Fas配體融合蛋白的製作方法

2023-06-02 08:41:31

專利名稱：Fas配體融合蛋白的製作方法
本項發明涉及一種Fas配體蛋白-糖磷脂融合蛋白以及它的應用，例如用於預防組織或器官移植物排斥反應。
Fas配體(FasL)是一種分子量為40kDa的II型膜蛋白，屬於腫瘤壞死因子(TNF)/神經生長因子受體家族，在未成熟的胸腺細胞、激活的T細胞和肝臟、卵巢、心臟等的非淋巴細胞中表達。T.Suda等公開了大鼠FasL cDNA的核苷酸序列和推定的胺基酸序列〔《細胞》(Cell)，1993年12月17日，75卷(6)期，1169-1178頁〕。第1號序列(SEQID NO.1)列出了人類FasL的胺基酸序列〔Takahashi等，《國際免疫學》(Intl.Immunol)，第6卷，1567-1574頁，1994年〕。完整蛋白質的胺基酸序列按照第1至281順序進行了編號。
已知FasL與某些組織細胞表面表達的Fas受體結合後，導致這些表達Fas抗原(有時也稱為Fas受體)的細胞凋亡。Mark.R.Alderson等指出活化的成熟的T細胞表面表達Fas抗原〔《實驗醫學雜誌》(《J.Exp.Med》)，1995年1月，第181期，71-76頁〕。
而且，已知表面表達人FasL的內皮細胞通過與細胞毒T淋巴細胞(CTL)的Fas抗原相作用，導致這些T細胞凋亡。T細胞參與器官的移植物排斥反應，因此希望使侵犯移植器官或組織的T細胞特異地凋亡。
根據本項發明的一些特別發現，本發明首先提供了1.一種hFas配體蛋白-糖磷脂融合蛋白這種蛋白將其脂類尾部與細胞(如內皮細胞)膜表面結合，由此將FasL蛋白呈遞在細胞膜表面，如與存在於其它細胞上的Fas受體結合，從而導致這些細胞的凋亡。
這裡所說的名詞「hFasL蛋白」包括全長的人Fas配體蛋白，即膜結合蛋白(由胞質區、跨膜區、細胞外區組成)，及保持了人Fas配體的Fas受體結合特性和凋亡誘導特性的縮短的人Fas配體蛋白和其功能相當的變體。
hFasL蛋白特徵性地至少包括了人FasL配體的細胞外區。因此，hFasL蛋白優選包含第2號序列(SEQID NO.2)或其功能相當的變體所示的胺基酸序列中第103至281位(包括端值)，更優選第106至281位，最優選第136至281位胺基酸序列組成的多肽，或其功能相當部分、或其功能相當變體。
在本說明書中，人Fas配體的功能相當蛋白指滿足下列條件者(i)它具有與全長人Fas配體蛋白或下文實施例中敘述的hFasL-GPI融合蛋白相似的與人Fas受體結合的特性；(ii)當存在於hFasL-糖磷脂融合蛋白中時，在例如實施例3敘述的體外試驗中，它能夠以與下文實施例中敘述的hFasL-GPI融合蛋白相似的程度，誘導攜帶Fas受體的細胞凋亡，如淋巴瘤L1210-Fas細胞。
同樣在本說明書中，人Fas配體蛋白或其部分蛋白的變體是指與第1號序列的第1至281位中的人Fas配體胺基酸序列或其相應部分至少具有70％同源性的蛋白質，優選至少80％，或更優選至少90％，尤其是至少具有95％的同源性。此處，胺基酸序列與另一胺基酸序列之間至少有70％的同源性是指當兩個序列最佳排列對比、將胺基酸序列中的空缺、插入、或非保守性替代記為非一致/非保守替代殘基時，其在相似位置具有至少70％的一致或保守替代的胺基酸殘基。
進一步在本說明書的上下文中，保守性替代可以在下列幾組胺基酸組內進行(i)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；(ii)穀氨酸和天冬氨酸；(iii)精氨酸和賴氨酸；(iv)天冬醯胺和穀氨醯胺；(v)異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和蛋氨酸；(vi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
然而，應認識到保守性替代可在序列的重要區域進行，如活性位點、結合位點和起始密碼子編碼的蛋氨酸部位。
根據本發明，hFasL蛋白通過C-端直接或間接與糖磷脂共價結合，優選是一種磷脂醯肌醇的糖基化形式，稱為「糖基-磷脂醯肌醇」(下文中稱為「GPI」)，如M.P.Lisanti等在《膜生物學雜誌》(J.Membrane Biol.)，117卷，1-10頁，1990年中所述。
在一具體實施方案中，hFasL蛋白的C-端胺基酸直接或經過一個連接子通過醯胺鍵與乙醇胺連接，而乙醇胺則通過磷酸二酯鍵與不同組分和結構的寡糖結合。這個聚糖的末端單糖是非N端乙醯化的葡糖胺，其在C-1位與磷脂醯肌醇的肌醇環上C-6位羥基連接。這個分子可進一步包含一個甘油脂殘基作為膜結合區。
根據本發明，GPI可以為自然條件下存在的GPI結合蛋白中存在的任何一種結構，例如水解酶如鹼性磷酸酶或乙醯膽鹼酯酶、哺乳類動物抗原如Thy-1，Thy-3，Ly-6，CD14或CD16、原生類動物如各種錐體蟲表面糖蛋白、細胞粘附分子如LFA-3或者補體分子如DAF中的。
在一具體實施方案中，本項發明的FasL-糖磷脂融合蛋白由下面結構式I表示
m是0或1；n是0或1；R是直接健或一個連接子；Ra是直接鍵或者來自選擇的GPI信號的一個或多個胺基酸殘基；R1和R2分別獨立地為一個脂肪族烴基，優選是C4-24烷基和C4- 24鏈烯基，更優選C12-22烷基或C12-22鏈烯基；R3是H或2Manα1；當m是1時，R4是H，
或者4βGalNAc1當m是0時，R4是Galα1-6Galα1-2Manα1；FasL是人FasL，或其保持Fas結合特性的一個片段或者一個功能相當的變體；Gal是半乳糖，Man是甘露糖，GalNAc是N-乙醯半乳糖胺，GlcNH2則是非N-乙醯化的葡糖胺。
R可以是一個本領域中用來在融合蛋白中將C-端羧基與氨基相連的連接子。選擇的連接子最好使蛋白質具有伸展性，特別對於蛋白質的細胞外區。這樣的連接子的例子包括如一段非極性胺基酸單位的序列，如3-6個非極性胺基酸單位，優選是甘氨酸和/或丙氨酸單位，如-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-包含hFasL蛋白與糖磷脂部分間的連接子的本發明融合蛋白包括在下文中表述的「hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白」和「hFasL蛋白-GPI融合蛋白」範圍內。
本發明的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，可用化學合成方法製備，任選以適當保護的形式，化學連接hFasL蛋白與糖磷脂部分然後需要時除去保護基團。
然而，較方便的是通過重組DNA技術製備hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白。該方法包括含hFasL蛋白胺基酸序列的蛋白表達和表達蛋白的翻譯後修飾生成hFasL蛋白-糖磷脂融合體。在這種方法中，被表達的蛋白質特徵性含有一段信號序列，如C-端胺基酸序列，作為被表達蛋白翻譯後修飾生成hFasL蛋白-糖磷脂融合體的引發劑和位點。
因此，本發明進一步也提供了一種核苷酸序列，例如DNA序列，它編碼含有hFasL蛋白胺基酸序列和蛋白翻譯後修飾以得到相應的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白(特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白)的信號序列的蛋白質。
這種DNA序列最好適於在真核細胞或細菌中表達。
因此，本項發明也提供了真核細胞或細菌的表達載體，它包含的DNA序列編碼含hFasL蛋白胺基酸序列和蛋白翻譯後修飾以得到相應的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白(特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白)的信號序列的蛋白質。
除了編碼蛋白質的序列外，典型的表達載體還具有適宜的表達控制序列，包括合適的啟動子、操縱基因、核糖體結合位點和其它適當的調節序列。表達載體還包含1個或更多可供選擇的標記物。可以通過各種刺激誘導啟動子，如暴露於一種化學物質或者改變溫度。啟動子還具有細胞特異性或者細胞周期的特異性。
啟動子可以是大腸桿菌中有活性的任何一種，如噬菌體T7啟動子，表達載體可以是質粒。在大腸桿菌中表達可用R1和CO1-E1質粒來源的載體。包含病毒啟動子的載體如pXMT2或pXMT3可以用於真核細胞的表達。本發明也提供了用hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白之編碼序列或以上敘述的表達載體轉化的細菌或真核的宿主細胞。任何合適的細菌宿主都可以使用，最好是大腸桿菌。合適的真核宿主細胞是瞬時表達的COS細胞和穩定表達的CHO細胞。
糖磷脂(如GPI)部分的附加就是翻譯後修飾，通常發生於宿主細胞的內質網(EP)。糖磷脂(例如GPI)附加的結果是從新生蛋白羧基端去掉一個疏水序列。這個疏水序列通常是翻譯後修飾信號序列的必要部分。一對CAS(裂解/附加部位)，如Ser-Ser，Ser-Gly，Ser-Ala，與疏水的羧基端結合通常提供了糖磷脂(如GPI)附加的必要的最小序列。在FasL蛋白序列和翻譯後修飾信號序列之間最好有5-20個，更優選7-14個胺基酸的間隔。疏水功能區在內質網上能夠方便地減慢或暫時終止新生蛋白穿過內質網膜，使GPI部分的附加能夠進行。
假如被表達的蛋白質包含了一個合適的翻譯後修飾信號序列，在大多數的宿主細胞中糖磷脂如GPI的附加都可以進行。
編碼含hFasL蛋白胺基酸序列和翻譯後修飾信號序列的蛋白質的DNA，可以通過hFasL蛋白編碼序列與編碼信號序列的DNA序列的適當連接而得到。
在具體實施方案中，hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用包括以下步驟的方法製備a)通過聚合酶將2個重疊的寡核苷酸補平，產生一個GPI附加信號序列。每個寡核苷酸的5』端和3』端都包含了限制酶切位點。聚合產物克隆到表達載體如pXMT3中。b)以含人Fas-配體cDNA的克隆為模板，擴增人Fas-配體的細胞外區，如包含人Fas-配體序列第136至281位胺基酸的片段。設計的3』寡核苷酸可編碼所需的連接子和3』端的限制酶切位點。5』端最好不含有限制酶切位點，但需與人Fas蛋白的信號序列有數個核苷酸如14個核苷酸重疊。人Fas信號序列可通過聚合酶把2個寡核苷酸補平後產生。非編碼的寡核苷酸可以數個核苷酸，如10-20個，最好是22個核苷酸與Fas-配體重疊。Fas-配體PCR產物以及補平的Fas信號序列典型地通過重疊PCR技術剪切、消化並克隆到包含GPI信號序列的質粒中。相應的hFasL-GPI構建物如

圖1所示。
hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白的純化和分離可採用目前任何已知的方法，只要不引起融合蛋白實質的降解。例如，親和層析、免疫親和層析、高壓液相層析(HPLC)和快速蛋白液相層析(FPLC)均為適用方法。
本發明的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用於誘導Fas介導的細胞死亡，特別是T淋巴細胞死亡。在移植組織的細胞表面攜帶了外來的組織相容性抗原時，這些抗原激活受體的細胞毒T細胞，經過連續的激活過程破壞了供體細胞。hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用於治療急性移植物排斥反應。常規治療急性移植物排斥反應的方法會嚴重抑制受體的免疫功能。hFasL蛋白-GPI融合蛋白則能夠特異性針對激活的T淋巴細胞，而不是免疫系統的所有T淋巴細胞，即針對攻擊移植組織或器官上表達Fas抗原的T淋巴細胞進行更特異地治療。
hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白還可用於治療慢性移植物排斥反應，包括自體移植和異體移植的排斥反應。
在另一具體實施方案中，本發明提供了2、將hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白引入組織或器官的內皮細胞的方法，該方法包括用純化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注器官，或與組織一起孵育。
3、一種誘導靶組織或器官的內皮細胞Fas介導死亡的方法，包括用純化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注器官，或與組織一起孵育。
4、一種預防或治療組織或器官自體或異體移植物排斥反應的方法，包括用純化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注供體的器官，或與供體的組織一起孵育。
根據以上3-4敘述的方法，本發明中的融合蛋白特別適於預止與急性或慢性、器官或組織、自體或異體移植物排斥反應有關的症狀，特別是移植的血管病變，如移植物動脈粥樣硬化。移植器官包括心臟、肺、心肺、肝臟、腎臟、胰腺(全部或部分的胰腺，如Langerhans島)、皮膚、角膜和骨髓。
本發明還可提供5、hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白在上述2-4敘述的任何方法中的應用；6、hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白用於製備用於上述2-4敘述的任何方法的藥物組合物的應用；7、用於上述2-4敘述的任何方法的組合物，其中包含hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白和一種或多種藥學上可接受的稀釋劑和載體。
下面給出的實施例將進一步說明而不是限制本發明。在本發明的精神內，可以作很多變動。實施例1 編碼hFasL-GPI融合蛋白的DNA的質粒構建和克隆通過Klenow聚合酶將2個重疊的寡核苷酸補平，產生一個來源於人CD16的GPI附加信號序列。5』端包含PstI和SpeI位點，3』端是EcoRI位點。聚合產物磷酸化(通過T4激酶)，凝膠純化並連接到PstI/EcoRI消化的pXMT3表達載體上。寡核苷酸如下Pst SpelGPI5′GTC ACT AGT TTG GCA GTG TCA ACC ATC TCA TCA TTC TCTCCA CCT GGG TAC CAA GTC TCT TTC TGC TTG GTG ATG GTA(SEQ ID No.3)EcoRIGPI3″GTC GAA TTC TCA AAT GTT TGT CTT CAC AGA GAA ATA TAGTCC TGT GTC CAC TGC AAA AAG GAG TAC CAT CAC CAA GCAGAA (SEQ ID No.4)以含人Fas-配體cDNA的克隆為模板，擴增人Fas-配體的細胞外區，其中包含了已發現的人Fas-配體序列的第136至281個胺基酸。設計的3』寡核苷酸(Fas4)編碼附加的6個甘氨酸基團，3』端還有SpeI位點。5』寡核苷酸(Fas3)不含有任何限制酶切位點，但與人Fas蛋白有14個核苷酸重疊。人Fas信號序列通過Klenow聚合酶把2個寡核苷酸(Fas1，Fas2)補平後產生。非編碼寡核苷酸有22個核苷酸與Fas-配體重疊。Fas-配體PCR產物以及補平物Fas信號序列通過重疊PCR技術剪切、凝膠純化、用PstI和SpeI消化並克隆到與上述同樣被消化的包含GPI信號序列的質粒中。寡核苷酸如下
FAS1TCT CTG CAG ATG CTG GGG ATC TGG (SEQ ID No.5)FAS2GGG TGG AGC AAC AGA CGT AAG AAC CAG AGG TAG GAG GGTCCA GAT GCC CAG CAT CTG CAG AGA (SEQ ID No.6)FAS3TTA CGT CTG TTG CTC CAC CCC CTG AAA AAA AGG AG(SEQ ID No.7)SpeIFAS4CAA ACT AGT GCC ACC ACC GCC TCC ACC GAG CTT ATA TAAGCC GAA AAA CG (SEQID No.8)整個構建物通過Pharmacia Biotech生產的T7測序試劑盒(產品目錄號27-168201)測序。實施例2 純化重組融合蛋白通過T.Suda和Nagata描述的方法，用Fas-Fc親和柱(或者抗FasL抗體親和柱)進行純化〔《實驗醫學雜誌》(J.Exp.Med)，1994年，179卷，873-879頁〕。得到內毒素游離融合蛋白。實施例3 hFasL-GPI在COS細胞中的瞬時表達9×105個細胞接種於60mm的平皿中，內含DMEM和10％FCS，置於37℃，5％CO2中孵化過夜。通過保護哺乳動物轉染系統(Promega公司)，細胞用6μg質粒DNA(hFasL-GPI)進行磷酸鈣轉染。如圖2所示，轉染36小時後用抗人Fas-配體第一單克隆抗體(NOK-1系，Pharmingen公司)和藻紅素標記的抗鼠IgG第二抗體，通過FACS作細胞分析。pXMT3模擬轉染COS細胞作為陰性對照，用包含人Fas-配體cDNA的構建物轉染的COS細胞作為陽性對照(圖3)。圖2 hFasL-GPI表達構建體瞬時轉染的COS細胞的FACS分析圖3 陽性和陰性對照使用本發明的hFasL-糖磷脂融合蛋白灌注的或孵育最好在4℃-37℃溫度下進行，持續2-20小時完成。可將hFasL-糖磷脂融合蛋白加到通常用於移植前保存供體組織或器官的溶液或製品中，如一種所謂的「威斯康星大學溶液」。另外，融合蛋白還可用在任選緩衝的鹽溶液中，如磷酸鹽緩衝鹽溶液，或者生理鹽水中。hFasL-糖磷脂融合蛋白的濃度不一，最好灌注或孵育溶液的濃度是10-40mg/ml。
本發明的hFasL-糖磷脂融合蛋白的實用性例如可按下述方法證明。體外試驗COS細胞瞬時轉染實施例1的構建物，或者編碼整個hFasL蛋白(沒有糖磷脂成分)的對照物構建物。這會導致通過跨膜區與細胞膜的結合併在細胞表面表達。比較上述細胞、天然COS細胞和與純化的hFasL-GPI一起孵育的COS細胞對Cr標記的淋巴瘤L1210和淋巴瘤L1210-FAS〔淋巴瘤細胞系SchulzM.等，《歐洲免疫學雜誌》，(Eu r.J.Immunol)25474-480，1995年〕的細胞凋亡效果。由於Fas-L介導的細胞凋亡作用，淋巴瘤L1210-Fas的細胞死亡數比轉染實施例1構建物的COS細胞明顯地高。體外試驗A。小鼠心臟灌注小鼠心臟用含有25mg/ml hFasL-GPI的威斯康星大學溶液(Eurocollins溶液)37℃下灌注8小時。心臟的石蠟切片用生物素化的hFasL抗體探測，以測定hFasL的包埋。B。血管化的異位心臟移植供體動物肝素化同時放血以後，切開氣管塞入冰塊。準備供體的心臟，結紮並且分離供體心臟的上腔靜脈、下腔靜脈、左肺動脈和右肺靜脈。結紮主動脈並且直接分離到在第一叉(右頸總動脈和鎖骨下動脈)被分開的支氣管幹部位。另外，通過支氣管殘端注入冷的肝素化鹽水。用實施例2的重組hFasL-GPI融合蛋白灌注器官。剩餘的肺靜脈結紮後，心臟移入冷鹽水中。
心臟植入到受體的腹腔靜脈用11/0 Ethilon(Ethicon，Norderstedt，德國)連續縫線，從支氣管幹到主動脈，右肺動脈到下腔靜脈施行端-邊吻合術。用6/0 Vicryl(Ethicon公司產品)的二塊敷料覆蓋創面，保暖直到動物完全甦醒。整個缺血時間在40-50分鐘內，其中25-35分鐘是4℃進行。吻合期間(10-15分鐘)，要保持移植物為冷的狀態。
移植以後，通過每日心跳的評定(觸摸)監控移植物的功能。心臟停跳為完全的移植物排斥反應。在全部試驗中，移植物排斥反應通過移植物的組織學檢查證實。與對照的動物(移植前未用hFasL-GPI灌注)比較，移植前用hFasL-GPI灌注的心臟功能顯著增強。
本發明的融合蛋白用於預防或治療移植物排斥反應時，可以與免疫抑制治療合併進行，例如在移植後給受體免疫抑制劑如環胞菌素A、環胞菌素G、FK506、來氟米物或其類似物、咪唑立賓、麥考酚酸、mycophenolate mofetil、免疫抑制性單克隆抗體例如白細胞受體如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、CTLA4、B7、CD45或CD58或它們的配體的單抗。
序列表(1)一般資料(i)申請者人(A)名稱Sandoz有限公司(B)街道Lichtstrasse 35(C)城市Basel(D)州BS(E)國家瑞士(F)郵政編碼CH-4002(G)電話061-324-2327(H)傳真061-322-7532(A)姓名Sandoz專利公司(B)街道Humboldtstrasse 3(C)城市Loerrach(E)國家德國(F)郵政編碼D-79539(A)名稱Sandoz-Erfindungen Verwaltungs-gesellschaft MBH(B)街道Brunner Strasse 59(C)城市維也納(E)國家奧地利(F)郵政編碼A-1230(ii)發明名稱Fas配體融合蛋白(iii)序列數8
(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，#1.25版(EPO)(2)有關SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度281個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(iii)反義無(vi)來源(A)物種人類(xi)序列描述SEQ ID No.1Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp1 5 10 15Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys20 25 30Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro35 40 45Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro50 55 60Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly65 70 75 80Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly85 90 95Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala100 105 110Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu115 120 125Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg130 135 140Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu145 150 155 160Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr165 170 175Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr180 185 190Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser195 200 205His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met210 215 220Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala225 230 235 240Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His245 250 255Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser260 265 270Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu275 280(2)有關SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度146個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(iii)反義無(vi)來源(A)物種人類(xi)序列描述SEQ ID No.2Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly1 5 10 15Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly20 25 30Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile35 40 45Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly50 55 60Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn65 70 75 80Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser85 90 95Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala100 105 110Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu115 120 125Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr130 135 140Lys Leu145(2)有關SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度78個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.3GTCACTAGTT TGGCAGTGTC AACCATCTCA TCATTCTCTC CACCTGGGTA CCAAGTCTCT 60TTCTGCTTGG TGATGGTA 78(2)有關SEQ ID NO4的資料(i)序列特徵(A)長度81個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型
(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.4GTCGAATTCT CAAATGTTTG TCTTCACAGA GAAATATAGT CCTGTGTCCA CTGCAAAAAG 60GAGTACCATC ACCAAGCAGA A 81(2)有關SEQ ID NO5的資料(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ IDNo.5TCTCTGCAGA TGCTGGGGAT CTGG 24(2)有關SEQ ID NO6的資料(i)序列特徵(A)長度63個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.6GGGTGGAGCA ACAGACGTAA GAACCAGAGG TAGGAGGGTC CAGATGCCCA GCATCTGCAG 60AGA 63(2)有關SEQ ID NO7的資料(i)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.7TTACGTCTGT TGCTCCACCC CCTGAAAAAA AGGAG 35(2)有關SEQ ID NO8的資料(i)序列特徵(A)長度50個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.8CAAACTAGTG CCACCACCGC CTCCACCGAG CTTATATAAG CCGAAAAAACG 50
權利要求
1.一種蛋白質，包含-人Fas配體蛋白(hFasL)，或縮短的人Fas配體蛋白或其功能相當的變體，它保持了人Fas配體蛋白與Fas受體結合、誘導細胞凋亡的特性，而且直接或間接地在其C-端連接-糖磷脂。
2.根據權利要求1的蛋白質，其中的糖磷脂是糖基-磷脂醯肌醇(GPI)。
3.根據權利要求1的蛋白質，其具有以下結構式I
m是0或1；n是0或1；R是一直接鍵或一個連接子；Ra是一直接鍵或來自選擇的GPI信號的胺基酸殘基；R1和R2分別是一個脂肪族烴基；R3是H或2Manα1；當m是1時，R4是H，
或4βGalNAc1當m是0時，R4是Galα1-6Galα1-2Manα1；FasL是如權利要求1中所定義的人FasL，Gal是半乳糖，Man是甘露糖，GalNAc是N-乙醯基半乳糖胺，GlcNH2則是非N-乙醯化的葡糖胺。
4.根據以上權利要求中任一項的蛋白質，其中的hFasL是一種含有hFasL第136至281位胺基酸序列的人可溶性多肽。
5.根據以上權利要求中任一項的蛋白質，其中的糖磷脂通過連接子與hFasL的C-端連接。
6.根據權利要求5的蛋白質，其中連接子是-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-。
7.編碼含hFasL蛋白的胺基酸序列和蛋白翻譯後修飾以得到權利要求1的蛋白質的信號序列的蛋白質的一段核苷酸序列。
8.製備權利要求1蛋白質的方法，包括a)任選以被保護的形式，化學連接hFasL蛋白與糖磷脂部分，如果需要則去除保護性基團，或者b)重組DNA方法，包括含hFasL蛋白胺基酸序列的蛋白表達和所表達蛋白的翻譯後修飾。
9.根據權利要求1的蛋白質用於製備一種預防或治療組織或器官自體或異體移植物排斥反應的藥物組合物的應用。
10.一種藥物組合物，包含權利要求1的蛋白質和一種或多種藥學上可接受的稀釋劑或載體。
全文摘要
一種蛋白質,包含:－人Fas配體蛋白(hFasL)或縮短的人Fas配體蛋白,或其功能相當的變體,它們保持了hFasL與Fas受體結合、導致細胞凋亡的特性,而且直接或間接地在其C－端連接－糖磷脂。它可以用於預防或治療組織或器官的移植物排斥反應。
文檔編號C07K7/00GK1202200SQ96198369
公開日1998年12月16日 申請日期1996年11月15日 優先權日1995年11月16日
發明者T·布勒 申請人:諾瓦提斯公司