯水解後可增加其親水性，並通過在蝦青素的羥基上連接某些基 團，使其變為水溶性分子，有利於其在製備口服藥物中的應用。如蝦青素雙琥珀酸二鈉鹽可 製成口服藥物，在治療心血管病中具有很好的應用前景。目前對蝦青素酯水解的方法主要 是鹼皂化，其過程需要低溫且條件難於控制，收率低，容易產生蝦青素的多種異構體及其它 副產物。脂肪酶(E. C. 3. 1. 1. 3)能夠分解三醯甘油，可專一性針對含有酯鍵的物質進行水 解反應，將油脂水解為游離脂肪酸和醇，還可催化酯化反應，轉酯化反應及酯交換反應。脂 肪酶的水解反應是在一種非均相體系中進行的，酶(水溶性)在底物(水不溶性)和水的 界面上催化底物反應，這種特性被稱為界面活性。脂肪酶具有底物特異性和反應條件溫和 的優點。本發明人利用脂肪酶對雨生紅球藻粗提物蝦青素酯進行水解，最終得到了一種在 溫和條件下進行酶解的策略，可提高雨生紅球藻蝦青素的收率。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的水解雨生紅球藻中蝦青素酯，獲得蝦青素單體的方 法。本發明製備蝦青素單體的方法是將蝦青素酯用脂肪酶水解得到游離蝦青素單體。所述脂肪酶優選為鹼性脂肪酶，更優選為來自Penicillium cyclopium var. albus的鹼性脂肪酶。所述蝦青素酯可以是來自雨生紅球藻的蝦青素酯，在本發明實施例中蝦青素酯是 雨生紅球藻粗提物油劑，其天然左旋蝦青素可達5%。
可將雨生紅球藻粗提物油劑經乳化劑乳化後，再用脂肪酶水解。所述乳化劑可以 是非離子型乳化劑，優選為吐溫80。乳化劑的加入量以使得油劑能夠充分乳化為宜。例如， 吐溫80的加入量宜為雨生紅球藻粗提物油劑重量的1 3倍。上述脂肪酶按照2 12U/i! g總類胡蘿蔔素加入，優選每微克總類胡蘿蔔素加入 4 10U脂肪酶。上述水解反應可以在pH6. 0 8. 0的磷酸鹽緩衝液中進行，於150 200rpm、25 30°C下反應5 7小時即可。進一步可以用薄層層析(TLC)、高效液相色譜(HPLC)和質譜(MS)對水解產物進行 檢測鑑定。本發明提供了一種新的水解雨生紅球藻中蝦青素酯而得蝦青素單體的方法。採用 本發明所述的方法，蝦青素單體回收率達63. 2%。本方法操作簡單，只需要一步反應再經提 取即得到目的產物，節省能耗，也可在一定程度上避免因長時間反應導致的蝦青素損失。


圖1脂肪酶水解蝦青素酯的TLC檢測；其中，Lanel 蝦青素標準品(Sigma)； Lane2 未加酶液的反應底物；Lane3 加酶液振蕩反應7h的反應產物。圖2脂肪酶水解蝦青素酯的HPLC檢測；圖2a 水解前底物的HPLC檢測；其中峰2 為游離蝦青素，峰8-22為蝦青素酯；圖2b 加酶水解7h產物的HPLC檢測；其中峰6為游離 蝦青素，峰16-25為蝦青素酯。圖3TLC法回收的游離蝦青素的質譜檢測。圖3a 用TLC法從反應體系中回收的 游離蝦青素的質譜檢測；圖3b 蝦青素標準品(Sigma)的質譜檢測。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。本發明中涉及到的百分號「 ％」，若未特別說明，是指質量百分比；但溶液的百分 比，除另有規定外，是指溶液100ml中含有溶質若干克；液體之間的百分比，是指在20°C時 容量的比例。實施例IPeniciIlium cyclopium var. albus鹼性脂肪酶酶液的製備以 Penicillium cyclopium var. albus (CGMCC 3. 4041)鹼性脂肪酶的 cDNA 為 模板，根據GenBank中該酶的基因序列(GenBank登錄號為AF274320. 1)設計引物(P1 gaattcgcaactgctgacgccgct, P2 :gcggccgtcagctcagatagccaca),進行 PCR 擴增。從 PCR 產 物中回收目的條帶，並連接到載體pMD18-T-Simple上(購自TaKaRa公司)；再用限制性內 切酶SnaBI和Not 1分別對pMD18-T-alip和pKIC9K進行雙酶切，然後對目的片段進行回 收，用T4連接酶將其連接，得到表達質粒pPIC9K-alip。用限制性內切酶Sal I酶切載體 PIC9K-alip，然後用乙醇沉澱的方法濃縮線性化片段，電擊法轉化巴斯德畢赤酵母GS115 感受態細胞，轉化後塗布不含組氨酸的基本培養基MD平板。平板在30°C培養2-3天後，將 長出的轉化子經無菌水懸浮後稀釋至105個細胞/毫升懸浮液，塗至不同G418抗性的YPD 平板，採用G418濃度梯度篩選巴斯德畢赤酵母高拷貝轉化子，通過酵母菌落PCR法鑑定正 確整合的轉化子，再通過搖瓶誘導培養，選取其中酶活最高的一株進行下面的產酶發酵實
將重組Penicillium cyclopium var. albus鹼性脂肪酶基因的巴斯德畢赤酵母接 種於含有25ml BMGY培養基(1%酵母粉，2%蛋白腖，甘油)的250ml三角瓶中，於30°C， 180rpm搖床培養至OD6tltl為6. 0左右，再轉接到裝有50ml BMMY培養基(1%酵母粉，2%蛋 白腖，1. 0%甲醇，1. 34%無胺基酸酵母氮源，100mmol/l磷酸緩衝液，pH 7. 0的500ml三角 瓶中，相同培養條件繼續培養，每24小時補加100%甲醇於培養基至終濃度為1.0%，誘導 表達2天。每隔一定的時間取樣，測量其細胞密度(0D_)和胞外的脂肪酶的酶活。當酶活 達到170U/ml時不再上升時，收集發酵液，8000rpm，4°C，離心lOmin，取上清，4°C保存，用於 以下的酶解反應。實施例2乳化物製備及酶解反應條件優化 取0. Ig雨生紅球藻蝦青素粗提物油劑(天然左旋蝦青素5%油劑，購自荊州天然 蝦青素有限公司)於研缽中，加入0.5 5倍質量的吐溫80，研磨乳化，並加0. IM磷酸鈉緩 衝液(pH5. 0 8. 0)定容至IOml ；以每微克總類胡蘿蔔素加入2 12U脂肪酶的量加入乳 化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH5. 0 8. 0的磷酸鈉緩衝液至總體積IOml ；30°C,180rpm 振蕩反應，每隔l_2h取樣，用TLC及HPLC檢測，反應至12h停止。結果表明，吐溫80按照雨生紅球藻粗提物油劑重量的1 3倍加入可有效乳化， 但由於TweenSO量多會增加提取液丙酮的用量，出於經濟因素考慮，優選TweenSO量為雨生 紅球藻粗提物油劑重量的1倍。脂肪酶按照2 12U/y g總類胡蘿蔔素加入可以有效水 解，優選每微克總類胡蘿蔔素加入4 IOU脂肪酶，水解5 7小時即可。水解反應可在 pH6. 0 8. 0的磷酸鹽緩衝液中進行，其中pH7. 0的條件下反應較佳。實施例3蝦青素酯的水解取0. Ig雨生紅球藻蝦青素粗提物油劑(購自荊州天然蝦青素有限公司)於研缽 中，加入1倍質量的吐溫80，研磨乳化，並加0. IM磷酸鈉緩衝液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克總類胡蘿蔔素加入4U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH7. 0的磷酸 鈉緩衝液至總體積IOml ；28°C，150rpm振蕩反應7小時，蝦青素得率為63. 2%。反應結束 後，加入與樣品同體積的丙酮，室溫條件下用漩渦振蕩器振蕩30s，再加入等體積的正己烷， 上述同樣方法振蕩30s，12000rpm，離心lmin，取上清用於TLC和HPLC檢測。實施例4蝦青素酯的水解取0. Ig雨生紅球藻蝦青素粗提物油劑(購自荊州天然蝦青素有限公司)於研缽 中，加入1倍質量的吐溫80，研磨乳化，並加0. IM磷酸鈉緩衝液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克總類胡蘿蔔素加入8U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH7. 0的磷酸 鈉緩衝液至總體積IOml ；28°C，180rpm振蕩反應6小時。蝦青素得率為63. 0%。反應結束 後，加入與樣品同體積的丙酮，室溫條件下用漩渦振蕩器振蕩30s，再加入等體積的正己烷， 上述同樣方法振蕩30s，12000rpm，離心lmin，取上清用於TLC和HPLC檢測。實施例5蝦青素酯的水解取0. Ig雨生紅球藻蝦青素粗提物油劑(購自荊州天然蝦青素有限公司)於研缽 中，加入1倍質量的吐溫80，研磨乳化，並加0. IM磷酸鈉緩衝液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克總類胡蘿蔔素加入12U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1Μ，ρΗ7. 0的磷酸 鈉緩衝液至總體積IOml ；28°C，200rpm振蕩反應5小時。蝦青素得率為63. 1%。反應結束
5後，加入與樣品同體積的丙酮，室溫條件下用漩渦振蕩器振蕩30s，再加入等體積的正己烷， 上述同樣方法振蕩30s，12000rpm，，離心lmin，取上清用於TLC和HPLC檢測。實施例6產物的TLC、HPLC及MS檢測產物用等體積的丙酮和正己烷的混合液進行提取，12000rpm，離心lmin，取上清， 用於TLC和HPLC檢測(l)TLC檢測方法採用5%檸檬酸對矽膠板進行噴霧酸化處理，70°C乾燥lh ；選用正己烷和丙酮 (4 1)為展層劑，點樣後在層析缸中展層15min。蝦青素單體及蝦青素酯具有鮮豔的紅色， 易於觀察判斷；另取標準蝦青素樣品(購自Sigma公司)10mg，定溶於100ml 二氯甲烷和甲 醇的混合液(1 4)中，作為正對照。如圖1所示，大部分蝦青素酯被降解為蝦青素單體。(2) HPLC 檢測方法色譜柱反相C18柱(北京創新通恆)，內徑4. 6mm,長度250mm ；流動相乙腈、乙 酸乙酯和水(63 30 7)，流速lml/min，檢測波長470nm，柱溫35°C。配置蝦青素標準品 (Sigma)製作標準曲線。其結果見圖2。可見，加酶反應後，蝦青素酯含量變少，游離蝦青素
含量升高。蝦青素得率為反應後所得蝦青素單體的質量與反應前加入反應體系中的蝦青素 酯的質量的比值。(3) MS 檢測用丙酮和正己烷提取酶解後的產物，取上層吹氮濃縮，TLC分離。根據標準品遷移 位置回收產物中的單體條帶，丙酮洗脫後，12000rpm,離心lOmin，取上層，0. 45 u m濾膜過 濾，進行質譜分析(LCQ Deca XP Thermo Finngian，San Jose，CA)。質譜條件為噴射電壓 4. 5kv，毛細管溫度300°C，正離子檢測，質譜儀在m/z = 400-800的範圍內進行掃描。其檢 測結果見圖3。回收的游離蝦青素樣品分子量為596. 7 (M-1)，與蝦青素標準品的分子量一 致，證明是同一物質。
權利要求
一種製備蝦青素單體的方法，其是將蝦青素酯用脂肪酶水解得到游離蝦青素單體。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述脂肪酶為鹼性脂肪酶。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述脂肪酶來自Penicilliumcyclopium var. albuso
4.如權利要求1 3任一項所述的方法，其特徵在於，所述蝦青素酯來自雨生紅球藻。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述將雨生紅球藻粗提物油劑經乳化劑乳 化後，用脂肪酶水解。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述乳化劑為吐溫80。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述吐溫80的加入量為雨生紅球藻粗提物 油劑重量的1 3倍。
8.如權利要求1 3任一項所述的方法，其特徵在於，所述脂肪酶按照2 12U/μ g總 類胡蘿蔔素加入。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述水解反應在pH6.0 8. 0的磷酸鹽緩衝 液中進行，於150 200rpm、25 30°C下反應5 7小時。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，將雨生紅球藻粗提物油劑與吐溫80按照重 量比1 1 3混合，充分乳化，加入0. 1ΜρΗ6. 0 8. 0的磷酸鹽緩衝液，按照每微克總類 胡蘿蔔素加入4 IOU總類胡蘿蔔素，於150 200rpm、25 30°C下反應5 7小時。全文摘要
本發明提供了一種新的製備蝦青素單體的方法，其是將蝦青素酯用脂肪酶水解得到游離蝦青素單體。採用該方法蝦青素單體回收率達63.2％。本方法操作簡單，只需要一步反應再經提取即得到目的產物，節省能耗，也可在一定程度上避免蝦青素在長時間反應過程中的損失。本發明為酶法從雨生紅球藻粗提物中獲取蝦青素單體的工業化應用奠定了基礎。
文檔編號C12P23/00GK101892281SQ20101023998
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者關國華, 關菲菲, 李穎, 王珍芳, 王貴利, 趙瑩瑩 申請人:中國農業大學