提高生物活性分子傳遞的方法和組合物的製作方法

2023-06-02 08:43:26

專利名稱：：提高生物活性分子傳遞的方法和組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及藥物製劑領域，具體地iJL，提供控制、延長生物活性分子如治療性蛋白質、肽和低(聚)核苦酸釋放的新製劑。
背景技術：
：相對於給予藥物本身來講，用生物可降解的聚合物微球體和納米球體包封的藥物可延長維持治療藥物的水平。依據劑型和包封的活性分子而定，緩釋可最高延至數月。可是許多生物活性分子，尤其是蛋白質被用聚合載體包封它們所需的操作過程所破壞或使其不穩定。另外，許多蛋白質的帶電荷的、極性的性質可限制用聚合藥物載體包封的程度，並且可導致當第一次給藥時所包封的生物活性分子部分的迅速丟失("爆發釋放(burst)")。當患者服藥時一直採用生物可降解的聚合物傳遞體系包封的生物活性分子的方法刺激免疫反應(見Gombotz等，U.S.Pat.No.5，942，253)。在某些情況下這是理想的，但當目的是為了傳遞治療用途的生物活性分子時，卻不理想。因此降低免疫系統對用生物可降解的聚合物傳遞的生物活性分子的識別應該有利於治療的進行。生物活性分子，尤其是治療性的蛋白質(藥物)，可用親水性聚合物如聚乙二醇修飾(通稱為"聚乙二醇化(pegylation)"的方法)，以共價鍵連接到一個或多個胺基酸側鏈上(如見Davis等，U.S.Pat.No.4,179,337;Harris,U.S.Pat.No.5,446,090;Delgado等，U.S.Pat.No.5,880,255.)。雖然本領域眾所周知此類連接可導致分子量明顯增加並可降低修飾後的治療性蛋白質的血液清除率(如見Camble等，U.S.Pat.No.5,320,840)，但是先有技術沒有說明使用聚乙二醇化的蛋白可降低免疫原性或可延長從生物可降解的聚合藥物傳遞系統中釋放的持續時間。先有技術沒有說明相對於未聚乙二醇化的藥物，聚乙二醇化的藥物可增加藥物在生物可降解的藥物傳遞系統中的可達到的裝載量，也沒有說明相對於未聚乙二醇化的藥物，聚乙二醇化的部分可減少藥物的爆發釋放。
發明內容本發明提供控制、延長生物活性分子如治療性蛋白質、肽和低(聚)核苷酸釋放的新製劑。所述製劑以生物可降解的聚合物如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)及其共聚物聯合形成的微粒或納米粒為基礎。將生物活性分子連接到親水性的聚合物如聚乙二醇或聚丙二醇中，然後與固體微粒或納米粒製成能提供控釋的製劑。該控釋製劑可通過注射給藥、吸入給藥、鼻內或口服給藥。因此，作為本發明的部分，其發現親水性聚合物連接到生物活性分子(如藥物和治療性蛋白質)上有幾個有益的作用，包括在用藥物載體包封條件下提供保護使其免受降解或變性。另外，相對於未修飾的蛋白質，增加了可以被包封的修飾蛋白質的量，因此提供較低的原料總劑量，對患者和生產者均有益。另外，本發明進一步以以下發現為基礎，發現相對於在載體中的非聚乙二醇化的生物活性分子，降低了被生物可降解的聚合物藥物傳遞載體包封的聚乙二醇化的生物活性分子的免疫原性，特別是通過皮下或肌內注射或吸入或黏膜傳遞(如口或鼻傳遞)給藥時。當口腔傳遞使用生物可降解的聚合物時，被降低的免疫原性具有特別的優勢，因為這是黏膜接種疫苗的一種典型的方法。在另一方面，本發明以下述發現為基礎，發現通過以生物可降解的聚合物系統，具體地說以納米J求給藥時，能使通常不能被胃腸道吸收的聚乙二醇化的蛋白質、肽、j氐聚糖和低聚核苷酸成為生物可利用的。當在此使用時，術語"生物可利用的"指在對一個主體給藥後進入血流的生物活性分子部分。當口服給藥時，本發明的控釋製劑可增加生物活性分子的生物利用度，特別是此處所述的納米球製劑。例如，在單劑量口服給予納米球包封的聚乙二醇化的生物活性分子後，血液水平可維持數天。另外，在形成納米球過程中聚乙二醇鏈保護該生物活性分子免受降解和變性，促使活性分子的截留增加並減少"爆發釋放"作用。因此，在一個優選的實施方案中，本發明提供一種控制、延緩釋放並增加生物活性分子的生物利用度的藥用組合物，它包括一種連接包封到納米球中的治療劑的聚合物(如PEG)。在一個特別優選的實施方案中，口服給予所述組合物。在一個優選的實施方案中，所述生物活性分子選自ot-幹擾素、(3一幹擾素、Y-幹擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細月包介素l、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬醯胺酶、腺苦、脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、胸腺素、副曱狀腺激素、色素激素、生長調節素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、曱狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆的抗體、多克隆的抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。因此，本發明的組合物可用於在多個方面改善治療性的生物活性分子的體內傳遞。詳細地說，本發明提供降低免疫原性、增加生物利用度、增加持續時間、增加穩定性、減少爆發釋放並控制、延緩生物活性分子的體內釋放的優勢。具體實施例方式1.生物活性分子當在此使用時，術語"生物活性分子"指給予主體如人或其它的哺乳動物的任意的治療性蛋白質、肽、多糖、核酸或其它的生物活性化合物。用於本發明的合適的治療性蛋白質包括，但不限於，a-幹擾素、P-幹擾素、，幹擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素1、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬醯胺酶、腺苷脫氨酶和胰島素。適宜的治療性肽也包括激素，如ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副甲狀腺激素、色素激素、生長調節素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、曱狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin和泌乳刺激素。另外適宜的治療性蛋白質包括單克隆和多克隆的抗體、單鏈抗體、其它抗體片段、類似物和衍生物。治療性聚核苷酸，包括反義寡核芬酸、阿普塔默和治療基因，也可用本發明的方法和組合物傳遞。抗凝血治療劑，如肝素和低分子量肝素，也可用本發明的方法和組合物傳遞。其它適宜用於本發明的治療性蛋白質包括小的生物活性分子，如抗癌藥，如紫杉醇、泰索帝、阿黴素和道諾黴素、長春新鹼、順鉑、卡鉑、喜樹鹼和喜樹鹼類似物、抗生素、安定藥、抗抑鬱藥、糖尿病和心血管疾病的小分子藥物。II.生物活性分子與親水性聚合物的連接術語"親水性聚合物"指任意的水溶性直鏈或支鏈聚合物，包括但不限於聚乙二醇和聚丙二醇和類似的直鏈和支鏈聚合物。優選聚合物的分子量在約500道爾頓到50,000道爾頓的範圍內。用於本發明的親水性聚合物一般具有一個反應基團，其通過氨基、羧基、硫氬基、磷酸酯或羥基官能團，將該聚合物引入連接到所述的生物活性分子中。可根據標準方案製備用於本發明的親水性聚合物如聚乙二醇，將一個末端加有曱氧基基團而激活另一端以易於連接到生物活性分子的活性基團上。例如，美國專利序號6,113,906描述了聚乙二醇上的琥珀醯胺琥珀酸酯或氨基曱酸酯活性基團與蛋白質上的氨基基團的反應的用途。美國專利序號5,446,090描述了聚乙二醇的碸衍生物與蛋白質的硫氫基形成穩定的鍵的用途。美國專利序號5,880,255描述了tresyl衍生物與蛋白質的氨基基團反應形成一種簡單的、穩定的仲胺鍵的用途。這些專利的所有內容通過引用全部結合到本文中。N-羥基琥珀醯胺也可作為反應基團引入。III.結合聚合物的生物活性分子的控釋製劑術語"控釋"指控制本發明的藥物傳遞製劑傳遞的生物活性分子的速率和/或^t量。控釋可以是連續的或不連續的，和/或線性的或非線性的。為了產生所需的效果，可用一種或多種類型的聚合物成分、藥物載體、賦形劑的內含物或降解增強劑、或其它修飾劑，進行單獨給藥、聯合或連續給藥來實現。零級釋放或線性釋放通常解釋為在所需的時間期限內，一定時間釋放的生物活性分子的量作為量/單位時間的函數保持相對恆定。"多相(Multi-phasic)"通常解釋為釋放出現一個以上的"爆發釋放"。A.微粒在一個實施方案中，為了控制結合聚合物的生物活性分子的釋放，本發明採用生物可降解的微粒。當在此使用時，"微粒"指優選具有小於l.Omm，而更優選具有在1.0和100.0微米之間的直徑的粒子。微粒包括微球，其一般為固體球形微粒。微粒也包括微嚢，其通常是具有不同的聚合物、藥物或《且合物的核心的球形微粒。用於本發明的微粒可用各種控釋製劑所用的生物可降解的聚合物製備，這在本領域是眾所周知的。例如，適宜的聚合物包括，但不限於，包括聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物的聚(羥基酸)、聚酐、聚原酸酯和某些類型的蛋白質和多糖聚合物。當在此使用時，術語"生物可侵蝕的"或"生物可降解的"指當暴露到pH在大約6-8之間的生理溶液中並在大約25。C-38。C之間的溫度下，在一段時期內溶解或降解的聚合物，所述一段時間在所需要的應用(通常在體內治療中)中是可以接受的，一般大約不到五年，更優選不到一年。優選的聚合物包括聚(羥基酸)，尤其是乳酸-乙醇酸共聚物(lacticacid-co-glycolicacid)("PLGA"),其在暴露到機體的水環境中後通過水解降解。然後該聚合物水解產生乳酸和乙醇酸單體，它們是細胞代謝的正常的副產物。所述聚合物分解的速率可在幾周到一年的一段時間內變化，這取決於幾個因素，所述因素包括聚合物的分子量、聚合物鏈中乳酸與乙醇酸單體的比率和單體亞單位的立構規整性(L和D立體異構體混合物破壞聚合物的結晶性，從而增強聚合物降解)。微球可含有兩種或兩種以上的分子量不同和/或單體比率不同的生物可降解的聚合物混合物。衍生化的生物可降解的聚合物也適宜用於本發明，包括連接到PLGA等上的親水性聚合物。詳細地說，為了形成微球，可使用本領域中已知的各種技術。例如，這些技術包括在移除溶劑後的單乳化或雙乳化步驟。移除溶劑可通過其它方法之中的萃取、蒸發或噴霧乾燥完成o在溶劑萃取方法中，將所述聚合物溶解於至少部分溶於萃取溶劑(如水)的有機溶劑中。然後，將以溶解形式或以細小粒子分散形式的生物活性分子加入到聚合物溶液中，之後將該混合物分散進入含有表面活性劑如聚(乙蜂醇)的水相中。將產生的乳化液加入到更大體積的水中，將有機溶劑從聚合物/生物活性劑中移除，形成硬化的微粒。在溶劑蒸發方法中，將所述聚合物溶解於揮發性有機溶劑中。將以溶解形式或以細小粒子分散形式的生物活性分子加入到聚合物溶液中，之後將該混合物懸浮在一種含有表面活性劑如聚(乙烯醇)的水相中。攪拌所產生的乳化液，直到大部分有機溶劑蒸發，留下固體微球。在噴霧乾燥方法中，將所述聚合物溶解於適宜的溶劑中，如二氯曱烷(如0.04g/ml)中。然後將已知量的生物活性分子(藥物)懸浮(如果不溶)或共溶(如果可溶)在該聚合物溶液中。隨後將該溶液或分散液噴霧乾燥。可以獲得直徑範圍在1-10微米之間的微球，其形態取決於聚合物的選擇。其它已知的方法，如相分離法和凝聚法以及以上方法的變化在本領域是眾所周知的，並且也可用於本發明。B.納米粒在另一個實施方案中，本發明採用生物可降解的納米粒控制連接生物活性分子的聚合物的釋放，特別是口服給藥。當在此使用時，術語"納米粒"指具有優選在大約20納米和大約2.0微米之間的直徑的粒子，典型地是在大約100納米和l.O微米之間的直徑的粒子。除了使用高速混合或勻化以便將聚合物/生物活性劑乳化液的粒徑減少到2.0微米以下，優選在l.O微米以下之外，基本上可按照以上微米粒所述，獲得納米粒製劑，例如，WO97/04747中說明了製備納米粒的適宜技術，該申請全部內容結合到本發明中作為參考。實施例I.傳遞leu-腦啡肽的製劑的製備和特徵實施例1-聚乙二醇綴合的leu-腦啡肽(PEG-leu-腦啡肽)的製備如下製備用聚乙二醇共價修飾的leu-腦啡肽將25mgleu-腦啡肽溶解於500pL含有50(iLTEA的無水DMSO中。將250mgmPEG(5000)-SPA溶解於1.5mL無水DMSO中，並通過直接注射加入到所述肽溶液中。讓該反應在室溫下進4亍2小時或直到>90%的肽轉化為其被PEG-修飾的形式。通過在EtOH中重結晶(2x),從反應物中分離出產物，mPEG(5000)-leu-腦啡肽。該反應產物為>95%聚乙二醇化的白色固體(通過RP-HPLC分析)。實施例2-含有leu-腦啡肽的常規(w^o/w2)微粒的製備和特徵如下製備含有leu-腦啡肽的常規w,/o/w2微粒將leu-腦啡肽溶解於1:9DMSO:PBS混合物中，4吏終濃度為35mg/mL(其在PBS中的最大溶解度)。將PLGA(50:50丙交酯乙交酯；酸末端基團；固有粘度0.16L/g)溶解於二氯曱烷中，使終濃度為200mg/mL。通過以10,000rpm速度，將200的肽溶液與3mL的聚合物溶液勻化3分鐘，製成初乳化液(w/0)。將該初乳化液傾入到100mL0.5%PVA溶液中，並以750rpm攪拌3-6小時。在溶劑已經蒸發並且微粒已經變硬後，過濾收集，並在分析前於真空中乾燥。該粒子的核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和它們的內容物的最初釋放量(IR)的特徵如下。結果見表1。通過溶解10mg微球在50%乙腈中，隨後離心以沉澱不溶的聚合物，進行微球核心裝載量的測量。通過RP-HPLC分析部分樣品，並與在50%乙腈中製備的有代表性的標準品比較。通過懸浮20mg樣品在2mL含有0.02%吐溫20和25%EtOH的PBS(50mM,pH7.2)中，測量微球的最初釋放量。將該懸浮液渦流振蕩，並在37。C下孵育。1小時後，移去等份樣品，過濾並通過RP-HPLC分析釋放量。表明1小時時的加速釋放與1天以後在沒有EtOH的PBS中的活性釋放量相關。實施例3-含有PEG-leu-腦啡肽綴合物的常規(w"o/w2)微粒的製備和特徵如下製備含有PEG-leu-腦啡肽的常規w!/o/w2微粒將PEG-leu-腦啡肽溶解於1:9DMSO:PBS混合物中，4吏終濃度為50mg/mL。將PLGA(50:50丙交酯乙交酯；酸末端基團；固有粘度0.16L/g)溶解於二氯甲烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10,000rpm速度將200PL的肽溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，製成初乳化液(w/0)。將該初步乳化液傾入到100ml0.5%PVA溶液中，並以750rpm攪拌3-6小時。在溶劑已經蒸發並且微粒已經變硬後，過濾收集，並在分析前於真空中乾燥。如實施例2所述，該粒子具有核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和它們的內容物的最初釋放量(IR)的特徵。這些數據示於表1中。實施例4-含有leu-腦啡肽的單相微粒的製備和特徵如下製備含有未修飾的leu-腦啡肽的單相微粒將10mgleu-腦啡肽溶解於1ml含有30pLTFA的二氯曱烷中。然後將90mgPLGA(50:50丙交酯乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解於該有機的肽溶液中。通過^f吏該溶液與2.5ml2.5%PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液(o/w)。使用強制通氣(forcedair)(15分鐘)並攪拌(6-8小時)，蒸發溶劑並硬化微粒。在硬化後，通過過濾收集所述微粒，並在分析前於真空中千燥。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數據示於表1中。實施例5-含有PEG-leu-腦啡肽綴合物的單相微粒的製備和特徵如下製備含有PEG-leu-腦啡肽的單相微粒將50mgPEG-leu-腦啡肽和150mgPLGA(50:50丙交酯乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解於2ml二氯甲烷中。通過使該有機肽/聚合物溶液與5ml2.5%PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液(o/w)。通過攪拌/真空蒸發2小時，從該微粒中移去有機溶劑。在微粒變硬後，通過過濾收集所述微粒，並在分析前於真空中乾燥。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數據示於表1中。實施例6-聚乙二醇化的leu-腦啡肽增加的藥物裝載量表1的數據顯示PEG5000與leu-腦啡肽的共價結合對於雙乳化技術可增加藥物的裝載量(CL)達O.07。/。到0.36%,對於單相方法可增加0.3%到3.95%。對兩種方法而言，聚乙二醇化也導致包封效率的極大改善。聚乙二醇化的最初釋放量("爆發釋放")比通過單相製備的未聚乙二醇化的肽的最初釋放量稍低(更好)，並且對於聚乙二醇化的肽，其藥心裝載量超過10倍。藥心裝載量越高，為了達到所需的藥物劑量而給予患者的生物可降解的藥物傳遞體系的劑量就越小。表1、leu-腦啡肽和PEG-leu-腦啡肽微粒的特徵tableseeoriginaldocumentpage15理論裝栽量(活性物的重量/活性物和聚合物的總重量)CL-核心裝載量(在微粒中單獨的活性物的重量百分比Wt0/。)EE-包封效率(在製備過程中包封的活性物的％)PS-平均粒徑(從SEM估計)IR-從37。C下的含有0.02%吐溫20和25°/。EtOH的PBS(50mM:pH7.2)中，體外分解1小時時的最初釋放量ND-未能檢測出II.傳遞Biphalin的製劑的製備、特徵和給藥方法實施例7-聚乙二醇化的Biphalin增加的藥物裝載量和減少的爆發釋放Biphalin是一種在哺乳動物中具有止痛活性的合成肽。與兩個PEG2000鏈連接，使其在靜脈內給藥後比未聚乙二醇化的肽具有更長的止痛作用持續時間。可按照以下實施例所述，比較Biphalin和聚乙二醇化的Biphalin在PLGA微粒包封中的行為。如表2所示，聚乙二醇化的Biphalin比未聚乙二醇化的肽具有更高的藥心裝載量、更高的包封效率和更低的最初釋方文水平(爆發釋方丈)。實施例8-含有biphalin的常規C^/o/w2)微粒的製備和特徵如下製備含有PEG-biphalin的常規w"o/w2微粒將Biphalin溶解於PBS:DMSO:乙酸(5:1:1.5)的三重混合物中，使終濃度為35mg/ml。將PLGA(50:50丙交酯乙交酯；酸末端基團；固有粘度0.16L/g)溶解於二氯甲烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10000rpm的速度，將200|LiL的肽溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，製成初乳化液(w/0)。將該初乳化液傾入到100ml0.5%PVA溶液中，並以750rpm攪拌3小時。在溶劑已經蒸發並且微粒已經變硬後，用水洗滌該微粒，通過過濾收集，並在分析前於真空中乾燥。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數據見表2中所示。實施例9-含有PEG-biphalin綴合物的常規(w"o/w2)微粒的製備和特徵如下製備含有PEG-biphalin的常規w/o/w2微粒將PEG-biphalin溶解於PBS中，使終濃度為50mg/ml。將PLGA(50:50丙交酯乙交酯；酸末端基團；固有粘度0.16L/g)溶解於二氯甲烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10000rpm的速度，將200)liL的肽溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，製成初乳化液(w/0)。將該初乳化液傾入到100ml0.5%PVA溶液中，並以750rpm攪拌3小時。在溶劑已經蒸發並且微粒已經變硬後，用水洗滌該微粒，通過過濾收集，並在分析前於真空中乾燥。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數據示於表2中。實施例10-含有biphalin的單相微粒的製備和特徵如下製備含有未修飾的biphalin的單相微粒將20mgbiphalin和180mgPLGA(50:50丙交酯乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解於2mll:3的乙酸二氯曱烷混合物中。通過使該油相與5ml1%PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液。通過在攪拌下真空蒸發4小時，從最初的0/w乳化液中移去有機溶劑。在移除溶劑後，通過過濾收集變硬的微粒，並用蒸餾的去離子水洗滌數次以便移除任何非特異性結合的PVA或biphalin。最後在分析前，於真空中乾燥該微粒。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數據示於表2中。實施例11-含有PEG-biphalin綴合物的單相微粒的製備和特徵如下製備含有PEG-biphalin的單相微粒將180mgPLGA(50:50丙交酯乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)和20mgPEG-biphalin溶解於2ml二氯甲烷中。通過使該聚合物/肽溶液與5ml2.5%聚乙烯醇(PVA，80-85。/o水解)渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液。通過在攪拌下真空蒸發4小時，^人該初乳化液(o/w)中移去有機溶劑。通過過濾收集變硬的微粒，並用蒸餾水洗滌數次以便移除任何非特異性結合的PVA或PEG-biphalin。最後，在分析前，於真空中乾燥該微粒。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數據示於表2中。實施例12-給予生物可降解的微球中的聚乙二醇化的biphalin後對哺乳動物的止痛作用為了評估按照本發明給藥biphalin在體內傳遞的改善，如下進行一個比較研究聚乙二醇化的biphalinPLGA微球可按照實施例9所述，通過雙乳化方法製備。將所述微球懸浮在帶有0.5%Tween-20的羧曱基纖維素(.5%)水溶液的媒介物中。然後皮下給予Spragur-Dawley大鼠一個有效劑量，並且通過，例如，擺尾(tail-flick)試驗測量止痛作用。包封的PEG-biphalin微球比未包封的PEG-biphalin對照注射劑具有持續更長的止痛作用。該實驗可用通過實施例11的單相方法製備的PLGA-包封的PEG-biphalin重複進行，結果類似。表2、Biphalin和PEG-Biphalin微粒的特徵tableseeoriginaldocumentpage18a理論裝載量(活性物的重量/活性物和聚合物的總重量)CL-核心裝載量(在微粒中單獨的活性物的重量百分比Wt%)EE-包封效率(在製備過程中包封的活性物的％)PS-平均粒徑(從SEM估計)IR-從37。C下的含有0.02%吐溫20和25。/。EtOH的PBS(50mM，pH7.2)中，體外分解1小時時的最初釋放量ND-未能檢測出III傳遞胰島素的製劑的製備、特徵和給藥方法實施例13-聚乙二醇-共軛的人胰島素(PEG-胰島素)的製備按如下方法用聚乙二醇共價》務飾人胰島素將116mg重組人胰島素溶解於4ml含有200(iLTEA的無水DMSO中。將1gmPEG(5000)-SPA溶解於10ml無水DMSO中，並通過直接注射加入到所述胰島素溶液中。讓該反應在室溫下進行過夜(6-10小時)或直到>90%的蛋白質聚乙二醇化。通過從Et20中沉澱(2x)，分離未反應的PEG和聚乙二醇化的胰島素。終產物為>95%聚乙二醇化的白色顆粒固體(通過RP-HPLC分析)。實施例14-含有人胰島素的常規(W^0/W2)微粒的製備和特徵如下製備含有人胰島素的常規wi/o/w2微粒將重組人胰島素溶解於DMSO:0.1NHC1(1:1)中，使終濃度為50mg/ml,並將PLGA(50:50丙交酯乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解於二氯曱烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10000rpm的速度，將200的所述蛋白質溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，製成初乳化液(w/0)。將初乳化液加入到100ml0.5。/。PVA溶液中，並在真空下攪拌3-6小時。移除有才幾溶劑，過濾微粒，用水洗滌數次，並在分析前於真空中乾燥。該微^i的特徵示於表3中。實施例15-含有PEG-胰島素綴合物的常規(w^o/w2)微粒的製備和特徵如下製備含有PEG-胰島素的常規Wl/o/w2微粒將PEG-胰島素溶解於DMSO:H20(l:2)的混合物中，使終濃度為50mg/ml，並將PLGA(50:50丙交酯乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解於二氯曱烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10000rpm的速度，將200|LiL的所述蛋白質溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，製成初乳化液(w/0)。將初乳化液加入到100ml0.5%PVA溶液中，並在真空下攪拌3-6小時。移除有機溶劑，過濾微粒，用水洗滌數次，並在分析前於真空中乾燥。該微粒的分析結果示於表3中。實施例16-含有人胰島素的單相微粒的製備和特徵如下製備含有人胰島素的單相微粒將20mg重組人胰島素(Zn"-胰島素鹽)溶解於2ml乙酸二氯曱烷(1.4:1)混合物中。將180mgPLGA(50:50丙交酯乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解於該有機的肽溶液中。通過使該有機肽/聚合物溶液與5ml1%PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液。通過在攪拌下真空蒸發2小時，移去有機溶劑。將部分變硬的微粒加入到含有100ml水的燒杯中，再攪拌2小時以便徹底移除所有的有機溶劑。過濾收集微粒、用水洗滌數次，並在分析前於真空中乾燥。該微粒的分析結果示於表3中。20實施例17-含有PEG-胰島素綴合物的單相微粒的製備和特徵如下製備含有PEG-胰島素的單相微粒將63mgPEG-胰島素和137mgPLGA(50:50丙交酯乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解於2ml二氯曱烷中。通過使該油相與5ml1%PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液。通過真空蒸發2小時，隨後在環境溫度下攪拌l小時完成有機溶劑的移除。通過過濾收集變硬的微粒，用水洗滌數次，並在分析前於真空中乾燥。該微粒的分析結果示於表3中。實施例18-聚乙二醇化的胰島素增加的藥物裝載量和包封效率表3的數據顯示聚乙二醇化的胰島素可增加通過單相和雙乳化方法製備的PLGA微球中的藥物裝載量。聚乙二醇化的胰島素還具有較高的包封效率，當使用高生物活性肽和蛋白質時，這是一個主要的優勢。表3、胰島素和PEG-胰島素微粒的特徵tableseeoriginaldocumentpage21a理論裝載量(活性物的重量/活性物和聚合物的總重量)CL-核心裝載量(在孩t粒中單獨的活性物的重量百分比Wt%)EE-包封效率(在製備過程中包封的活性物的％)PS-平均粒徑(從SEM估計)實施例19-PLGA-包封的PEG-胰島素的降血糖作用將PEG-胰島素PLGA微球和等劑量的游離胰島素皮下給予正常的大鼠。定時抽取血液並防止凝血。通過標準試驗測量血液的葡萄糖水平。如表4顯示，與未修飾^^島素所觀察到的數據相比，使用在PLGA微球中的PEG-胰島素顯著抑制血糖中最初的降低。另外，這些數據很重要地顯示PEG-胰島素微球製劑以生物活性的形式釋放其藥物，在體內動物模型中，能夠有效地降低血糖水平，而沒有未修飾的、常規製劑的"爆發釋放"作用。表4、胰島素和PEG-胰島素微粒的體內研究胰島素(Humulin-U)PEG-胰島素時間(小時)%BGLaSD%BGLaSD010001000125.86.6111.116214.911.486.517.6468.111.69713.3689.3798.512.18751.7826.81275.88.288.86.6%BGL表示將所示的葡萄^t值標準化為基礎水平的百分率IV、傳遞GM-CSF的製劑的製備和特徵實施例20-聚乙二醇綴合的GM-CSF的製備按如下方法將GM-CSF共價連接到聚乙二醇(PEG)上在室溫下，將100mgGM-CSF溶解於10mlpH7.5的磷酸鹽緩衝液中。然後加入100mgtresyl-單甲氧基-聚乙二醇(MW二5000道爾頓)，攪拌該混合物1小時。通過凝膠色譜層析，將未反應的GM-CSF和聚乙二醇化的GM-CSF部分從未反應的tresyl-單曱氧基-聚乙二醇分離出來。然後將聚乙二醇化的GM-CSF透析到100mMTris緩衝液中，並調節到50mg/ml的濃度。22實施例21—包封的聚乙二醇化的GM-CSF的微粒製備如下製備包封的聚乙二醇化的GM-CSF的微粒將6.0gPLGA(50:50丙交酯乙交酯；固有粘度0.35L/g)溶解於2ml乙酸乙酯中。加入1ml實施例20的聚乙二醇化的GM-CSF,並用勻漿器以10,000rpm快速攪拌，製成油包水乳化液。然後抽吸該聚合物/藥物/乙酸乙酯乳化液通過一個靜力攪拌器與泵出的含有1%聚乙烯醇(PVA)的水流結合。該作用製成一種w/o/w乳化液，隨後攪拌下，將其加入到1升5C的水中。在2小時後，在一個25微米篩網上收集含有聚乙二醇化的GM-CSF的變硬的PLGA微球，乾燥。所產生的微球粒徑範圍將在25-200pm之間。實施例22-包封的聚乙二醇化的GM-CSF的納米粒製備如下製備包封的聚乙二醇化的GM-CSF的納米粒將3.0gmPLGA(與實施例21相同的材料》容解於5ml二氯曱烷和5ml丙酮中。加入0.5ml來自實施例20的聚乙二醇化的GM-CSF，並用勻化器以10,000rpm攪拌該混合物。將該混合物加入到200ml含有5%PVA的水中。然後以15,000rpm勻化該混合物，勻化時間要求能形成直徑小於l.O微米的納米粒。通過真空移除有機溶劑，從水中回收納米球，乾燥。等價物只是使用常規的實驗方法，本領域的技術人員將能識別，或能夠確定本文所述的本發明的具體實施方案的許多等價物。以下權利要求將囊括此類等價物。另外，此中引用的所有專利和出版物的全部內容通過引用結合到本文中。權利要求1.一種控制生物活性分子釋放的藥物製劑，該製劑包含一種與生物活性分子和親水性聚合物的綴合物結合的生物可降解的聚合物。2.權利要求l的藥物製劑，其中所述生物活性分子和親水性聚合物是共價連接的。3.權利要求l的藥物製劑，其中所述生物可降解的聚合物選自聚羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物。4.權利要求3的藥物製劑，其中所述生物可降解的聚合物選自聚酐、聚原酸酯和多糖聚合物。5.權利要求l的藥物製劑，其中所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇和它們的直鏈和支鏈衍生物。6.權利要求l的藥物製劑，其中所述生物可降解的聚合物被配製成包封所述綴合物的微粒或納米粒。7.權利要求l的藥物製劑，其中所述生物活性分子選自a-幹擾素、(3-幹擾素、Y-幹擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素l、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬醯胺酶、腺苷脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素^^卩制素、生長激素、胸腺素、副曱狀腺激素、色素激素、生長調節素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、曱狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆抗體、多克隆抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、4氐分子量肝素和小的生物活性分子。8.—種控制生物活性分子系統性傳遞給患者的方法，該方法包的生物可降解聚合物的組合物。9.權利要求8的方法，其中所述組合物經口服給予。10.權利要求8的方法，其中所述組合物通過吸入或黏膜傳遞給藥。11.權利要求8的方法，其中所述組合物通過注射給藥。12.權利要求ll的方法，其中所述注射為皮下或肌內注射。13.權利要求8的方法，其中所述生物活性分子和親水性聚合物是共價連接的。14.權利要求8的方法，其中生物可降解的聚合物選自聚羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物。15.權利要求8的方法，其中所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇和它們的直鏈和支鏈衍生物。16.權利要求8的方法，其中所述生物可降解的聚合物被配製成包封所述綴合物的微粒或納米粒。17.權利要求8的方法，其中所述活性分子選自a-幹擾素、p-幹擾素、Y-幹擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素l、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬醯胺酶、腺苷脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副曱狀腺激素、色素激素、生長調節素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆抗體、多克隆抗體、反義寡核普酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。18.—種增加生物活性分子的生物利用度的方法，該方法包括使所述生物活性分子與親水性聚合物綴合，將該綴合的生物活性分子與生物可降解的聚合物配製成製劑，然後將得到的製劑給予患者。19.權利要求18的方法，其中所述生物可降解的聚合物被配製成包封所述綴合物的納米粒。20.權利要求18的方法，其中所述製劑經口服給予。21.權利要求18的方法，其中所述生物活性分子和親水性聚合物是共價連接的。22.權利要求18的方法，其中所述生物可降解的聚合物選自聚羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物。23.權利要求18的方法，其中所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇和它們的直鏈和支鏈衍生物。24.權利要求18的方法，其中所述生物可降解的聚合物被配製成包封所述綴合物的微粒或納米粒。25.權利要求18的方法，其中所述活性分子選自ot-幹擾素、卩-幹擾素、Y-幹擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素l、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬醯胺酶、腺苦脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副曱狀腺激素、色素激素、生長調節素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、曱狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆抗體、多克隆抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。26.—種降低生物活性分子免疫原性的方法，該方法包括使所述生物活性分子與一種親水性聚合物綴合，將該綴合的生物活性分子與生物可降解的聚合物配製成製劑，然後將得到的製劑給予患者。27.權利要求26的方法，其中所述組合物通過口服給予。28.權利要求26的方法，其中所述生物活性分子和親水性聚合物是共價連接的。29.權利要求26的方法，其中所述生物可降解的聚合物選自聚羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物。30.權利要求26的方法，其中所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇和它們的直鏈和支鏈衍生物。31.權利要求26的方法，其中所述生物可降解的聚合物被配製成包封所述綴合物的微粒或納米粒。32.權利要求26的方法，其中所述活性分子選自oc-幹擾素、p-幹擾素、Y-幹擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落剌激因子、白細胞介素l、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬醯胺酶、腺苦脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副甲狀腺激素、色素激素、生長調節素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、曱狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆抗體、多克隆抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。全文摘要本發明提高生物活性分子傳遞的方法和組合物。本發明開發了控制、延長生物活性分子如治療性蛋白質、肽和低聚核苷酸釋放的製劑。這些製劑以生物可降解的、合成的聚合物如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)及其它們的共聚物聯合形成的微粒或納米粒為基礎。將生物活性分子偶合到親水性的聚合物如聚乙二醇或聚丙二醇中，並製成能提供控制釋放的製劑。相對於未偶合到親水性聚合物上的相同的生物活性分子，所述生物活性分子更穩定、免疫原性更低並且改善了釋放速率，具有更低的爆發水平並增加了藥物的裝載量。所述控釋製劑可通過注射、吸入、鼻內或口服給藥。文檔編號A61K47/34GK101584867SQ20081017779公開日2009年11月25日申請日期2001年10月31日優先權日2000年10月31日發明者D·路易斯,K·欣德斯,P·施密德特申請人:瑟莫迪克斯藥品公司