一種富硒發酵蠶蛹及其製作方法與流程
2023-06-02 08:51:41 1
本發明屬於蠶蛹處理技術領域，涉及一種發酵蠶蛹，尤其涉及一種富硒發酵蠶蛹及其製作方法。
背景技術：
蠶蛹是繅絲業的副產品，營養豐富，其蛋白質含量高達50％-70％，胺基酸含量分別為：賴氨酸3.03％、色氨酸0.68％、蛋氨酸1.6％、胱氨酸3.31％，種類齊全，配比均衡，是一種優質、理想的動物性飼料蛋白源。
我國是養蠶大國，蠶蛹產量大，資源豐富。但是目前市場上，對繅絲蠶蛹的加工手段非常簡單、粗放，大都烘乾粉碎後即添加於飼料中使用，造成飼料適口性差，營養成分消化率低。
微生物發酵蠶蛹具有無汙染、有效性高等優點，已成為當前研究的熱點。目前微生物在蠶蛹加工應用中的應用大都集中在蠶蛹異味去除和提高蛋白質含量等方面，且經微生物處理後的蠶蛹仍然存在營養成分單一、蠶蛹品質不能得到充分的提高和改善等問題，這也大大限制了蠶蛹在在動物飼料生產中的應用。
硒(se)是生物體必需的微量元素之一，與動物生長性能、免疫功能及機體抗氧化性能有著密切關係。同時，硒可與多種有毒元素，如汞、鍋、鉛等形成不溶性物質，從而拮抗、緩解降低其毒性，對動物抵禦環境中的重金屬汙染起著重要作用。硒在自然界的存在方式分為兩種：無機硒和有機硒。有機硒的生物利用率要高於無機硒，容易被動物吸收利用。同時，有機硒安全係數高，不會對人和環境造成不良影響。因此，可以利用益生菌將無機硒轉化成有機硒，添加於飼料，以達到增強飼料品質、提高飼料利用率，增強動物生長性能的目的。
但是，目前在蠶蛹發酵處理技術領域中，並沒有使得蠶蛹富硒的技術方法。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種具有富硒功效的複合多功能蠶蛹及其製作方法，以製得兼具益生菌和富硒雙重功效的多功能蠶蛹。
為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
一種富硒發酵蠶蛹的製作方法，其特徵在於，包括如下步驟：
(1)、單株發酵菌液製備
1)、高富硒活性突變菌株選育：將熱帶假絲酵母candidatropicalis進行氮離子注入誘變，篩選出高富硒活性突變菌株；
2)種子培養液製備：將高富硒活性突變菌株接種在斜面培養基中進行培養，得到斜面菌株；將上述斜面菌株接種於種子培養基中進行振蕩培養，得到種子培養液；
3)發酵培養：將上述種子培養液接種至含有發酵培養基的發酵罐中進行發酵，在發酵產物中補加亞硒酸鈉，繼續發酵培養，收集發酵產物，得到高富硒活性突變菌株candidatropicalisahas17發酵菌液；
4)米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16單株菌發酵：將米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16分別單獨進行發酵，獲得米麴黴aspergillusoryzaeahas14發酵菌液、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3發酵菌液、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7發酵菌液、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16發酵菌液；
(2)益生菌複合菌液製備
將高富硒活性突變菌株candidatropicalisahas17發酵菌液、米麴黴aspergillusoryzaeahas14發酵菌液、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3發酵菌液、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7發酵菌液、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16發酵菌液按照(3-5):(2-4):(2-4):(1-3):(1-3)的體積比混合，製得益生菌複合菌液；
(3)新鮮培養基質添加
按質量濃度為2％-3％向所述益生菌複合菌液中加入新鮮培養基質；
(4)保護劑添加
按質量濃度為2.5-3‰向所述步驟(3)中得到的液體中加入山梨酸鉀，並攪拌均勻，以獲得製劑；
(5)蠶蛹處理
將新鮮蠶蛹置於通風乾燥箱中，在溫度為85℃的情況下烘乾至含水量為30％，然後採用粉碎機粉碎，粉碎粒徑為2mm；
(6)高活性富硒蠶蛹製備
稱取50公斤粉碎處理過的蠶蛹，然後加入菜粕10-15公斤、麩皮10-20公斤和過夜放置後的自來水30-50公斤，攪拌均勻後，按照質量比為1％-2％的比例加入所述步驟(4)中製得的製劑1.0-2.7公斤，混合攪拌均勻，在35-45℃恆溫下發酵36-72小時，然後進行烘乾，即可製成高活性富硒蠶蛹。
進一步地，其中，所述步驟(1)的1)中的高富硒活性突變菌株選育具體為：熱帶假絲酵母candidatropicalis採用yepd液體培養基在培養平板上培養32-48h，挑取單菌落至含100mlyepd液體培養基的250ml三角瓶中，以180-200rpm的轉速震蕩培養32h，之後菌液離心洗滌3-4次，製成單細胞懸液，使細胞濃度在108-109個/ml；然後，取0.1ml單細胞懸液均勻塗布到無菌培養皿中，置於超淨工作檯風乾製成菌膜；接著，在n+注入機中進行離子注入，能量為16kev，每個菌株做6個梯度劑量，每個劑量兩個平板，n+注入劑量分別為1.5×1014、2.5×1014、4.0×1014、5.5×1014、7.0×1014、1.0×1015ion/cm2，並做真空對照平板；誘變完成後，加入1ml無菌水洗滌菌體，製成菌懸液；然後，菌懸液稀釋105-9倍，塗布於含亞硒酸鈉的篩選培養基，採用3,3'-二氨基聯苯胺鹽酸鹽法測定酵母菌株硒的含量，經過多次誘變篩選，獲得耐受高濃度亞硒酸鈉的酵母突變菌株，也就是高富硒活性突變菌株，命名為candidatropicalisahas17，其中，所述高濃度亞硒酸鈉的濃度為220mg/l。
更進一步地，其中，所述步驟(1)的2)中，所述種子培養液製備具體為：將上述高富硒活性突變菌株candidatropicalisahas17接種在斜面培養基上，在溫度為28℃的情況下培養32-48h，得到斜面菌株，其中，所述斜面培養基的成分組成為：葡萄糖15-20g/l、蛋白腖15-20g/l、酵母膏5-10g/l、亞硒酸鈉20-30mg/l、瓊脂12-18g/l；然後，將上述斜面菌株接種於80ml的種子培養基中，在溫度為28℃的情況下以200r/min的轉速振蕩培養32-48h，得到種子培養液，其中，所述種子培養基的成分組成為：麥芽抽提物10-20g/l、蛋白腖10-15g/l、酵母膏5-10g/l、亞硒酸鈉30-60mg/l。
再進一步地，其中，所述步驟(1)的3)中，所述發酵培養為：將所述種子培養液按體積百分含量為8-12％的接種量接種至含有發酵培養基的50l發酵罐中，其中，所述發酵罐的裝液量為40-50％，在溫度為28℃、溶氧控制在50-70％、ph值維持在5.5-6.0的情況下發酵16-20h至對數生長期，並在發酵產物中補加終濃度為60-80mg/l的亞硒酸鈉，繼續發酵培養20-24h，收集發酵產物，得到高富硒活性突變菌株candidatropicalisahas17發酵菌液；其中，所述發酵培養基的成分組成為：可發酵還原糖300-400g/l、硫酸銅0.035-0.05g/l、硫酸錳0.03-0.04g/l、硫酸亞鐵0.35-0.45g/l、硫酸鎂5.5-7.0g/l、硫酸鋅2.5g-3.5g/l、氯化鈣3.5g-5.5g/l、硫酸銨5-7g/l、氯化鈉8.5g-11g/l、穀氨酸7-11g/l、l-半胱氨酸為11-1g/l，其餘用蒸餾水補足。
再更進一步地，其中，所述步驟(1)的4)中，將米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16分別單獨進行發酵，獲得發酵菌液，具體如下：
米麴黴aspergillusoryzaeahas14採用pda培養基培養36-72h，且接種量為2％-3％，搖床轉速為180-200rpm，其中，pda培養基的成份組成為：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15-20克、純水1000ml；
枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3採用lb培養基培養24-36h，且接種量為2％-3％，搖床轉速為180-200rpm，其中，lb培養基的成份組成為：胰蛋白腖10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、純水1000ml；
發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7和乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16採用mrs培養基培養24-36h，且接種量為2％-3％，搖床轉速為180-200rpm，其中，mrs培養基的成份組成為蛋白陳10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐溫801.0ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、純水1000ml。
此外，其中，所述步驟(2)中，所述益生菌複合菌液中有效活菌數為9×109-1.9×1010cfu/ml。
進一步地，其中，所述步驟(3)中的新鮮培養基質為甘蔗糖蜜，其含糖分在50％以上，錘度在85％以上。
更進一步地，其中，所述步驟(4)中的山梨酸鉀的純度為98％以上，且攪拌時的轉速150rpm，時間為30-60min。
最後，本發明還提供一種富硒發酵蠶蛹，其特徵在於，其採用上述製作方法製作而成。
進一步地，其中，所述富硒發酵蠶蛹的粗蛋白含量不低於55％，粗脂肪含量不高於12％，灰分含量不高於7％，有機硒華靈不低於7.5mg/kg。
本發明採用選育的高富硒熱帶假絲酵母candidatropicalisahas17，將亞硒酸鈉轉化成安全無毒，生物有效性高的有機硒。隨後，通過將富硒酵母與米麴黴、枯草芽孢桿菌、發酵乳桿菌、乳酸片球菌進行復配，將復配後的混合菌液發酵蠶蛹，通過益生菌菌株之間的協同作用，將蠶蛹經過微生物發酵，製得兼具益生菌和富硒雙重功效的多功能蠶蛹。該活性蠶蛹不僅富含有機硒，還含有大量的有益微生物以及益生菌發酵過程產生的代謝產物。同時依靠益生菌對蠶蛹中有機質的分解轉化作用，使得高活性蠶蛹具有富硒成分，營養更加豐富，蠶蛹的品質得到明顯提高，動物食用後還能促進營養物質的消化吸收，增強機體的免疫功能。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
【實施例1】
在本實施例中，益生菌符合菌液的菌株構成為：
富硒酵母菌candidatropicalisahas173.0×109cfu/ml
米麴黴aspergillusoryzaeahas142.0×109cfu/ml
枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas32.0×109cfu/ml
發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas71.0×109cfu/ml
乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas161.0×109cfu/ml。
在本還是理中，具體製作方法如下：
(1)單株菌發酵
將酵母菌candidatropicalisahas17、米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16五株菌株分別單獨進行發酵，獲得單株發酵菌液。具體如下：
1)富硒酵母菌液製備：
將熱帶假絲酵母candidatropicalis接種在斜面培養基中，在28℃下培養32h，得到斜面菌株。其中，斜面培養基成分組成為：葡萄糖15g/l，蛋白腖15g/l，酵母膏5g/l，亞硒酸鈉20mg/l，瓊脂12g/l。
將上述斜面菌株接種於80ml的種子培養基中，在28℃、200r/min下振蕩培養32h，得到種子培養液。種子培養基成分組成為：麥芽抽提物10g/l，蛋白腖10g/l，酵母膏5g/l，亞硒酸鈉30mg/l。
發酵培養：發酵培養基成分為可發酵還原糖300g/l，硫酸銅0.035g/l，硫酸錳0.03g/l，硫酸亞鐵0.35g/l，硫酸鎂5.5g/l，硫酸鋅2.5gg/l，氯化鈣3.5g/l，硫酸銨5g/l，氯化鈉8.5g/l，穀氨酸7g/l，l-半胱氨酸為11g/l，其餘部分用蒸餾水補足。
將種子培養液按8％(體積百分含量)的接種量接種至含有發酵培養基的50l發酵罐中(裝液量為40％)，在28℃、溶氧控制在50％、ph維持在5.5-6.0下，發酵16h至對數生長期，在發酵產物中補加終濃度為60mg/l的亞硒酸鈉，繼續發酵培養20h，收集發酵產物，即獲得富硒酵母菌candidatropicalisahas17發酵菌液。
2)其餘益生菌菌株菌液製備
米麴黴aspergillusoryzaeahas14採用pda培養基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15-20克，純水1000ml)培養36h。其中，接種量為2％，搖床轉速為180rpm。
枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3採用lb培養基(胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，純水1000ml)培養24-36h。其中，接種量為2％，搖床轉速為180rpm。
發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7和乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16採用mrs培養基(蛋白陳10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐溫801.0ml，磷酸氫二鉀2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，純水1000ml)培養24h。其中，接種量為2％，搖床轉速為180rpm。
(2)益生菌複合菌液製備
上述各單菌株發酵結束後，將富硒酵母菌candidatropicalisahas17、米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16五株菌株新鮮發酵液按照3:2:2:1:1的體積比混合，製得益生菌複合菌液。其中，複合菌液中有效活菌數為9.0×109cfu/ml。
(3)新鮮培養基添加
按質量濃度2％向複合菌液中加入新鮮培養基質-甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，錘度(bx)85％以上)。
(4)保護劑添加
按質量濃度2.5‰向3)中得到的液體中加入山梨酸鉀(純度98％以上)，攪拌均勻(150rpm，30min)。
(5)蠶蛹的處理
將新鮮蠶蛹置於通風乾燥箱中，85℃烘乾至含水量30％左右。然後採用粉碎機粉碎，粉碎粒徑約為2mm。
(6)高活性富硒蠶蛹的製備
稱取50公斤的蠶蛹，然後加入10公斤菜粕，麩皮10公斤，過夜放置自來水30公斤，和料。攪拌均勻後，按照1％比例加入(4)中製得的益生菌複合菌液1.0公斤，混合攪拌均勻，在35℃恆溫下發酵36小時，然後採用滾筒式工藝烘乾(氣流溫度不超過80℃)，即可製成富含高活性富硒蠶蛹。
對實施例1製備的高活性富硒發酵蠶蛹的含量進行檢測：發酵蠶蛹粗蛋白、粗脂肪、灰分測定分別採用半微量凱氏定氮法、索氏抽提法和馬弗爐灼燒法。採用常規檢測方法測定製備的蠶蛹中硒含量。檢測結果表明，蠶蛹中粗蛋白含量為55.8％，粗脂肪含量為11.3％，灰分含量為6.2％，有機硒含量為7.5mg/kg。
【實施例2】
在該實施例中，複合益生菌菌液的菌株構成：
富硒酵母菌candidatropicalisahas174.0×109cfu/ml
米麴黴aspergillusoryzaeahas143.0×109cfu/ml
枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas33.0×109cfu/ml
發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas72.0×109cfu/ml
乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas162.0×109cfu/ml
在本實施例中，具體製作方法為：
(1)單株菌發酵
將酵母菌candidatropicalisahas17、米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16五株菌株分別單獨進行發酵，獲得發酵菌液。具體如下：
1)富硒酵母菌液製備：
將熱帶假絲酵母candidatropicalis接種在斜面培養基中，在28℃下培養36h，得到斜面菌株。其中，斜面培養基成分組成為：葡萄糖18g/l，蛋白腖18g/l，酵母膏8g/l，亞硒酸鈉25mg/l，瓊脂15g/l。
將上述斜面菌株接種於80ml的種子培養基中，在28℃、200r/min下振蕩培養36h，得到種子培養液。其中，種子培養基成分組成為：麥芽抽提物15g/l，蛋白腖13g/l，酵母膏7g/l，亞硒酸鈉50mg/l。
發酵培養：發酵培養基成分組成為可發酵還原糖350g/l，硫酸銅0.045g/l，硫酸錳0.035g/l，硫酸亞鐵0.40g/l，硫酸鎂6.5g/l，硫酸鋅2.8g/l，氯化鈣4.5g/l，硫酸銨5.5g/l，氯化鈉9.5g/l，穀氨酸9.0g/l，l-半胱氨酸為12g/l，其餘部分用蒸餾水補足。
將種子培養液按10％(體積百分含量)的接種量接種至含有發酵培養基的50l發酵罐中(裝液量為45％)，在28℃，溶氧控制在60-70％，ph維持在5.5-6.0下發酵18h至對數生長期，在發酵產物中補加終濃度為70mg/l的亞硒酸鈉，繼續發酵培養22h，收集發酵產物，獲得富硒酵母菌candidatropicalisahas17菌液。
2)其餘益生菌菌株製備
米麴黴aspergillusoryzaeahas14採用pda培養基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15-20克，純水1000ml)培養48h。其中，接種量為2.5％，搖床轉速為190rpm。
枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3採用lb培養基(胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，純水1000ml)培養48h。其中，接種量為2.5％，搖床轉速為190rpm。
發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7和乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16採用mrs培養基(蛋白陳10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐溫801.0ml，磷酸氫二鉀2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，純水1000ml)培養48h。其中，接種量為2.5％，搖床轉速為190rpm。
(2)益生菌複合菌液製備
上述各單菌株發酵結束後，將富硒酵母菌candidatropicalisahas17、米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16五株菌株新鮮發酵液按照4:3:3:2:2的體積比混合，製得益生菌複合菌液。其中，複合菌液中有效活菌數為1.4×1010cfu/ml。
(3)新鮮培養基添加
按質量濃度2.5％向複合菌液中加入新鮮培養基質-甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，錘度(bx)85％以上)。
(4)保護劑添加
按質量濃度2.8‰向3)中得到的液體中加入山梨酸鉀(純度98％以上)，攪拌均勻(150rpm，40min)。
(5)蠶蛹的處理
將新鮮蠶蛹置於通風乾燥箱中，85℃烘乾至含水量30％左右。然後採用粉碎機粉碎，粉碎粒徑約為2mm。
(6)高活性富硒蠶蛹的製備
稱取50公斤的蠶蛹，然後加入13公斤菜粕，麩皮15公斤，過夜放置自來水37公斤，和料。攪拌均勻後，按照1.2％比例加入(4)中製得的益生菌複合菌液1.38公斤，混合攪拌均勻，在35℃恆溫下發酵36小時，然後採用滾筒式工藝烘乾(氣流溫度不超過80℃)，即可製成富含高活性富硒蠶蛹。
對實施例2製備的高活性富硒採用進行含量檢測：發酵蠶蛹粗蛋白、粗脂肪、灰分測定分別採用半微量凱氏定氮法、索氏抽提法和馬弗爐灼燒法。採用常規檢測方法測定製備的蠶蛹中硒含量。檢測結果表明，蠶蛹中粗蛋白含量為58.5％，粗脂肪含量為10.3％，灰分含量為6.1％，有機硒含量為8.8mg/kg。
【實施例3】
在該實施例中，複合益生菌菌液的菌株構成為：
富硒酵母菌candidatropicalisahas175.0×109cfu/ml
米麴黴aspergillusoryzaeahas144.0×109cfu/ml
枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas34.0×109cfu/ml
發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas73.0×109cfu/ml
乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas163.0×109cfu/ml。
在本實施例中，具體製作方法如下：
(1)單株菌發酵
將酵母菌candidatropicalisahas17、米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16五株菌株分別單獨進行發酵，獲得發酵菌液。具體如下：
1)富硒酵母菌液製備：
將熱帶假絲酵母candidatropicalis接種在斜面培養基中，在28℃下培養48h，得到斜面菌株。其中，斜面培養基成分組成為：葡萄糖20g/l，蛋白腖20g/l，酵母膏10g/l，亞硒酸鈉30mg/l，瓊脂18g/l。
將上述斜面菌株接種於80ml的種子培養基中，在28℃、200r/min下振蕩培養48h，得到種子培養液。其中，種子培養基成分組成為：麥芽抽提物20g/l，蛋白腖15g/l，酵母膏10g/l，亞硒酸鈉60mg/l。
發酵培養：發酵培養基成分組成為可發酵還原糖400g/l，硫酸銅0.05g/l，硫酸錳0.04g/l，硫酸亞鐵0.45g/l，硫酸鎂7.0g/l，硫酸鋅3.5g/l，氯化鈣5.5g/l，硫酸銨7g/l，氯化鈉11g/l，穀氨酸11g/l，l-半胱氨酸為13g/l，其餘部分用蒸餾水補足。
將種子培養液按12％(體積百分含量)的接種量接種至含有發酵培養基的50l發酵罐中(裝液量為50％)，在28℃、溶氧控制在60-70％、ph維持在5.5-6.0下發酵20h至對數生長期，在發酵產物中補加終濃度為80mg/l的亞硒酸鈉，繼續發酵培養24h，收集發酵產物，獲得酵母菌candidatropicalisahas17菌液。
2)其餘益生菌菌株製備
米麴黴aspergillusoryzaeahas14採用pda培養基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15-20克，純水1000ml)培養72h。其中，接種量為3％，搖床轉速為200rpm。
枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3採用lb培養基(胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，純水1000ml)培養72h。其中，接種量為3％，搖床轉速為200rpm。
發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7和乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16採用mrs培養基(蛋白陳10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐溫801.0ml，磷酸氫二鉀2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，純水1000ml)培養72h。其中，接種量為3％，搖床轉速為200rpm。
(2)益生菌複合菌液製備：
上述各單菌株發酵結束後，將富硒酵母菌candidatropicalisahas17、米麴黴aspergillusoryzaeahas14、枯草芽孢桿菌bacillussubtilisahas3、發酵乳桿菌lactobacillusfermentumahas7、乳酸片球菌pediococcusacidilacticiahas16五株菌株新鮮發酵液按照5:4:4:3:3的體積比混合，製得益生菌複合菌液。其中，複合菌液中有效活菌數為1.9×1010cfu/ml。
(3)新鮮培養基添加
按質量濃度3％向複合菌液中加入新鮮培養基質-甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，錘度(bx)85％以上)。
(4)保護劑添加
按質量濃度3‰向3)中得到的液體中加入山梨酸鉀(純度98％以上)，攪拌均勻(200rpm，60min)。
(5)蠶蛹的處理
將新鮮蠶蛹置於通風乾燥箱中，85℃烘乾至含水量30％左右。然後採用粉碎機粉碎，粉碎粒徑約為2mm。
(6)高活性富硒蠶蛹的製備
稱取50公斤的蠶蛹，然後加入15公斤菜粕，麩皮20公斤，過夜放置自來水50公斤，和料。攪拌均勻後，按照2％比例加入(4)中製得的益生菌複合菌液2.7公斤，混合攪拌均勻，在35℃恆溫下發酵72小時，然後採用滾筒式工藝烘乾(氣流溫度不超過80℃)，即可製成富含高活性富硒蠶蛹。
對實施例3製備的高活性富硒採用進行含量檢測：發酵蠶蛹粗蛋白、粗脂肪、灰分測定分別採用半微量凱氏定氮法、索氏抽提法和馬弗爐灼燒法。採用常規檢測方法測定製備的蠶蛹中硒含量。檢測結果表明，蠶蛹中粗蛋白含量為56.5％，粗脂肪10.5％，灰分6.8％，有機硒含量為8.1mg/kg。
本發明採用富硒酵母candidatropicalisahas17發酵得到的產品生物量高，且酵母細胞有機硒含量高，每kg富硒酵母水解物中，有機硒含量可達5000-5800mg，硒轉化率高達95-99％。絕大部分無機硒被轉化成生物有效性高、安全無毒的有機硒。採用含有該富硒酵母的益生菌菌株發酵蠶蛹，在提高蠶蛹中蛋白質等營養物質含量的同時，提高了蠶蛹中硒的含量，可以迅速被動物吸收利用，大大提升蠶蛹對硒的吸收利用率，打造高富硒的多功能蠶蛹。
此外，本發明還提供了該富硒發酵蠶蛹的製作方法，製作方法工藝簡單，步驟少，取材便利，僅需簡單的設備即可完成，成本低，容易推廣。
本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發明的實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬於本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之列。