一種提高鹽樺苗種成活率的方法
2023-06-02 11:46:01
專利名稱：一種提高鹽樺苗種成活率的方法
技術領域：
屬於植物組織培養，煉苗移栽技術領域，確切地說是涉及鹽樺的組織培養繁殖技
術和試管苗煉苗移栽技術。
背景技術：
鹽樺(Betrla halophila Ching)為樺木科樺木屬植物，落葉小喬木或直立大灌木，樹高3 4米。樹皮和小枝為灰褐色，小枝有短而密的白色柔毛，及黃色的樹脂腺體。葉長2.5 4.5釐米，卵形或菱形。果序為下垂的圓柱形，長2 3釐米，直徑約l釐米。小堅果呈卵形，長2毫米，寬1. 5毫米，膜質果翅寬闊，寬度為果的1. 5倍，翅的兩面均有疏而短的柔毛。屬於中性植物，喜光，喜土壤潮溼。它的地理分布範圍極為狹小，僅產於阿勒泰縣內朗河的下遊，是我國著名的植物學家秦仁昌教授發現定名的新種。
鹽樺抗鹽能力非常強，超過世界上任何一種喬木，在幼苗期抗鹽率即可達到1. 3%以上，是以抗鹽鹼著稱的胡楊、沙棗抗鹽率的5倍以上，是鹽鹼地綠化和造林的重要樹種，也可以改良土壤，因此其保護和開發價值很大。它被列為國家二級珍稀瀕危植物，是原生地已瀕臨滅絕的小喬木樹種，僅存於我國新疆阿勒泰地區， 一旦滅絕，則我國乃至世界植物名錄上將永遠消失。因此開展鹽樺繁殖方面的研究，對推廣和應用鹽樺尤為重要。
目前鹽樺一般用種子繁殖，為溼地的指示灌木，但由於種源稀少，扦插成活率低，不能大量育苗。因此，通過組織培養快速繁殖鹽樺是一種非常有效的途徑，可以極大地提高其繁殖係數，為生產提供大量苗木。我國對鹽樺的組織培養研究較少，主要對鹽樺的芽增殖誘導階段和誘導生根階段進行研究，並獲得了生根植株，在理論上進行生產是可行的，但尚未投入生產。 在文獻中較多地取用休眠枝為外植體，在實驗室萌發後取樣，周期較長，長勢較弱。另外，由於枝條上密布許多短而密的白色柔毛及黃色的樹脂腺體，而且採自於自然環境下，自身附帶的汙染物較多，一般使用升汞，但是利用升汞對外植體進行滅菌容易造成材料死亡率較高，並對環境汙染嚴重，故不提倡使用；次氯酸鈉滅菌效果好、對環境汙染較小、使用方便等優點是外植體滅菌劑的最佳選擇。 在鹽樺無菌苗增殖的過程中，容易導致苗木細弱，生根困難。還有煉苗、移栽過程，國內報導的方法大多是經過洗淨根部的培養基後，移栽至滅過菌的單一介質(蛭石、細紗等)中，由於鹽樺無菌苗的葉薄、根肉質，容易滋生雜菌，降低了成活率；使用這些單一的介質容易導致苗木生長細弱，不利於以後的大田移苗。
發明內容
本發明提供用於改良土壤和綠化、可適合大量繁殖的一種提高鹽樺苗種成活率的方法。 本發明採取的技術方案 —種提高鹽樺苗種成活率的方法，其方案是由鹽樺組織培養和煉苗移栽兩個過程構成，並按以下操作步驟分別實施鹽樺組織培養和煉苗移栽 (1)製作無菌芽在生長季節，選用半木質化的帶芽莖段作為外植體，用洗潔精搓洗去枝條表面的毛；以70%的乙醇浸泡lmin後，然後用10%次氯酸鈉浸泡12min ;滅菌處理後，將莖段接種到培養基MS+BA1. 0 1. 5mg/L進行培養； (2)增殖過程將無菌芽接種於培養基MS+6-BA0. 1-1. Omg/L+NAAO-O. 5mg/L中，並每隔4周將新芽和莖段分割切下並接種到新的培養基中繼續擴增； (3)壯苗和生根將無菌芽接種到MS+BAO. 1 1. Omg/L+NAAO 0. lmg/L培養基中進行壯苗培養，4周後選取枝幹健壯的無菌苗轉接到1/2MS+IBA0. 1 0. 5mg/L培養基中進行生根；並由以下操作完成煉苗移栽， (4)移栽預處理將生根無菌苗在自然條件下鍛鍊1周，用鑷子取出生根苗，洗淨根上的培養基，用1000-1500倍的適樂時藥劑浸泡10-20分種， (5)製作栽培基質用滅菌過的蛭石、珍珠巖、草炭依3，3，4重量百分數混合構成基質；移栽前用同濃度藥劑淋透生根苗，並放置1天； (6)移栽後管理先由塑料膜覆蓋，使溼度60% 80%，溫度28 30" ;20 30天後移至溫室培養，逐步打開薄膜，增加光照，10天後進入一般地養護。
實施本發明後的積極效果是 本發明提高了鹽樺苗種的成活率，移栽成活率達95%以上。為大量繁殖優質的鹽樺工程苗，滿足上海臨港新城鹽鹼地，改良土壤和綠化需要創造了條件。
具體實施例方式
現對本發明作進一步說明
1.鹽樺無菌芽的獲得 選取休眠芽或長勢旺盛的健壯枝條為外植體，剪去葉片後，用洗潔精輕輕搓洗，再用流水衝洗2-3小時，去除枝條表面汙物。轉移到超淨工作檯上，剪成2cm左右長的帶芽莖段，放入每個無菌三角瓶中。先用70%的酒精浸泡lmin，然後按照下述方法進行滅菌處理
(1)用0. 1%升汞消毒8分鐘，最後用無菌水洗3-6次；
(2)用0. 1%升汞消毒15分鐘，最後用無菌水洗3-6次；
(3)用0. 1%升汞消毒20分鐘，最後用無菌水洗3-6次；
(4)用10%次氯酸鈉消毒6分鐘，最後用無菌水洗3-6次；
(5)用10%次氯酸鈉消毒8分鐘，最後用無菌水洗3-6次；
(6)用10%次氯酸鈉消毒12分鐘，最後用無菌水洗3-6次； 經過以上方法滅菌處理後，將莖段接種到培養基MS+BA1. 0 1. 5mg/L上，並置於培養箱中培養。培養箱光照強度為2500 30001x，光照時間14h/d，溫度為24t:左右。期間注意觀察，隨時剔除汙染的材料，並將無汙染的材料轉接到新的培養基上，以免交叉感染。30天後統計經上述處理後的汙染率，比較不同消毒方法的滅菌效果。 上述結果表明利用升汞消毒休眠芽與次氯酸鈉消毒半木質化莖段相比，本發明先用洗潔精輕輕搓洗後，流水衝洗2-3小時，再用10%次氯酸鈉消毒12分鐘滅菌的方法能夠顯著降低外植體的汙染率，能夠得到更多地無菌芽。
表1不同滅菌方法的汙染情況
編 號滅菌試劑材料5餘 m 、接種數 (個)汙染個數 (個)汙染率 (%)
10.1%升汞休眠芽8504794
20.1%升汞休眠芽15504080
30.1%升汞休眠芽20503264
410%次氯酸鈉半木質化莖段6301446
10%次氯酸鈉半木質化莖段8301034
610%次氯酸鈉半木質化莖段1230825 2.鹽樺的增殖 由以上步驟獲得的無菌個體經過4周培養後，將成功誘導出的側枝切下，過長的莖段再以每2cm長度切小，將每段接種於MS+BA0. 1 1. 0mg/L+NAA0 0. lmg/L培養基中。以後每隔4周將長大的材料按上述方法重複切割，以獲得足夠多的無菌苗種。上述擴增培養過程仍在培養箱中進行，光照和溫度保持不變。
3.鹽樺的壯苗及生根 將上述步驟獲得的無菌側芽接種到激素含量較低的MS+BA0. 1 1. 0mg/L+NAA0 0. lmg/L培養基進行壯苗培養，培養4周後選取枝幹健壯的無菌苗，轉接到l/2MS+IBA0. l 0. 5mg/L培養基中進行生根培養。經過30天的生根培養，生根率達96%，根粗壯，有4 5條側生根。 4.鹽樺無菌苗的移栽 先將無菌苗在自然條件下鍛鍊1周，用鑷子小心取出生根苗，洗淨根上的培養基，用1000-1500倍的適樂時藥劑浸泡10-20分種。然後移栽至高壓滅菌過4種不同配方的基質中(l)珍珠巖；(2)蛭石；(3)細沙；(4)蛭石珍珠巖草炭。移栽前用同濃度藥劑淋透放置1天，然後移栽。移栽後先在弱光下培養，塑料膜覆蓋，保證溼度60% 80 % ，溫度28 30°C，20 30天後移至溫室培養，慢慢打開薄膜，逐漸增加光照。10天後進行一般地養護。 經過不同基質的比較，結果表明成活率最高的是蛭石和蛭石珍珠巖草炭=3:3: 4，沒有葉片發黴以及根系萎縮現象，並且能夠長出側生根，也能快速的長出新芽，成活率為ioo%。經過2個月的栽培養護後，再比較這兩種基質，生長於蛭石珍珠巖草炭=3:3:4基質中的苗木生長速度快，苗木粗壯，因此更適合作為無菌苗的移栽基質。 表2不同介質對於鹽樺移栽成活率的影響
編號基質總數(株)成活數(株)成活率％
1珍珠巖363186.11
2蛭石3636100.00
細沙362775.00
4蛭石:珍珠巖:草炭 3:3:43636100.00
本發明的優點效果在於
(1)獲得鹽樺無菌苗。鹽樺枝條上密布許多短而密的白色柔毛及黃色的樹脂腺體，
5而且採集於野外自然環境條件下，自身附帶的汙染物較多，其滅菌過程具有相當的難度。本 技術採用較溫和的洗潔精，輕輕地搓洗去枝條表面的毛，初步降低汙染後，再以70%的乙醇 lmin以及10%次氯酸鈉處理12min，平均無菌率70X以上。 (2)建立鹽樺快速繁殖體系。本技術在獲得鹽樺無菌苗的基礎上，直接利用其側芽 進行分割繁殖，步驟簡單，操作方便。並在這過程中增加了壯苗的環節，有利於增加鹽樺組 培苗的生根率。期間未涉及愈傷組織的脫分化和分化過程，儘量避免了組織培養過程中遺 傳變異的可能性，一旦獲得無菌芽，即可進行長期繁殖生產。所用試劑均為常規化工產品， 成本低廉，便於大規模工廠化生產。 (3)苗木移栽在移栽時用藥劑進行浸泡處理，減少了病菌來源，預防病害的發 生，加快苗木生長；同時利用蛭石、珍珠巖、草炭不同配比作為鹽樺組培苗的移栽基質，有利 於以後種植，苗木恢復生長快。本項目可不分季節，隨時為臨港新城鹽鹼地綠化提供優質工 程苗。MS培養基(Murashing and skoog medium)的標準配方如下(單位mg/L) KN03 1900 NH萬 1650 CaCL2 2H20 440 MgS04 7H20 370 KH2P04 170 KI 0. 83 H3B03 6. 2 MnS04 4H20 22. 3 ZnS04 7H20 8. 6 Na2Mo04 2H20 0. 25 CuS04 5H20 0. 025 CoCL2 6H20 0. 025 Na2EDTA 2H20 37. 3 FeS04 7H20 27. 8 煙酸 0.5 鹽酸吡卩多醇 0. 5 鹽酸硫胺素 0. 1 甘氨酸 2 肌醇 100 MS/2，即大量元素含量減半的MS培養基。培養基按濃度配好後添加瓊脂30g/L， 蔗糖7g/L，然後用稀HC1或NaOH調整pH值到5. 8，分裝到250ml培養瓶中，最後在121°C 、 0. IMPa滅菌20min。
實施例 於2008年6月從上海市園林科學研究所鄔橋基地採集半木質化的鹽樺枝條為外 植體，剪去葉片後用洗潔精輕輕搓洗，流水衝洗2小時。在超淨工作檯上，剪成2cm左右長 的帶芽莖段10個，先用70%的酒精浸泡lmin，然後用10%次氯酸鈉消毒12分鐘，最後用無
6菌水洗3次後接種在MS+BA1. 0 1. 5mg/L培養基上，於培養箱中培養。箱培養光照強度為 2500 30001x，光照時間14h/d，溫度為24"左右。經過觀察，發現6個莖段汙染，另外4個 莖段無菌並側芽開始生長。4周後，將側枝切下接種於新的培養基中，繼續培養4周後再次 分割，每瓶8個芽，共3瓶。5個月後，將獲得的無菌側芽接種到激素含量較低的MS+BAO. 1 1. 0mg/L+NAA0 0. lmg/L培養基中進行壯苗培養，培養4周後選取枝幹健壯的無菌苗，轉接 到1/2MS+IBA0. 1 0. 5mg/L培養基中進行生根培養。最後將生根苗鍛鍊後移栽在蛭石
珍珠巖草炭=3 : 3 : 4基質中，獲得工程苗120株。
權利要求
一種提高鹽樺苗種成活率的方法，其特徵是由鹽樺組織培養和煉苗移栽兩個過程構成，並按以下操作步驟分別實施鹽樺組織培養和煉苗移栽(1)製作無菌芽在生長季節，選用半木質化的帶芽莖段作為外植體，用洗潔精搓洗去枝條表面的毛；以70％的乙醇浸泡1min；後以10％次氯酸鈉浸泡12min；滅菌處理後，將莖段接種到培養基MS+BA1.0～1.5mg/L進行培養；(2)增殖過程將無菌芽接種於培養基MS+6-BA0.1-1.0mg/L+NAA0-0.5mg/L中，並每隔4周將新芽和莖段分割切下並接種到新的培養基中繼續擴增；(3)壯苗和生根將無菌芽接種到MS+BA0.1～1.0mg/L+NAA0～0.1mg/L培養基中進行壯苗培養，4周後選取枝幹健壯的無菌苗轉接到1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L培養基中進行生根；並由以下操作完成煉苗移栽，(4)移栽預處理將生根無菌苗在自然條件下鍛鍊1周，用鑷子取出生根苗，洗淨根上的培養基，用1000-1500倍的適樂時藥劑浸泡10-20分種，(5)製作栽培基質用滅菌過的蛭石，珍珠巖，草炭依3，3，4重量百分數混合構成基質藥劑；移栽前用同濃度藥劑淋透生根苗，並放置1天；(3)移栽後管理先由塑料膜覆蓋，使溼度60％～80％，溫度28～30℃；20～30天後移至溫室培養，逐步打開薄膜，逐漸增加光照，10天後進入一般地養護。
全文摘要
一種提高鹽樺苗種成活率的方法，屬於植物組織培養，煉苗移栽技術領域，確切地說是涉及鹽樺的組織培養繁殖技術和試管苗煉苗移栽技術。其特點是由鹽樺組織培養和煉苗移栽兩個過程構成，並按以下操作步驟分別實施鹽樺組織培養和煉苗移栽製作無菌芽，增殖，壯苗和生根，移栽預處理，製作栽培基質，移栽後管理。本發明提高了鹽樺苗種的成活率，移栽成活率達95％以上。為大量繁殖優質的鹽樺工程苗，滿足上海臨港新城鹽鹼地，改良土壤和綠化需要創造了條件。
文檔編號A01G31/00GK101703001SQ200910195950
公開日2010年5月12日 申請日期2009年9月21日 優先權日2009年9月21日
發明者崔心紅, 張群, 朱義, 羅玉蘭 申請人:上海市園林科學研究所