通過XRCC1和ERCC2上的三個SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒的製作方法
2023-06-02 10:52:56
專利名稱：通過XRCC1和ERCC2上的三個SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測肺癌易感性的試劑盒，通過同時檢測X 射線交錯互補修復基因1 (X-ray repair cross- -complementing gene 1, XliCCl)的單核苷酸多態性位點(SNP) 和切除修復複合物2(Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2, ERCC2)的兩個不同單核苷酸多態性位點(SNPs)來預測個體對肺癌的易感性。
背景技術：
原發性支氣管肺癌，簡稱肺癌，為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴重威脅人類健康和 生命的疾病。腫瘤細胞源於支氣管黏膜或腺體，常有區域性淋巴結和血行轉移，早期常有刺激性咳嗽、痰 中帶血等呼吸道症狀，病情進展速度與細胞的生物特性有關。
半個世紀以來,世界各國肺癌的發病率和病死率都有明顯增高趨勢。世界衛生組織(WHO)2000年報告 1997年全世界死於惡性腫瘤的共706.5萬人，佔死亡人數的12.6%，其中肺癌佔惡性腫瘤死亡的19%,居 惡性腫瘤死因的第一位。我國19卯 1992年的抽樣調査顯示，在城市人口的腫瘤死亡中，肺癌由原來的 第4位上升為第1位，農村上升最快的也是肺癌。雲南錫礦的肺癌發病率在954 1959年間為28.02/10 萬，1960 1969年間為197.87/10萬,1970 1979年間上升到219.10/10萬，這在全世界也是罕見的。英國 著名腫瘤學家R.Peto預言如果我國不及時控制吸菸和空氣汙染，到2025年我國每年肺癌將超過100萬， 成為世界第一肺癌大國。
病因和發病機制迄今尚未明確。 一致認為肺癌的發病與下列因素有關①吸菸(包括主動吸菸和被動 吸菸)②職業致癌因子，己被確認的致人類肺癌的職業因素包括石棉、無機砷化合物、二氯甲醚、鉻及 其化合物、鎳、氡、芥子氣、氯乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環芳烴、菸草的加熱產物等；③空氣汙染 (包括室內小環境和室外大環境汙染)； 電離輻射；⑤飲食與營養，美國紐約和芝加哥開展的前瞻性人 群觀察的結果說明，食物中天然維生素A類、e胡蘿蔔素的攝入量與十幾年後癌症的發生呈負相關，其中 最突出的是肺癌； 其他，美國癌症學會將結核列為肺癌的發病因素之一。有結核病者患肺癌的危險性是 正常人群的10倍。其主要組織學類型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黃麴黴)、機體免疫功能低下、 內分泌失調以及家族遺傳等因素，對肺癌的發生可能也起一定的綜合作用。
近年研究表明，肺癌的發生與某些癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關。已經證明的幾個癌基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、機制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 pl6和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細胞肺癌中均有過度表達。 非小細胞肺癌中則常可見ras族基因的過度表達。這些深入的研究將為基因預防和治療肺癌提供理論基礎。
SNP (single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態性標記，是一類基於單鹼基變異引起的DNA 多態性，被遺傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性， 包括單鹼基轉換、顛換，以及單鹼基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態性標記，佔 大約90%。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是複雜疾病的易感 性和對環境因素、藥物反應的差異。
XRCC1位於第19號染色體19ql3.2-13.3位置，全長32.3kb, mRNA全長2087bp,共有17個外顯子， 編碼634個胺基酸的蛋白。XRCC1編碼的蛋白對因電離輻射和烷基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效 的修復作用。XRCC1編碼的蛋白與DNA連接酶川、聚合酶e 、多聚ADP核糖轉移酶交互作用，參與DM 的鹼基切除修復(Base Excision R印air, BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點的多態性，與 癌症發生有密切的關係。與XRCC1相關的癌症主要有乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食管癌、胃癌、結 腸癌、胰腺癌、肺癌等。
rs25487是位於第19號染色體XRCC1基因上的一個G/A多態，引起XRCC1基因編碼的蛋白第399 個胺基酸由Arg變為Gln。 Arg399Gln位於第10號外顯子，XRCC1蛋白BCRTI區域。在世界人群中的該 多態的頻率分布，G佔0.72， A佔0,28左右。中國人群中的分布G為0.68， A為0.32。分子生物學研究表
明，XRCC1基因上第399號胺基酸Ai -Gln的替代加強XRCC1蛋白與DNA-致癌物加合物的結合能力， 從而影響個體的腫瘤易感性。通過大量對於大規模人群的肺癌病例對照研究，XRCC1的399貧基酸突變 位點在做單因素分析時與肺癌發生相關。ERCC2,位於第19號染色體19ql3.3位置，共有23個外顯子，基因全長19.0kb, mRNA全長2355bp， 編碼含761個胺基酸的蛋白。由ERCC2編碼的蛋白參與轉錄偶聯的核苷酸切除修復，它可識別與修復結 構無關的大範圍的損傷，如大的加合物和胸腺嘧啶二聚體，並且是基本轉錄因子複合物BTF2/TFIIH的一 個組成成分。該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，並且屬於RAD3/XPD解旋酶亞家族。ERCC2的 功能缺失導致基本轉錄因子複合物不能正確識別DNA損傷位點，從而使鹼基切除修復無法正確進行，導 致DNA上的致癌損傷積累。ERCC2基因的突變或者失活可能導致的疾病包括癌症、著色性幹皮病、毛 發硫營養不良、柯凱因氏綜合症。rsl3181是位於第19號染色體ERCC2基因第23號外顯子段Lys751Gln的T/G多態。世界人群中的頻 率約為T:G =0.798: 0.202,雜合度0.322,中國人群中的頻率約為T:G =0.91: 0.09。目前的多項研究表明， Lys751Gln的氣基酸替代位於ERCC2蛋白C-末端部，這個位點的多態性與肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮膚 癌等疾病有關。ERCC2 Lys751Gln位點的多態現象與肺癌特別是肺鱗癌的發生存在顯著關聯。rsl799793是位於第19號染色體ERCC2基因第10號外顯子段Asp312Asn的G/A多態。世界人群中 的頻率約為G:A=0.778:0.222,中國人群中的頻率約為G:A=0.94:0.06。目前的多項研究表明，該位點的多 態會導致ERCC2參與構成的轉錄因子複合物的性能發生弱化，從而使得對DNA損傷修復的能力下降，轉 錄因子的能力也同時發生下降，導致一系列諸如肺癌，前列腺癌等疾病的發生。ERCC2Asp312Asn多態性 與肺癌特別是肺鱗癌發生有顯著關聯，該位點的多態現象被認為是中國人群中肺癌遺傳易感因素之一。國內外的大量的關聯分析表明，XRCC1基因上的rs25487號SNP位點基因型為A時肺癌的發生機率增 加；ERCC2基因上rsl3181號SNP位點基因型為G時肺癌的發生機率增加；ERCC2基因上rsl799793號SNP 位點基因型為A時肺癌的發生機率增加。這三個SNPs位點的多態性可用於評估個體對肺癌的易感性。發明內容基於XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的 rsl799793號SNP位點的多態性可用於評估個體對肺癌的易感性的基礎上，本發明提供一種檢測肺癌易感 性的試劑盒。該試劑盒包括:檢測XRCC1基因上的rs25487號SNP位點的特異性引物對及特異性炎光探針、檢測ERCC2 基岡上的rsl3181號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、檢測ERCC2基因上的rsl799793號SNP 位點的特異性引物對及特異性螢光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、 去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的 rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能特異性擴增出耙位點的DNA片段。 設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: l和2所示 序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對。 特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限於這三對引 物。本試劑盒中所述的特異性螢光探針是指針對XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的 rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能通過螢光定量PCR技術特異性檢 測出這三個SNPs位點肺癌易感基因型的探針。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地， 試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 7、 8和9所示序列的Taqman探針。特異性螢光探針可用常規的合成技術 進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特異性螢光探針不限於這H條探針，所有可用於螢光定 PCR檢測XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的 rsl799793號SNP位點的探針均在本發明範圍內。本發明試劑盒的組分和含量包括1M1 10 X螢光定霣PCR反應緩衝液，0. 1^1 25raM dNTP混合液，0. 5nl 25mM MgCl2溶液，0.02nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶，20nM特異性引物對(六條)各0.225^1,IO一特異性螢光探針(三條)各0.25^1，去離子水4.28nl。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:螢光定量PCR反應使用可檢測肺癌易感性的螢光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和螢光探針:有義引物l:5'-TMCTGGCATCnCACTTCT -3'卿IDNO:1)Tm值為反義引物l:5，- TCCAGATTCCTGGCATTGC -3'(SEQIDNO:2)Tm值為58'C有義引物2:5,- ACTCAGGAGTCACCAGGAA -3'(SEQIDNO:3)Tm值為58'C反義引物2:5'-TCTGTTCTCTGCAGGAGGA -3'(SEQIDNO:4)Tm值為58*C有義引物3:5'- ATCAAAGAGACAGACGAGCA -3，(SEQIDNO:5)Tm值為58'C反義引物3:5'-TCAGGAAGCCCAGGAAAT -3'(SEQIDNO:6)Tm值為5化炎光探針1:5'-CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3'(SEQIDNO:7)Tm值為64,C炎光探針2:5'- AATCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3'(SEQIDNO:8)Tm值為66'C炎光探針3:5，- TGCCCMCGAAGTGCTGCAG -3'(SEQIDNO:9)Tm值為64'C有義引物1，反義引物1和螢光探針1特異地針對檢測XRCC1基因上的rs25487號SNP位點多態性； 有義引物2,反義引物2和螢光探針2特異地針對檢測ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點多態性；有義 引物3,反義引物3和螢光探針3特異地針對檢測ERCC2基因上rsl799793號SNP位點多態性。螢光定量PCR反應體系為總體積10^1，包含濃度為20ngAxl的DNA模板2pl、 1^1 10 X螢光定量PCR 反應緩衝液、0. 1^1 25mM dNTP混合液、0. 5pl 25mM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20一的有義引物1、 2和3各0.225nl、 20nM的反義引物l、 2和l 3各0. 225^1、 10nM的螢光探針l、 2和 3各0.25nl，去離子水4.28nl。在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50'C、 2分鐘，95'C、 IO分鐘，進行60個循環的 95'C、 30秒，6(TC、 l分鐘。反應結束後在ABI7900型螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量。步驟3: SNP基因型分析將螢光定量PCR儀上顯示的最終樣品螢光量和正常對照相對比,炎光探針1最終的炎光信號明顯高於 正常對照，說明被檢測DNA的XRCCl基因上的rs25487號SNP位點基因型攜帶有A型，為肺癌易感型炎
光探針2最終的螢光信號明顯高於正常對照，說明被檢測DNA的ERCC2基因上rsl3181號SNP位點基因型 攜帶有G型，為肺癌易感型螢光探針3最終的螢光信號明顯高於正常對照，說明被檢測DNA的ERCC2基 因上rsl799793號SNP位點基因型攜帶有A型，為肺癌易感型。實施例2.指導人們主動預防肺癌的服務目前在上海主健生物工程有限公司已經開展了這項服務。 步驟l: DNA提取對被檢測者進行服務前諮詢，由被檢測者籤署知情同意書，填寫生活飲食習慣問巻調査表。依照取樣 盒中的指示使用口腔採樣拭進行口腔上皮細胞取樣，採用矽膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。 步驟2:基因分型檢測使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上 rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上rsl799793號SNP位點同時進行螢光定量PCR檢測，確定這三個SNPs 位點的基因型。步驟3:指導人們主動預防肺癌通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導報告。基因 檢測報告詳細說明了被檢測者肺癌易感程度的髙低以及患病的概率大小。個體化健康指導報告以被檢測者 的基閃分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問巻調査結果，評估被檢測者肺痛遺傳易感的相對風險。 同時制定出針對於被檢測者的個:性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進建議等，並 為被檢測者普及預防肺癌的健康知識。
序列表上海主健生物工程有限公司<120〉通過XRCC1和ERCC2上的三個SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒 〈212〉 〈213>120 DNA人工序列引物 ■〉 1taactggcat cttcacttct 2 19 DNA <213〉人工序列引物 <■ 2tccagattcc tggcattgc 3 19 〈212> DNA 人工序列〈220〉〈223〉引物 <400〉 3aCtC3gg8gt C3CC3gga3201919200610116663. 5〈210〉 4 19 <212〉 DNA <213〉人工序列引物 4tctgttctct gcagg鄉a 5 20 <212〉 DNA <213〉人工序列<220〉引物 〈德5atC犯3g柳C8g3Cg3gC3 6 18 DNA 人工序列<223〉引物 < 6tcetgg卿cc C3ggaast 7 18 DNA 人工序列<220〉探針
〈400〉 7cggctgccct cccag鄉 18<210〉 <211〉 <212〉 822 DNA人工序列〈220〉〈223〉探針 ■〉 8aatctgctct atcctctgca gc 22<210〉 〈211〉 920 DNA人工序列探針 9tgcccaacga agtgctgcag 20
權利要求
1.一種檢測肺癌易感性的試劑盒，包括同時檢測XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rs13181號SNP位點和rs1799793號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特徵在於:所述的特異性引物對是指針對XRCC1基因上的rs25487 號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和rsl799793號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含 XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和rsl799793號SNP位點的引 物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性螢光探針是指針對XRCC1基因上的 rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和rsl799793號SNP位點而設計，能通過螢光 定量PCR技術特異性檢測出這三個SNPs位點肺癌易感基因型的探針。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性引物對選自具有SEQ ID N0: l和2所 示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物 對。
5. 根據權利耍求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性螢光探針選自具有SEQ ID NO: 7、 8 和9所示序列的Taqman探針。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒的組分和含量包括ljil IOX螢光定量PCR反 應緩衝液，0. lpl 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCl2溶液，0, 02pl (5units/nl) Taq DM聚合酶， 20nM特異性引物對(六條)各0.225^1， 10nM特異性螢光探針(三條)各0.25nl，去離子水4.28nl。本 試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rs13181號SNP位點和rs1799793號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、用於螢光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測分析個體的XRCC1基因和ERCC2基因上的SNPs位點基因攜帶型來預測個體對肺癌的易感性。
文檔編號C12R1/68GK101153345SQ20061011666
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月28日 優先權日2006年9月28日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司