維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用的製作方法
2023-06-02 08:44:36 2
維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本研究觀察維泰醇和紫杉醇對腫瘤細胞體外遷移能力以及血管內皮細胞管腔形成能力的影響，對它們的抗腫瘤轉移能力進行比較，以證實維泰醇的抗腫瘤血管新生及抗腫瘤轉移作用。方法：採用SRB法，劃痕試驗，明膠酶譜法、ELISA、AO/EB染色法以及管腔樣結構形成試驗等方法觀察比較維泰醇與紫杉醇的抗腫瘤轉移能力。結果：維泰醇對黑色素瘤細胞(B16F1)生長抑制率和致死率低於紫杉醇，維泰醇對黑色素瘤細胞遷移、MMP-2表達和對血管內皮細胞(ECV304)管腔形成的抑制能力略低於紫杉醇。結論：維泰醇具有較強的抗腫瘤轉移活性，雖然其抗轉移能力弱於紫杉醇，但其低細胞毒特性依然有望成為新的抗腫瘤轉移的藥物。
【專利說明】維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種化合物，具體地說是由廣東汕頭雙駿生物有限公司的研究人員利用紅豆杉樹皮中的一種微生物菌誘變株，經發酵純化等工藝合成生產出的一種新型化合物。此化合物具有與紫杉醇類似的抗腫瘤轉移的活性，屬於腫瘤局部介入治療藥物開發領域的維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用。【背景技術】
[0002]轉移是良性腫瘤與惡性腫瘤的主要區別。惡性腫瘤難以治癒和癌症患者最終死亡的首要原因就是腫瘤轉移。大多數腫瘤患者不是死於原發腫瘤而是轉移性腫瘤。抑制惡性腫瘤的轉移一直是腫瘤研究的熱點和難點。
[0003]腫瘤的轉移是惡性腫瘤生物學特徵之一，是腫瘤臨床治療的難題。腫瘤轉移是指腫瘤細胞離開原發生長部位，通過血液循環或淋巴系統等轉移途徑，在機體遠隔部位的組織或者器官繼續生長，形成同樣性質的新病灶的過程。這個病灶即為轉移灶，而原來的腫瘤則稱為原發灶。腫瘤轉移是複雜、多步驟的連續過程，包括癌細胞從原發腫瘤脫節，侵襲鄰近組織，進入循環系統，穿透基底膜，浸潤周邊組織，在繼發部位生長形成轉移瘤。研究表明，血細胞、毛細血管內皮、內皮下基底膜，瘤細胞自身的粘連性，腫瘤轉移相關基因及轉移抑制基因的表達調控，瘤細胞的阿米巴運動能力，宿主因素等都對腫瘤轉移有影響。
[0004]臨床上所見的轉移現象是相當普遍的，許多腫瘤患者初診時，往往體內已經存在轉移灶。據統計，至少60%的腫瘤患者就診時實際上已經發生腫瘤轉移。惡性腫瘤向遠處轉移是導致腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因之一，控制轉移是決定癌症患者預後的關鍵因素。如果我們能夠使每一個惡性腫瘤患者最終不發生擴散和轉移，或者能有效控制腫瘤的轉移，那麼，惡性腫瘤預後不良的問題就都能夠解決了。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種能有效抑制腫瘤細胞轉移的新型化合物維泰醇(以B16F1細胞為實驗對象)，我們在此試驗中將以紫杉醇作為對照實驗，同時也為維泰醇將來的研究和開發提供理論依據。
[0006]本實驗是通過下述方案實現的
[0007]其方案:
[0008](I)主要試劑的配製，其中包括RPM1-1640培養基配製、維泰醇和紫杉醇溶液的配製
[0009](2)細胞的培養
[0010](3)細胞抑制率測定
[0011](4)致死率測定
[0012](5)劃痕試驗
[0013](6)明膠酶譜分析實驗[0014](7)MMP_2表達的測定
[0015]⑶數據處理
[0016](9)實驗結果，其中包括對B16F1細胞的抑制率和致死率的結果、抑制B16F1細胞遷移的能力、細胞分泌MMP-2活力的能力、下調B16F1細胞中MMP-2表達的能力
[0017]維泰醇是有廣東汕頭雙駿生物有限公司的研究人員利用紅豆杉樹皮中的一種微生物菌誘變株，經發酵純化等工藝合成生產出的一種新型化合物。其化學結構以及生產工藝都已經申請國內及國際專利，具有很高的發展前景。它與紫杉醇同是由紅豆杉樹皮中獲得，但維泰醇的結構和生產工藝相對簡單。做為新型化合物，維泰醇具有和紫杉醇相同的來源，因此我們經過實驗推測維泰醇可能也會具有與紫杉醇類似的抗腫瘤活性。
[0018]附表說明:[0019]表1為配製明膠酶SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳所用溶液【專利附圖】
【附圖說明】:
[0020]圖1為維泰醇和紫杉醇對B16F1細胞增殖抑制率和致死率的比較。試驗設6個平行組，結果以平均均值土標準誤(Meanvalues土SEM)表示。
[0021]圖2為維泰醇和紫杉醇降低B16F1細胞的遷移能力。通過計算劃痕前後的癒合面積評價B16F1細胞的遷移能力。< 0.01與Control組比較。
[0022]圖3為維泰醇和紫杉醇降低B16F1細胞中MMP-2的活性。採用明膠酶譜的方法對B16F1細胞分泌的MMP-2活性進行檢測。試驗設3個平行組，結果以平均均值土標準誤(Meanvalues土SEM)表不。林P < 0.01 與 Control 組比較。
[0023]圖4為維泰醇和紫杉醇下調B16F1細胞MMP-2的表達。採用MMP-2ELISA檢測試劑盒，試驗設3個平行組，結果以平均均值土標準誤(Meanvalues土SEM)表示。#P < 0.01與Control比較。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附表及附圖對本發明進行詳細說明:
[0025]具體方案:
[0026]步驟1:主要試劑的配製:(1)RPM1-1640培養基的配置:將I袋(IOg)RPM1-1640乾粉培養基溶於1000mL新鮮三蒸水。待完全溶解後，加青黴素和鏈黴素使終濃度分別為100U/mL、100 μ g/mL,加NaHC03 2.0g,調節pH至7.4，抽濾除菌後分裝，4°C保存。用前預熱至37°C，加入10%新生小牛血清。(2)維泰醇和紫杉醇溶液的配製:以二甲基亞碸(DMSO)溶解維泰醇和紫杉醇粉末，用無血清RPM1-1640培養基配置成濃度為lOOnmol/L的貯存液，-4°C避光保存備用。處理細胞時用無血清RPM1-1640培養基稀釋為工作濃度，DMSO終濃度小於0.01%。
[0027]步驟2:細胞培養方法:小鼠黑色素瘤細胞B16F1用含10%小牛血清、鏈黴素(100 μ g/mL)、青黴素鈉(100U/mL)、pH7.5 的 RPM1-1640 培養基，在 37°C、5% CO2、飽和溼度培養箱進行常規培養，取對數生長期細胞進行各項實驗。每培養2天細胞傳代一次。
[0028]步驟3:細胞抑制率測定:取細胞對數生長期的細胞，調整細胞懸液的濃度為5X 104個/mL,按每孔100 μ L加於96孔培養板中，於5% CO2, 37°C恆溫培養箱中孵育24h。細胞貼壁約80%，每孔加入不同濃度的維泰醇和紫杉醇溶液，其終濃度分別為5，10，20，40，80，160nmol/L,每個濃度設6個平行孔，酶標儀在波長490nm處檢測個孔OD值。
[0029]
【權利要求】
1.一種維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:對B16F1腫瘤細胞轉移的作用的實驗方法，其特徵在於是由維泰醇及紫杉醇在某種濃度下對B16F1腫瘤細胞轉移的影響；所有試驗設3個平行組或重複3次，結果以平均均值土標準誤(Meanvalues土SEM)表示，以t檢驗進行組間統計學差異比較。
2.根據權利要求1所述的維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:需進行維泰醇和紫杉醇溶液的配製:以二甲基亞碸(DMSO)溶解維泰醇和紫杉醇粉末，用無血清RPM1-1640培養基配置成濃度為lOOnmol/L的貯存液，-4°C避光保存備用；處理細胞時用無血清RPM1-1640培養基稀釋為工作濃度，DMSO終濃度小於0.01 %。
3.根據權利要求1所述的維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:對小鼠黑色素瘤細胞B16F1細胞進行培養:用含10%小牛血清、鏈黴素(IOOii g/mL)、青黴素鈉(100U/mL)、pH7.5的RPM1-1640培養基，在37°C、5% C02、飽和溼度培養箱進行常規培養，取對數生長期細胞進行各項實驗；每培養2天細胞傳代一次。
4.根據權利要求2或3所述的維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:取細胞對數生長期的細胞，調整細胞懸液的濃度為5 X 104個/mL，按每孔IOOii L加於96孔培養板中，於5% C02，37°C恆溫培養箱中孵育24h。細胞貼壁約80%，每孔加入不同濃度的維泰醇和紫杉醇溶液，其終濃度分別為5，10，20，40，80，160nmol/L，每個濃度設6個平行孔，酶標儀在波長490nm處檢測個孔OD值。
5.根據權利要求3所述的維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:將細胞懸液與胎盤蘭9: I混合，輕輕混勻，用血球計數板計數細胞，計算細胞存活率或死亡率。
6.根據權利要求2或3所述的維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:對細胞進行劃痕實驗。
7.根據權利要求2或3所述的維 泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:對細胞進行明膠酶譜分析實驗。
8.根據權利要求2或3所述的維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:對細胞進行MMP-2表達的測定。
9.根據權利要求4-8所述的維泰醇在製備治療抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特徵在於:得出實驗結果。
【文檔編號】A61P35/04GK103520145SQ201210225742
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月3日 優先權日:2012年7月3日
【發明者】劉景磊, 鄭秋生, 王振華, 張波, 陳姬 申請人:鄭秋生