一種高效作物防病增產菌的選育與生產工藝的製作方法

2023-06-02 12:05:36 1

專利名稱：一種高效作物防病增產菌的選育與生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種作物防病增產菌，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TG26菌株及其篩選和菌劑的生產方法。
在世界範圍內，植物病害始終嚴重而普遍地給農業生產造成嚴重的損失。化學農藥在防病增產過程中雖然起到了顯著作用，但也造成了環境汙染和人畜中毒等弊端。因此近年來世界各國對微生物農藥的發展及應用引起了廣泛的重視，並取得了較好的成效。在拮抗菌利用方面以防蟲為多(Hall，I.M.，1963，Fast，P.G.，1978-1981)，在防病利用上又以真菌居多(Macfarlane.G.，1984，Boland，G.J.1990)。目前世界上利用細菌及細菌素防治植物病害最成功的是用農桿菌K84(Kerr，A.1980)防治多種蔬菜、果樹的根癌病，在澳大利亞已經商品化，在歐美有一定的推廣面積。在作物增產菌方面，陳延熙(1984)提出了「植物體自然生態系」理論，FokkemaSchippers(1986)和Inglis Boland(1990)也提出了相似的理論。陳延熙等1990年根據上述理論從作物體中分離出了地衣芽孢桿菌(Bacillus Lichenif-ormis)和蠟質芽孢桿菌(Bacillus cerellus)並以多種菌株組合群體發展成具有保健作用的增產菌劑。
本發明的目的在於以植物生態學原理為基礎，從根際土壤或植物組織上分離得到產細菌素的植物活性菌;並提供這種對植物病害有防治作用和對植物生長有促進作用的生物活性菌劑的生產方法。因此，本發明著眼點在於篩選對多種植物病原菌有抑菌活性並且可使作物增產的拮抗菌株。使其能防治多種病害，又有增產作用，在多效性及廣譜性上優於目前的微生物農藥製劑。經過大量篩選工作從絲瓜根部分離純化出了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TG26菌株。
本發明的技術方案概況為以下具體步驟1.TG26菌株的分離純化從雙子葉植物絲瓜、大豆、蕃茄，單子葉植物玉米、水稻、小麥等根圍10cm土壤，地上莖、葉片、果實或穗表皮取樣。從樣品中隨機取5g/份，各取20份。每份加入50ml無菌水，於75-100℃煮沸5-30分鐘，沉澱8-12小時後，取上清釋109倍，塗布於已塗有濃度適中的病原指示菌的培養基上，培養24-48小時，挑取周圍有無菌區的單菌落。對初篩出的單菌落進一步分離純化，並測定對各種植物病原菌的抑菌活性。從中選出菌落生長快、抑菌帶寬、抗菌譜廣的菌株。所選出的具有高效抑菌活性TG26菌株的抑菌活性及病原指示菌見表1。該菌株是從絲瓜根部土壤中分離得到的。
2.TG26菌株的鑑定TG26菌株的群體特徵菌落在NDA平板上呈圓形，中間凸起，邊緣整齊，表面皺褶，不透明，淺黃色。菌落直徑為0.55cm/24h在NUB液體培養基中靜止培養時有菌膜形成，細胞穩定。
個體形態細胞為直杆狀，0.7-0.8×2.0-2.4μm，芽孢橢圓形近中生，孢囊不膨大，鞭毛周生，運動。原生質染色均勻。
理化特性好氧，在pH5.7培養基上或7%的NaCl培養基中均生長。過氧化氫酶反應產氣，甲基乙醯甲醇試驗陽性，V.P培養液生長7天後pH為5.5。利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產酸。抗溶菌酶、不抗疊氮化鈉，水解澱粉，利用檸檬酸鹽，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，不利用丙酸鹽。生長溫度為8-50℃，最適生長溫度為25-35℃;pH4-9都能生長，最適pH為6.5-7.5。
能產生大量有抑菌活性的孢外蛋白，幾種抗菌蛋白經Sephadex-G150和FPLC的MonoQ柱已經純化出來，其胺基酸組成見表2。
根據上述特徵特性，該菌屬於第八版「伯傑氏鑑定細菌學手冊」中的芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌株已送CGMCC保存，保存號№0182。
3.TG26菌劑的生產工藝將分離得到的TG26菌株按下述程序進行培養見附圖1。
上述原種培養基配方為蛋白腖0.8-1.2%;葡萄糖0.4-0.8%;酵母膏0.4-0.8%;NaCl 0.4-0.8%;牛肉膏0.4-0.8%;以水補足體積;調初始pH7.0-7.4。
固體培養基加1.6-2.0%的瓊脂。
(1)原種的培養將配好的液體培養基以1/3容量盛裝三角瓶，於121-125℃下滅菌20-30分鐘，冷卻後以1%的接種量接種。32-34℃培養24-36小時，做為原種。
(2)液體發酵於發酵罐中盛2/3體積的液體培養基，滅菌(121-125℃，20-30分鐘)，冷卻後以1%的接種量接種，通氣量為1∶1(V∶V)，30-32℃培養48-72小時，然後放罐混入輕質碳酸鈣和0.1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)為乳化劑，噴霧乾燥成可溼性粉劑。或直接包裝即成產品。
(3)固體淺盤培養培養基蛋白腖1.2-1.6%，葡萄糖0.3-1.2%，酵母提取物0.3-1.2%，NaCl 0.6-1.0%，牛肉膏0.8-1.2%，水15-20%，SDS 0.1%;調pH7.0-7.4，其餘為輕質碳酸鈣(160-200目)。
將培養料混勻後於121℃下滅菌30-40分鐘，鋪入淺盤，厚1.5-3.0cm，接5-7%的原菌劑，拌勻，開放培養48-72小時，乾燥後過篩包裝成粉劑。含活細胞數大於100億/g。
4.TG26菌劑的使用方法(1)拌種液體菌劑40-50ml/畝或固體粉劑10-15g/畝，加入適量水拌入種子，稍幹後播種。
(2)浸種適用於需發芽播種的作物，發好芽的種子，播種前用液體菌劑40-50ml/畝或固體粉劑10-15g/畝，加適量的水浸種40-50分鐘後播種。
(3)浸根適用於移栽作物前施用，在作物移栽前用菌劑50-60ml/畝或固體粉劑15-20g/畝，加適量水浸根40-60分鐘後移栽。
(4)灌根在作物生長期易感病害前用液體菌劑50-60ml/畝或固體粉劑15-20g/畝，加適量水灌根。
(5)噴霧在作物生長期易感病害前，用液體菌劑30-50ml/畝或固體粉劑10-15g/畝，加適量水均勻噴到植株上。
目的為了防治植物根部病害或以單純性增產為主要目的，應以浸種(拌種)，浸根和灌根的方法施用如以防治植物地上部分病害應以噴霧施用效果為佳;也可兩種以上方法配合使用。
5.TG26菌劑防病增產效果對目前已經測試的小麥赤黴病，西瓜枯萎病和菸草青枯病都有良好的防病增產效果。實施實例中菌劑培養如前所述。
實施實例1，小麥赤黴病在感病程度不同的小麥品種開花前三天噴霧TG26菌劑，表面出很好的防病效果，病小穗數及防效見表3。在江蘇小麥赤黴病常發區的防效為76.4%，並有明顯的增產作用。
實施實例2，西瓜枯萎病浸種處理對西瓜枯萎病苗期防效為100%，成株期防效83.3-93.3%，田間灌根防效為73.1%，增產65.5%。
實施實例3，菸草青枯病浸根處理對菸草青枯病苗期防效為100%，田間成株期灌根防效79.6%，增產60.2%。
實施實例4，單純性增產實驗灌根處理使菸草根長增加49.23%，葉乾重增加22.92%，其相關指標也明顯增加(見表4)。
6.TG26菌株防病增產性機制及優點防病增產性機制的初步研究表明，TG26菌株分泌的抗菌蛋白對植物病原真菌的分生孢子及細菌細胞有溶解作用，對病原菌的生長有抑制作用。施入土壤後，能增加土壤中速效磷的含量，促進植物吸收土壤中的氮，使植物與土壤之間的良性循環性增強。沒有汙染和殘毒，不影響生態環境，只是在作物生長的短期內，於局部位置上形成優勢，發揮其積極作用。時間一延長，作物生長發育後施入的菌劑量就又很快恢復到使用前水平。
同時該菌劑還具有適用於大規模生產，有效菌株單純，工藝簡便，成本低廉，每畝地成本只需幾角錢，使用方便，一般可以結合常規田間管理措施進行使用。


圖1 菌劑的生產工藝圖表1 拮抗菌TG26及其粗蛋白的抗菌譜抗菌活性病原菌菌落 粗蛋白小麥赤黴病菌(Gibberella zeae)JF3(SV) +++ +++F15(SV) +++ +++F17(SV) +++ +++F4(SV) ++ ++F10(SV) ++ ++F34(SV) +++ +++F23(WV) ++++ ++++F52(WV) ++++ +++H28(MV) +++ +++H20(WV) ++++ +++水稻稻瘟病菌(Piricularia oryzae)91-78-1(SV) +++++ ++++91-3-1(SV) ++++ ++++2h2-1(MV) +++++ ++++玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)T(SV) +++++ ++++O(SV) +++++ ++++玉米大斑病菌(Helminthosporium turcioum)No1(SV) + +
棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.
vasinfectum) (SV) +++ +++西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.
niveum) (SV) ++ ++蕃茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.
lycopersici) (SV) +++ +++小麥紋枯病菌(Rhizootonia cerealis)(SV) +++ +++菸草赤星病菌(Alternaria longipes)3.1015(SV) ++++ ++++3.4225(SV) ++++ ++++人參鏽腐病菌(Ramularia panacicola)(SV) ++++ ++++水稻白葉枯病菌(Xanthomonas campestris)pv.oxyzae X61(SV) +++ +++菸草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)T62P(SV) +++++ ++++T62(MV) +++++ ++++T64(WV) +++++ ++++「+」抑菌圈直徑(mm)，+10.0-15.0;++15.1-20.1;+++20.1-25.1;++++25.1-30.1;+++++＞30.1
表2 幾種抗菌蛋白的胺基酸組成＊

根據胺基酸組成計算的分子量BⅠ為13970;BⅡ為14497;
BⅢ為15345。
表3，TG26菌劑在不同小麥品種上對赤黴病的防治效果病小穗數(個) 防效(%)品種 抗感性CK 接種前處理 接種後處理 接種前處理 接種後處理荊州1號 MR 2.16 0.66 1.00 69.40 53.70新中長 MR 3.13 0.71 1.11 74.00 64.50揚麥5號 MS 3.25 0.78 1.11 76.00 65.80鎮7495 MS 4.00 0.86 1.77 78.43 55.75Alondra"S" S 4.96 0.88 1.86 82.25 62.50Anhuill S 6.00 0.81 2.40 86.46 60.00894037 S 4.87 0.55 1.83 88.70 62.40寧麥6號 S 7.78 0.79 1.86 89.80 65.80

權利要求
1.本發明屬於微生物領域中利用細菌及其產生的細菌素防治植物病害和促使作物產量增加的作物防病增產菌TG26及其選育與生產方法，其特徵是包括TG26菌株、分離篩選、原種擴繁、固體發酵和液體發酵工藝。
2.權利要求1所述防病增產菌TG26菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其主要特徵為(1)菌落在NDA平板上呈圓形，中間凸起，邊緣整齊，表面皺褶，不透明，淺黃色。直徑為0.55cm/24h在NUB液體培養時有菌膜形成，細胞穩定。細胞為直杆狀，0.7-0.8×2.0-2.4μm，芽孢橢圓形近中生，孢囊不膨大，鞭毛周生，運動。原生質染色均勻。(2)好氧，在pH 5.7培養基上或7%的NaCl培養基中均生長。過氧化氫酶反應產氣，甲基乙醯甲醇試驗陽性，V.P培養液生長7天後pH為5.5。利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產酸。抗溶菌酶、不抗疊氮化鈉、水解澱粉、利用檸檬酸鹽，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，不利用丙酸鹽。生長溫度為8-50℃，最適生長溫度為25-35℃;pH 4-9都能生長，最適pH為6.5-7.5。(3)能產生大量的有抑菌活性的孢外蛋白，幾種純化的抗菌蛋白的特徵見說明書中表2。
3.權利要求1所述防病增產菌TG26分離篩選方法的主要特徵為從雙子葉植物絲瓜、大豆、蕃茄，單子葉植物玉米、水稻、小麥等根圍10cm土壤、地上莖、葉片、果實或穗表皮取樣，從樣品中隨機取5g/份，各取20份，每份加入50ml無菌水，於75-100℃煮沸5-30分鐘，沉澱8-12小時，取上清稀釋109倍，塗布於已塗有濃度適中的病原指示菌的培養基上，培養24-48小時，挑取周圍有無菌區的單菌落，從中選出菌落生長快、抑菌帶寬、抗菌譜廣的菌株。
4.權利要求1所述原種擴繁的特點為原種培養基配方蛋白腖0.8-1.2%;葡萄糖0.4-0.8%;酵母膏0.4-0.8%;NaCl 0.4-0.8%;牛肉膏0.4-0.8%，以水補足體積;初始pH7.0-7.4;滅菌溫度121-125℃，15-20分鐘，接種量為1%;32-34℃培養24-36小時。
5.權利要求1所述液體發酵工藝的特點為接種量為1%，通氣量為1∶1(V∶V)，培養溫度30-32℃，時間48-72小時;載體為輕質碳酸鈣，乳化劑為十二烷基硫酸鈉0.1%。
6.權利要求1所述固體發酵工藝的特點為培養基中含蛋白腖1.2-1.6%，葡萄糖0.8-1.2%，酵母提取物0.8-1.2%，NaCl 0.6-1.0%，牛肉膏0.8-1.2%，水15-20%，SDS 0.1%;調pH 7.0-7.4;以輕質碳酸鈣補足體積;淺盤中經滅菌(121-125℃，30分鐘)的培養料厚1.5-3.0cm，接種量5-7%，28-32℃開放培養48-72小時。
全文摘要
高效作物防病增產菌TG26為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。菌種篩選工藝中，採用從雙子葉植物絲瓜、大豆、蕃茄，單子葉植物玉米、水稻、小麥等根圍10cmm土壤、地上莖、葉片、果實或穗表皮取樣。分離時首先經75—100℃煮沸，選取芽孢桿菌。選擇生長快、抑菌活性強和抗菌譜廣的菌株。經檢測TG26菌株能分泌大量的抗菌蛋白，其菌劑對多種植物病原真菌和細菌都有很強的抑菌活性。對目前已經測定的三種植物病害都有防治作用。浸根處理對西瓜枯萎病和菸草青枯病苗期防效都達100％。對小麥赤黴病、西瓜枯萎病和菸草青枯病的田間防效分別為76.4％、73.1％和79.6％，並有明顯的增產作用。
文檔編號A01N63/04GK1074803SQ9211276
公開日1993年8月4日 申請日期1992年11月13日 優先權日1992年11月13日
發明者王雅平, 劉伊強, 潘乃穟, 陳章良 申請人:北京大學