產蝦青素海洋紅酵母ys-185及其蝦青素的製造方法

2023-06-02 15:11:11

專利名稱：產蝦青素海洋紅酵母ys-185及其蝦青素的製造方法
技術領域：
本發明涉及海洋微生物領域，特別是涉及高產蝦青素海洋紅酵母YS-185及其蝦 青素的製造方法。
背景技術：
微生物是海洋生物的重要成員，而且海洋微生物的代謝類型極其多樣化，可以完 全在人工控制條件下以驚人的速度生長繁殖，且海洋微生物種源極其豐富，未知者眾多，變 異性大，容易選育出高產菌株，所以海洋微生物是當今世界獲取未知菌株及其高產活性物 質的新來源，尤其是為食品工業、藥物工業提供可持續發展的廣闊的途徑，然而由於海洋獨 特的環境，包括高鹽、高壓、低營養、低溫等，造就了海洋微生物有別於陸生微生物的許多特 異性，因而從中發現新型生物活性物質，為人類利用，已成為自然科學中相當活躍的研究領 域之一。 蝦青素(3， 3' - 二羥基-13 ， 13 '-胡蘿素4， 4' - 二酮)是一種非維生素A源的酮 式類胡蘿蔔素。擁有豔麗的紅色及極強的色素沉積能力，最初在歐美一些發達國家是作為 色素被用做水產業的餌料添加劑。蝦青素具有很強的抗氧化性，動物實驗表明它有抑制腫 瘤發生，增強免疫功能等多方面的生理作用，作為功能性色素在水產業，醫藥，食品，化妝品 等行業有著廣闊的應用前景。 目前市場上蝦青素主要通過化學合成，主要用途還是作為魚類飼料添加劑，但化 學合成比較困難，由荷蘭的帝斯曼公司控制，商品名為麗素粉紅，蝦青素含量為5_10%，幾 乎佔有整個蝦青素市場。目前為止美國食品衛生管理局(FDA)不準任何化學合成新產品進 入保健食品市場。 天然蝦青素存在於動植物及微生物中，儘管提取來源廣泛，但含量極低。如在 蝦、蟹的廢殼中的含量只有約80ug/g。法夫酵母(Phaffia rhodozyma)中含量一般在 1500-5000ug/g之間，在淡水單細胞綠藻-雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)中， 蝦青素的含量可達10000-40000ug/g，被認為是自然界中天然蝦青素含量最高的生物。天 然蝦青素的工業化生產，目前也主要是採用法夫酵母的工業發酵和雨生紅球藻的大規模養 殖來進行的，例如已實現了工業化生產，美國紅星公司(3000-4000g/t乾酵母)及Igene Biotechnology Inc等，由於生產成本及技術難度高，天然蝦青素的產量有限，國際市場上 的價格很高，這也一定程度上制約了天然蝦青素的應用。 能夠產生蝦青素的微生物菌株並不多。目前，國內外主要利用紅髮夫酵母生產蝦 青素。Yamane等人指出，紅髮夫酵母被普遍使用的主要原因是由於其所產生的類胡蘿蔔素 物質中蝦青素是主要的一種成份以及生產過程較易控制。 一些文獻也已報導其他微生物 菌株。但有些菌生長較慢且蝦青素含量低，無工業應用前景。在一些文獻中提到的菌株盡 管能產生較高的蝦青素含量，如深紅酵母(Phodotorala rubra)、粘紅酵母(Rhodotorula glutins)、黃桿菌(Flavobacterium spp) CF—6。等，但沒有見到詳細的研究報告。
微生物細胞內蝦青素的生物合成基本上由它們的遺傳特性所控制，通過誘變育種技術，改變微生物的遺傳特徵。得到高產蝦青素的微生物菌株。 Girard等對紅髮夫酵母(Phaffia rhodozyma)進行誘變處理，發現從無色到紅 色的誘變突變菌株。分析突變菌株的蝦青素合成中間產物，可以發現，番茄紅素環化形成 P _胡蘿蔔素這一步驟不會受到誘變處理的影響，但誘變處理能影響到其他的步驟，即誘變 處理主要影響P-胡蘿蔔素合成之前的步驟。 但是，微生物胞內蝦青素的積累也受各種環境因子的影響，會隨發酵培養基的改 變而改變。

發明內容
本發明目的在於從豐富的海洋微生物資源中選育出新的高產蝦青素的菌株，為我
國食品、藥物工業提供可持續發展的新途徑，經發明人長期從事海洋微生物的開發研究，開
發提供高產蝦青素海洋紅酵母YS-185及其蝦青素的製造方法。 本發明提供的高產蝦青素海洋紅酵母YS-185是從海洋中選育獲得的高產蝦青素 海洋紅酵母YS-185 (簡稱海洋紅酵母YS-185)，該海洋紅酵母YS-185於2007年6月9日保 藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M207077。
海洋紅酵母YS-185培養製備 將海洋紅酵母YS-185培養於產生蝦青素的培養基中在搖床中發酵培養，其中搖 床轉速為120-284r/分，優選為180_280r/分，更優選這200r/分，培養基的碳原為葡萄糖、 果糖及麥芽糖等，優選為葡萄糖，其濃度20-80mg/L，更優選為20mg/L，氮源為硫酸銨、尿 素、氯化銨，蛋白腖、酵母膏、白蛋白、豆餅粉或豆渣等，優選為硫酸銨，其質量濃度3-20mg/ L，更優選為5-10mg/L，起始pH為5-8，接種量3-12質量體積％，培養溫度18-22。C，培養時 間60-90小時。取發酵液離心洗滌(去離子水)3次，凍幹機上避光冷凍乾燥後得海洋紅酵 母YS-185菌體粉末，-2(TC避光保存。
色素粗品的製備與純化 取上述製備得到海洋紅酵母菌體粉末，加入二甲基亞碸(每克菌粉加入10-30ml， 優選為20ml 二甲基亞碸)置於35-45。C，優選為4(TC水浴條件下破壁20-50min，優選為 30min，加入等體積丙酮萃取至菌體呈白色，離心(1500r/min， 10min)取上清液，室溫避光 氮氣吹乾濃縮得色素粗製品，_201:避光保存。 取色素固體粗製品丙酮溶解後，上自裝60矽膠層析柱(40 63iim， Qingdao HaiyangChemical Ltd.)進行線性梯度洗脫純化。洗脫液A液(石油醚)，B液(丙酮0 50min，0質量X 50質量％ )進行線性梯度洗脫純化，收集紅色色素樣品，氮氣回流乾燥。 色素成分的分析 取一定量的色素固體，丙酮溶解配製成溶液，UV3000紫外分光光度計上300
600nm光區掃描，以蝦青素標準品(98%， Sigma)為對照，結果如圖1所示 圖1可看出色素溶液吸收峰和蝦青素標準品吸收峰吻合，在480nm處有最大吸收
峰，確定其主要成分為4下青素。 色素成分的薄層層析 薄層層析結果如圖2所示，經初步純化後的樣品點樣於矽膠板展開後有兩明顯的 斑點，第一個斑點顏色較淺，Rf為0. 81 ;第二個斑點顏色較深Rf為0. 42，和蟲下青素標準品Rf
4值0.39相比較接近，可進一步判斷該斑點主要成分為蝦青素。薄板展開後在暗箱中晾乾， 用刀片刮下和蝦青素比移值相近條帶，-20°〇，暗處保存。
色素成分的高壓液相色普分析與鑑定 取經少許上述刮取製備得到的色素樣品，甲醇溶解後，上高壓液相色譜進行分析
鑑定，結果如圖3、圖4所示，色素樣品在7. 52min保留時間上有最大吸收峰，和蝦青素標準
品在7. 51min保留時間上有最大吸收峰相比較，可進一步確定海洋紅酵母YS-185所產色素
固體中主要成份為蝦青素；同時取經初步純化後的樣品進高壓液相色譜分析，通過峰面積
計算得蝦青素佔總色素含量為67. 5% 。 本發明提供的蝦青素製造方法包括下列步驟 ①海洋紅酵母YS-185菌體培養 將海洋紅酵母YS-185培養於產生蝦青素的培養基中在搖床中發酵培養，在搖床 中搖床轉速為120-284r/分，優選為180_280r/分，更優選這200r/分，培養溫度18_22°C， 培養時間60-90小時，起始pH為5-8，接種量3-12體積％ ，其中培養基的碳原為葡萄糖、果 糖及麥芽糖等，優選為葡萄糖，其濃度20-80mg/L，更優選為20mg/L，氮源為硫酸銨、尿素、 氯化銨，蛋白腖、酵母膏、白蛋白、豆餅粉或豆渣等，優選為硫酸銨，其質量濃度3-20mg/L，更 優選為5-10mg/L。取發酵液離心洗滌(去離子水)3次，凍幹機上避光冷凍乾燥後得海洋紅 酵母YS-185菌體粉末。
②色素粗品製備 取步驟①得到的海洋紅酵母YS-185菌體經發酵培養的菌體粉末經二甲基亞碸於 4(TC水浴條件下破壁處理20-50分，優選為30分，後加入等體積丙酮萃取至菌體呈白色，離 心(例如1200-3000r/分，10-20分取上清液，濃縮得色素粗製品，-2(TC避光保存。若根據 需要可進行進一步純化。 ③將色素固體粗製品丙酮溶解後，上60矽膠層析柱進行線性梯度洗脫純化。洗脫 液A液為石油醚，B液為丙酮0 50分，O質量％ 50質量％進行線性梯度洗脫純化，收 集紅色色素樣品，氮氣回流乾燥。 按照本發明提供的蝦青素的製造方法中，起始海洋紅酵母YS-185是好氧菌，所產 色素主要成分為蝦青素，它是在細胞內合成為細胞內物質，在微生物細胞內積累除受微生 物菌海洋紅酵母YS-185本身影響以外，也會受到各種環境因子的影響，例如會隨著培養基 如發酵培養基的改變而變化，還受諸如溫度、PH和溶氧等因素的影響。 在步驟①的海洋紅酵母YS-185菌體培養中，因為海洋紅酵母菌YS-185好氧微 生物，可以通過搖床轉速來調節種子培養液及發酵培養液中的溶氧量，搖床轉速一般為 120-280r/分，隨著轉速提高，生物量和蝦青素合成量都呈上升趨勢，當搖床轉速為180轉/ 分以上上升趨向平穩，優選取180-280r/分，更優選為200r/分。對於發酵罐進行間歇發酵 中，發酵罐罐壓和攪拌速率以及空氣通氣量等決定溶氧量，溶氧量越高，酵母進入對數生長 期的時間越早，低溶氧條件下，細胞進入對數生長期較為緩慢，通常採用30-60質量％，優 選為40-60質量％ ，更優選為45質量％的溶氧量。 在發酵培養中，所述培養基包括碳源、氮源及無機鹽等，碳源是構成微生物的主要 成分，是細胞內貯藏物質和生成各種代謝物來源，同時也是微生物生長中的主要能量來源， 碳源通常採用例如蔗糖、葡萄糖、果糖及麥芽糖等，優選為葡萄糖作為培養基中的碳源。葡萄糖質量濃度20-80g/L，優選20g/L。 氮源有有機氮源及無機氮源，常用為硫酸銨、尿素、氯化銨，蛋白腖、酵母膏、白蛋
白、豆餅粉或豆渣等，優選為硫酸銨，其質量濃度3-20mg/L，更優選為5-10mg/L，其生物量
和蝦青素產量達到高值，當硫酸銨銨質量濃度超過10g/L時，海洋紅酵母菌YS-185菌株和
生物量和蝦青素產量都有下降趨勢，更優選為5g/L硫酸銨作為培養基的氮源。 培養基中的H+和0H—能對微生物代謝產生影響，它作用於胞外的可解離的弱酸，形
成易透過細胞膜的游離態進入胞內再作用於參與代謝的各種酶類，從而影響菌體的生長合
產物合成，通常採用起始pH值為5-8，優選起始pH為6. 0。 接種量3-12體積％，隨著接種量的增加，生物量及蝦青素含量均呈上升趨勢，但 當接種量大於8體積％時，兩者增加不太明顯，優選接種量在5體積％ 12體積％。
反應溫度對發酵過程中產生的生物量及蝦青素影響隨著發酵溫度的上升，細胞生 物量及蝦青素產量都不斷的增加，溫度2(TC後兩者均有下降，通常採用反應溫度18_22°C 優選20°C。 在發酵過程中培養基中的碳源如葡萄糖和氮源如硫酸銨以及pH值不斷變化，由 於環境pH值能影響細胞膜所帶的電荷及培養基中營養物質的離子化作用程度，從而影響 微生物海洋紅酵母YS-185菌株(體)的生長與生產。例如葡萄糖在24h左右幾乎消耗完 全，且在78h以前蝦青素含量一直處在不斷上升的過程中，78h後因細胞出現大量自溶現象 而導致生物量及蝦青素產量下降，所以在發酵罐中發酵培養不斷補加營養物質，同時控制 培養最佳PH，可採用各種補加方式例如指數流加模式、恆pH葡萄糖-氨水流加，優選恆pH 葡萄糖_氨水流加所得細胞乾重和蝦青素的量最大。 本發明提供的海洋紅酵母YS-185及其蝦青素的製造方法的特點 本發明提供的海洋紅酵母YS-185是穩定高產蝦青素的海洋微物菌種，蝦青素產
量和生物量分別高達到60. 5mg/ml和66. 5 y g/ml，繼陸源紅髮夫酵母生產蝦青素又一個可
與此比美的一個新的海洋源高產蝦青素的菌種及其蝦青素製造方法。將成為生物合成法生
產天然蝦青素的一個新途徑。 本發明提供的由海洋紅酵母YS-185產蝦青素_紅色色素在一般理化環境作用下 有著良好的穩定性，及較高的抗脂質過氧化特性，可用作高檔化妝品及高級食品和飼料添 加劑。


圖1色素樣品及蝦青素標品的掃描圖譜
圖2初步純化色素樣品薄層層析分析
圖3蟲下青素標準品HPLC圖
圖4樣品HPLC圖
具體實施例方式
本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護範圍並非限於下列實 施例 實施例1
海洋紅酵母YS-185培養製備 將海洋紅酵母YS-185的株體挑起菌苔一環接種於裝有30ml種子培養基的250mL 三角瓶中，2(TC、200r/min條件搖床培養18h得種子液，以此種子液10mL接種於裝有90mL 種子液的500mL三角瓶中，2(TC、200r/min條件搖床培養18h得二級種子液，再以5體積％ 接種量接種到發酵罐中(10L罐裝有6L發酵培養基)於2(TC條件下培養，採用恆pH葡萄 糖-氨水流加方式保持溶氧45 ±2質量％、葡萄糖起始濃度3. 0質量％， pH4. 8-5. 0。得細 胞乾重60. 5mg/ml蝦青素產量66. 5 y g/ml，
色素粗品的製備與純化 取上述製備得到酵母菌體粉末，加入二甲基亞碸(每克菌粉加入20ml 二甲基亞 碸)置於4(TC水浴條件下破壁30min，加入等體積丙酮萃取至菌體呈白色，離心(1500r/ min， 10min)取上清液，室溫避光氮氣吹乾濃縮得色素粗製品，_20°0避光保存。
取色素固體粗製品丙酮溶解後，上自裝60矽膠層析柱(40 63iim， Qingdao HaiyangChemical Ltd.)進行線性梯度洗脫純化。洗脫液A液(石油醚)，B液(丙酮0 50min，0質量X 50質量％ )進行線性梯度洗脫純化，收集紅色色素樣品，氮氣回流乾燥。
色素成分的薄層層析及高壓液相色譜分析，紅色色素樣品主要成分為蝦青素，蝦 青素佔總色素含量為67. 5質量％ 。
權利要求
一種產蝦青素海洋紅酵母YS-185是從海洋中選育獲得的產蝦青素海洋紅酵母YS-185，於2007年6月9日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNOM207077。
2. —種由權利要求l的產蝦青素海洋紅酵母YS-185產蝦青素的製造方法，其特徵在於 包括下列步驟① 發酵培養將海洋紅酵母YS-185培養於產蝦青素的培養基中在搖床中發酵培養，培養溫度 18-22°C ，培養時間60-90小時，起始pH為5-8，接種量3-12體積％ ，其中培養基的碳原為葡 萄糖、果糖及麥芽糖，其濃度20-80mg/L，氮源為硫酸銨、尿素、氯化銨，蛋白腖、酵母膏、白蛋 白、豆餅粉或豆渣，其質量濃度3-20mg/L ;取發酵液離心洗滌，凍幹機上避光冷凍乾燥後得 菌體粉未；② 色素粗品製備取步驟①得到的海洋紅酵母YS-185菌體經發酵培養的菌體粉末經二甲基亞碸於 35-45t:水浴條件下破壁處理20-50分鐘，後加入等體積丙酮萃取至菌體呈白色，離心取上 清液，濃縮得色素固體粗製品，_201:避光保存；③ 將步驟②色素固體粗製品丙酮溶解後，上60矽膠層析柱進行線性梯度洗脫純化。洗 脫液A液為石油醚，B液為丙酮0 50分鐘，O 50質量％進行線性梯度洗脫純化，收集 紅色色素樣品，氮氣回流乾燥。
3. 根據權利要求2的蝦青素的製造方法，其特徵在於所述步驟①中所述培養基中碳源 為葡萄糖，其濃度為20mg/L ;氮源為硫酸銨，其質量濃度為5-10mg/L ;所述破壁處理用=甲 基亞碸量這10-30ml/克菌體粉末。
全文摘要
本發明涉及一種從海洋中選育得到的高產蝦青素海洋紅酵母YS-185，保藏在中國武漢CCTCC，保藏號為CCTCC NOM207077；以及由該海洋紅酵母YS-185發酵培養製造蝦青素的方法，由該海洋紅酵母YS-185生產的蝦青素為天然蝦青素，可廣泛應用於高級化妝品、食品和飼料添加劑。
文檔編號C12P23/00GK101705193SQ20091023846
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月20日 優先權日2009年11月20日
發明者劉均忠, 孫謐, 王偉, 王躍軍, 郝建華 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所