甘薯莖尖的包埋玻璃化超低溫保存方法

2023-06-02 11:06:21 1

專利名稱：甘薯莖尖的包埋玻璃化超低溫保存方法
技術領域：
本發明涉及甘薯種質保存及植株再生的技術，特別涉及甘薯莖尖的包埋玻璃化超 低溫保存方法，屬於甘薯組織培養技術領域。
背景技術：
長期以來，甘薯的很多品種在推廣生產後迅速退化，喪失新品種的優良種性，對 甘薯的產量與品質造成極大影響。因此，如何較好地收集和保存甘薯種質資源逐漸受到 重視。目前，常用的保護植物種質資源的方法都有著各自的局限性。眾多的試驗表明，包 埋玻璃化法超低溫冷凍保存植物種質技術是較為理想的一種方法。它的功能及優點如 下1、長期保持種質活力，2、凍存材料後的遺傳穩定性好，3、同時處理大量材料、處理後 材料恢復生長快、對材料毒害小及出芽率高，4、操作簡單等優點。現有的包埋玻璃化超低 溫保存技術 A,參見 D. Hira, A. Sakai, Simplified cryopreservation of sweet potato [Ipomoeabatatas(L.)Lam. ]by optimizing conditions for osmoprotection,Plant Cell Reports, (2003)21 :961_9660目前已有包埋玻璃化法應用於蘋果、葡萄、馬鈴薯以及木薯等多種植物上的報導。 但至今未發現有中國甘薯品種用包埋玻璃化超低溫方法保存的應用。本發明中的甘薯莖尖的包埋玻璃化超低溫保存技術，根據對國內品種進行研究， 提出一種適合中國甘薯品種的超低溫保存技術。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明提供一種適合中國甘薯品種的甘薯莖尖包埋玻璃化 超低溫保存方法及冷凍後植株再生的技術。術語說明MS(murashige skoog)是組織培養常用基本培養基，屬於本領域公知術語。MS固 體培養基可用於誘導愈傷組織，也可用於胚、莖段、莖尖及花葯的培養，其液體培養基用於 細胞懸浮培養。MS培養基的無機養分的數量和比例比較合適，可滿足植物細胞在營養上和 生理上的需要。PVS (plant vitrification solution)玻璃化溶液即植物玻璃化溶液，是處理植 物樣品的複合高滲溶液。本發明的技術方案如下一種甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，步驟如下1.從甘薯的試管苗上取1 1.5mm甘薯莖尖；將甘薯莖尖移入到濃度為3克 /IOOrnl的海藻酸鈉和0. 2M甘油的無鈣離子的MS溶液中，室溫浸泡5 20秒；2.將含有11. lg/1 CaCl2,2M甘油、0. 2M蔗糖的MS溶液在冰塊中預冷15 25分 鍾，將步驟1的甘薯莖尖連同浸泡溶液一起加入其中，形成直徑為0. 5-0. 8cm甘薯莖尖小 球；將甘薯莖尖小球依次移入以下預培養基中進行預培養
將小球移入盛有50ml預培養基I溶液的三角瓶中，預培養基I溶液配方為 MS+30g/l蔗糖+lg/Ι酪蛋白胺基酸，搖床培養24小時，25 28°C，60 90rpm ；將小球移入盛有50ml預培養基II溶液的三角瓶中，預培養基II溶液配方為 MS+0. 3M蔗糖，搖床培養16小時，25 28°C，60 90rpm ；將小球移入盛有50ml預培養基III溶液的三角瓶中，預培養基III溶液配方為 MS+1. 6M蔗糖+2M甘油，搖床培養3小時，25 28°C，60_90rpm。製得預培養好的甘薯莖尖小球。3.將上述預培養好的甘薯莖尖小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中， 25°C 培養 90 120min。4.將步驟3處理過的甘薯莖尖小球移入2ml規格的超低溫管中，每個管中裝8_10 個小球，置入液氮中冷凍保存。當需要將冷凍保存的甘薯莖尖恢復培養時，繼續進行以下步驟5.將步驟4得到的盛有小球的超低溫管從液氮中取出，迅速移到38°C的水浴鍋 中，解凍2-4分鐘，將小球放入卸載溶液中，室溫，放置20-25min。卸載溶液組成為1. 2M蔗糖+MS，pH5. 8。6.將步驟5得到的小球移入盛有25ml成活培養基的培養皿中，成活培養基配方 為:MS+0. 5mg/l 6-苄氨基嘌呤+lmg/1赤黴素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH5. 8，25°C黑暗 培養3天；然後在24-28°C培養7天，並保持每天16小時的30001ux光照培養和每天8小 時的黑暗培養。得成活小球。7.將上述成活小球移入盛有25ml再生培養基的培養皿中，在24_28°C培養並保持 每天16小時的30001UX光照，培養成苗，每隔三周，將成苗小球轉移到盛有新配的再生培養 基的培養皿中。所述再生培養基配方為MS+2. 5mg/l赤黴素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH 5. 8。待成苗小球的苗長達0. 4-0. 6cm時，轉入MS固體培養基中生根。上述步驟3中PVS玻璃化溶液組成為MS+30克/IOOml甘油+15克/IOOml乙二 醇 +15 克 /IOOml 二甲基亞碸(DMSO) +0. 4M 蔗糖，pH 5. 8。本發明方法中所述甘薯為中國甘薯品種，進一步優選的是濟薯18或濟徐23。本發明方法中步驟4冷凍保存60min以上，可以長久保存。本發明的優良效果如下1、本發明確定了中國甘薯品種的保存方法，經試驗證明以前公開報導的技術都不 適合我國的甘薯品種的種質保存，特別是濟薯18和濟徐23甘薯品種。本發明方法超低溫 冷凍後的成活率80-90 %，現有技術僅為30-35 %。2、本發明以中國甘薯品種的甘薯苗為材料，無需預培養將其莖尖進行包埋。在不 同濃度的蔗糖MS溶液中進行包埋後預培養，在玻璃化溶液脫水處理90分鐘，超低溫冷凍保存。3、本發明方法在超低溫冷凍後的恢復培養後，不經過愈傷組織直接出芽形成完整 的小植株，可以進行大量的無性繁殖。4、本發明的方法所用材料來源於國內甘薯品種，操作簡單、有效，長期凍存後材料 恢復生長快。


圖1中發亮白色的小球為成活小球，實施例1步驟6。圖2為恢復培養後生成的小植株，苗長達0. 5cm,實施例1步驟7。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明。實施例中使用的MS培養基為上海源葉 生物科技有限公司產品。配方如表1表1. MS 配方 實施例1 中國甘薯品種為濟薯18一種甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，步驟如下1.從甘薯(濟薯18)的試管苗上取1. 5mm甘薯莖尖；將甘薯莖尖移入到3% (克 /ml)海藻酸鈉和0. 2M甘油的無鈣離子的MS溶液中，室溫浸泡15秒；2.將含有11. lg/1 CaCl2、2M甘油、0. 2M蔗糖的MS溶液在冰塊中預冷20分鐘，將步驟1的甘薯莖尖連同浸泡溶液一起加入其中，形成直徑為0. 5-0. 6cm甘薯莖尖小球；將甘 薯莖尖小球依次移入以下預培養基中進行預培養將小球移入盛有50ml預培養基I溶液的三角瓶中，預培養基I溶液配方為 MS+30g/l蔗糖+lg/Ι酪蛋白胺基酸，搖床培養24小時，25°C，90rpm ；將小球移入盛有50ml預培養基II溶液的三角瓶中，預培養基II溶液配方為 MS+0. 3M 蔗糖，搖床培養 15-16 小時，25°C，90rpm ；將小球移入盛有50ml預培養基III溶液的三角瓶中，預培養基III溶液配方為 MS+1. 6M蔗糖+2M甘油，搖床培養3小時，25°C，90rpm。製得預培養好的小球。3.將上述預培養好的小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25°C培養 90min，PVS玻璃化溶液組成為MS+30% (克/ml)甘油+15% (克/ml)乙二醇+15% (克 /ml) 二甲基亞碸(DMSO)+0. 4M 蔗糖，pH 5.8。4.將步驟3處理過的小球移入2ml規格的超低溫管中，每個管中裝8_10個小球， 置入液氮中，保持1小時；當需要將冷凍保存的甘薯莖尖恢復培養時，直接進行以下步驟5.將盛有小球的超低溫管從液氮中取出，迅速移到38°C的水浴鍋中，解凍3分鐘， 將小球放入卸載溶液中，室溫，放置20min。卸載溶液組成為1. 2M蔗糖+MS，pH5. 86.將小球移入盛有25ml成活培養基的培養皿中，成活培養基配方為MS+0. 5mg/ 16-苄氨基嘌呤+lmg/1赤黴素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH5. 8，25°C黑暗培養3天；然後 在25°C培養7天，並保持每天16小時的30001UX光照培養和每天8小時的黑暗培養。得成 活小球。7.將成活小球移入盛有25ml再生培養基的培養皿中，在25°C培養並保持每天16 小時的30001UX光照，培養成苗。每隔三周，將小球轉移到新鮮的盛有再生培養基的培養皿 中。所述再生培養基配方為:MS+2. 5mg/l赤黴素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH 5. 8。待苗長達0. 5cm時，轉入MS固體培養基中生根。實施例2 中國甘薯品種為濟徐23步驟如實施例1所述，所不同的是1.從甘薯(濟徐23)的試管苗上取1. Omm甘薯莖尖；將甘薯莖尖移入到3% (克 /ml)海藻酸鈉和0. 2M甘油的無鈣離子的MS溶液中，室溫浸泡10秒；2.將含有11. lg/1 CaCl2、2M甘油、0. 2M蔗糖的MS溶液在冰塊中預冷20分鐘，將 步驟1的甘薯莖尖連同浸泡溶液一起加入其中，形成直徑為0. 6-0. 8cm甘薯莖尖小球；將甘 薯莖尖小球依次移入以下預培養基中進行預培養將小球移入盛有50ml預培養基I溶液的三角瓶中，預培養基I溶液配方為 MS+30g/l蔗糖+lg/Ι酪蛋白胺基酸，搖床培養24小時，28°C，60rpm ；將小球移入盛有50ml預培養基II溶液的三角瓶中，預培養基II溶液配方為 MS+0. 3M 蔗糖，搖床培養 15-16 小時，28°C，60rpm ；將小球移入盛有50ml預培養基III溶液的三角瓶中，預培養基III溶液配方為 MS+1. 6M蔗糖+2M甘油，搖床培養3小時，28°C，60rpm。
製得預培養好的小球。3.將上述預培養好的小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25°C培養 120min，PVS玻璃化溶液組成為MS+30% (克/ml)甘油+15% (克/ml)乙二醇+15% (克 /ml) 二甲基亞碸(DMSO)+0. 4M 蔗糖，pH 5.8。4.同實施例1中步驟4。5.同實施例1中步驟5。6.將小球移入盛有25ml成活培養基的培養皿中，成活培養基配方為MS+0. 5mg/ 16-苄氨基嘌呤+lmg/1赤黴素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH5. 8，28°C黑暗培養3天；然後 在28°C培養7天，並保持每天16小時的30001UX光照培養和每天8小時的黑暗培養。得成 活小球。7.將成活小球移入盛有25ml再生培養基的培養皿中，在28°C培養並保持每天16 小時的30001UX光照，培養成苗。每隔三周，將小球轉移到新鮮的盛有再生培養基的培養皿 中。所述再生培養基配方為:MS+2. 5mg/l赤黴素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH 5. 8。待苗長達0. 5cm時，轉入MS固體培養基中生根。實施例1-2的實驗結果如下

注現有技術 A 為 D. Hira, A. Sakai, Simplified cryopreservation of sweet potato[Ipomoea batatas (L.)Lam. ]by optimizing conditions for osmoprotection, Plant Cell Reports, (2003)21 :961_966。
權利要求
一種甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，步驟如下(1)從甘薯的試管苗上取1～1.5mm甘薯莖尖；將甘薯莖尖移入到濃度為3克/100ml的海藻酸鈉和0.2M甘油的無鈣離子的MS溶液中，室溫浸泡5～20秒；(2)將含有11.1g/l CaCl2、2M甘油、0.2M蔗糖的MS溶液在冰塊中預冷15～25分鐘，將步驟1的甘薯莖尖連同浸泡溶液一起加入其中，形成直徑為0.5 0.8cm甘薯莖尖小球；將甘薯莖尖小球依次移入以下預培養基中進行預培養將小球移入盛有50ml預培養基I溶液的三角瓶中，預培養基I溶液配方為MS+30g/l蔗糖+1g/l酪蛋白胺基酸，搖床培養24小時，25～28℃，60～90rpm；將小球移入盛有50ml預培養基II溶液的三角瓶中，預培養基II溶液配方為MS+0.3M蔗糖，搖床培養16小時，25～28℃，60～90rpm；將小球移入盛有50ml預培養基III溶液的三角瓶中，預培養基III溶液配方為MS+1.6M蔗糖+2M甘油，搖床培養3小時，25～28℃，60 90rpm；製得預培養好的甘薯莖尖小球；(3)將上述預培養好的甘薯莖尖小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25℃培養90～120min；(4)將步驟(3)處理過的甘薯莖尖小球移入2ml規格的超低溫管中，每個管中裝8 10個小球，置入液氮中冷凍保存。
2.如權利權利要求1所述的甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於步驟 (3)中PVS玻璃化溶液組成為MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞碸+0.4M蔗糖，pH 5. 8 ；百分比是質量體積比，單位克/ml。
3.如權利權利要求1所述的甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於將冷凍 保存的甘薯莖尖恢復培養時，繼續以下步驟(5)將步驟⑷得到的盛有小球的超低溫管從液氮中取出，迅速移到38°C的水浴鍋中， 解凍2-4分鐘，將小球放入卸載溶液中，室溫，放置20-25min ；卸載溶液組成為1. 2M蔗糖+MS, ρΗ5· 8 ；(6)將步驟(5)得到的小球移入盛有25ml成活培養基的培養皿中，成活培養基配方為 MS+0. 5mg/l 6-苄氨基嘌呤+lmg/1赤黴素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，ρΗ5· 8，25°C黑暗培 養3天；然後在24-28°C培養7天，並保持每天16小時的30001ux光照培養和每天8小時 的黑暗培養，得成活小球；(7)將上述成活小球移入盛有25ml再生培養基的培養皿中，在24-28°C培養並保持每 天16小時的30001UX光照，培養成苗，每隔三周，將成苗小球轉移到盛有新配的再生培養基 的培養皿中。所述再生培養基配方為MS+2. 5mg/l赤黴素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH 5. 8。待成苗小球的苗長達0. 4-0. 6cm時，轉入MS固體培養基中生根。
4.如權利權利要求1所述的甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於所述甘 薯品種為濟薯18或濟徐23。
全文摘要
本發明涉及一種甘薯莖尖的包埋玻璃化超低溫保存方法，以中國甘薯品種的甘薯苗為材料，無需預培養將其莖尖進行包埋。在不同濃度的蔗糖MS溶液中進行包埋後預培養，在玻璃化溶液脫水處理90-120分鐘，超低溫冷凍保存；冷凍後的恢復培養，不經過愈傷組織直接出芽形成完整的小植株，可以進行大量的無性繁殖。本方法所用材料來源於國內甘薯品種，操作簡單，長期凍存後材料恢復生長快。
文檔編號A01H4/00GK101904305SQ20101022849
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者侯夫雲, 張海燕, 張立明, 李愛賢, 王慶美, 董順旭, 解備濤 申請人:山東省農業科學院作物研究所