用於治療系統性紅斑狼瘡的16/6id抗體肽的製作方法

2023-06-02 08:05:06 1

專利名稱：用於治療系統性紅斑狼瘡的16/6id抗體肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及合成肽，更具體地說，本發明涉及基於人單克隆抗DNA抗體互補決定區(CDR)的合成肽、包含所述合成肽的藥用組合物以及它們在免疫調節系統性紅斑狼瘡(SLE)相關反應中的應用。
縮寫16/6Id人16/6Id mAb；CDR互補決定區；CFA完全弗氏佐劑；hCDR肽基於人16/6Id mAb CDR區的肽；hCDR1SEQ ID NO6人類肽；hCDR3SEQ ID NO7的人類肽；人16/6IdmAb攜帶16/6Id的人致病性抗DNA mAb；ICD免疫複合物沉積；Id獨特型；LNC淋巴結細胞；mAb單克隆抗體；MMP基質金屬蛋白酶；mCDR1SEQ ID NO1小鼠肽；mCDR3SEQ ID NO3小鼠肽；PBL外周血淋巴細胞；PBS磷酸鹽緩衝鹽溶液；rev反向肽；SLE系統性紅斑狼瘡；SLEDAISLE疾病活動指數；TGF-β轉化生長因子β；UT未處理。
背景技術：
系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫病，其特徵在於出現一系列自身抗體，包括抗DNA抗體、抗核心抗原抗體和抗核糖核蛋白抗體。該疾病進行性發展伴有各種臨床表現和免疫複合物沉積引起的組織和器官損害。與其它自身免疫病理狀況相似，SLE病因學是遺傳、環境、激素和免疫學多因素的。目前沒有目的在於預防或治療SLE的特效治療。
名為16/6Id的人單克隆抗DNA抗體攜帶共有的獨特型(Shoenfeld等，1983)。已經發現該獨特型與SLE患者臨床相關。因此，在54％患有活動性疾病的SLE患者體內(Isenberg等，1984)，以及在SLE患者的感染器官中(Isenberg和Collins，1985)，已經發現16/6Id在抗DNA抗體上表達。用所述人抗DNA 16/6 Id mAb免疫未發展任何自發性自身免疫病的近交株小鼠，所述小鼠發展出SLE在人體內以及在該疾病自發性鼠模型中的主要特點(Mendlovic等，1988)。因此，免疫後，所述小鼠產生特異性針對16/6Id的抗體、攜帶16/6Id的抗體以及靶向不同核心抗原(dsDNA、ssDNA、Sm、核糖核蛋白、Ro、La及其它)的抗體。所述血清學發現與白細胞減少、紅細胞沉積率、蛋白尿、腎內免疫複合物增加以及腎小球硬化有關(Mendlovic等，1988)，這些表現是SLE的典型表現。
從實驗性SLE小鼠獲得的鼠抗16/6 Id mAb(Ab2)也能夠在小鼠中引起實驗性疾病(Mendlovic等，1989)，其引起的實驗性疾病與16/6Id(Ab1)所引起的實驗性疾病類似。此外，從實驗性SLE小鼠製備得到表達16/6 Id的鼠抗DNA mAb。名為5G12的抗體Ab3與特異性針對16/6Id的抗體反應。用後一種抗體免疫引起實驗性SLE，其表現與用人16/6Id(Ab1)和用鼠抗16/6Id(Ab2)mAb免疫後觀察到的表現類似(Waisman等，1993)。這些結果顯示16/6Id網絡在小鼠體內對於SLE的誘導以及進行的重要性。
為了解與SLE有關的自身抗體出現的機制，本發明的發明人已經用實驗性SLE的C3H.SW小鼠製備出多種單克隆抗體。通常能夠引發攜帶16/6 Id或與之反應的抗體的單克隆自身抗體有致病性，並因此能夠在小鼠中引起實驗性SLE(Fricke等，1990；Sthoeger等，1993)。
然後測序從實驗性SLE的C3H.SW小鼠分離的結合DNA或HeLa核提取物(NE)的九種自身抗體的可變(V)區(Waisman和Mozes，1993)。分析具有不同特異性的單克隆抗體，試圖確定所述不同自身抗體之間的聯繫。三種mAb結合DNA，並且表現致病性抗DNA抗體的序列特徵。這些mAb中名為2C4C2的一種mAb所使用的重(H)鏈V區基因(VH)與從其它易患狼瘡的小鼠(即(NZB x NZW)Fi)分離的抗DNA mAb的VH相同。MAb 2C4C2的輕(L)鏈V區基因(VL)與從(NZB x NZW)F1小鼠分離的另一種抗DNA mAb的VL有98％同源性。名為5G12-4和5G12-6另外兩種抗DNA mAb的VH序列與mAb 2C4C2的VH序列有93％同源性。根據對這些mAb的分析，看起來在實驗性SLE小鼠體內發現的自身抗體所使用的遺傳元件與從自發發展出狼瘡的小鼠株分離的mAb所使用的遺傳元件相似。
T細胞在實驗性SLE的誘導和發展中起重要作用。因此，特異性針對16/6Id的T細胞系和克隆在同系接受者體內引起實驗性SLE，其行為與16/6Id抗體類似。因此，當用所述細胞系的活化細胞接種小鼠後，所述小鼠出現SLE典型的血清學和腎損害(Fricke等，1991)。
如上文所述，從實驗性SLE小鼠分離的能夠結合DNA並且攜帶16/6Id的mAb 5G12能夠在小鼠中引起實驗性SLE(Waisman等，1993)。mAb特異性反應增殖的T細胞可能與攜帶來自它們互補決定區(CDR)序列的肽反應。很有可能所述T細胞識別上述抗體的V區，因為它們不與攜帶同樣恆定區但有不同特異性的其它抗體反應。在所述可變區內，最有可能被識別的區是CDR，因為它們是在不同抗體間差別最大的區。上文提到的在小鼠中引起SLE的九種致病性鼠mAb的VH序列CDR區在Waizman和Mozes，1993的

圖1中加框顯示，其中顯示所述九種mAb的可變重鏈(VH)完整核苷酸序列和推導的胺基酸序列。
本發明的申請人的國際PCT專利公開第WO 96/30057號描述基於從實驗性SLE小鼠分離的致病性mAb CDR區的肽，尤其是分別基於鼠mAb 5G12VH鏈CDR1、CDR2和CDR3區的肽Ia到IIIa，以及分別基於鼠mAb 2C4C2VH鏈CDR1和CDR3區的肽IVa到Va。這些肽具有實質上如下面SEQ ID NO1到SEQ ID NO5所指出的序列TGYYMQWVKQSPEKSLEWIG(Ia)[SEQ ID NO1]EINPSTGGTTYNQKFKAKAT(IIa)[SEQ ID NO2]YYCARFLWEPYAMDYWGQGS(IIIa)[SEQ ID NO3]
GYNMNWVKQSHGKSLEWIG(IVa)[SEQ ID NO4]YYCARSGRYGNYWGQTL(Va)[SEQ ID NO5]本發明的發明人已經證明當通過PBS給予這些肽，尤其是本文中分別名為mCDR1[SEQ ID NO1]和mCDR3[SEQ ID NO3]的肽Ia和IIIa時，這些肽能夠抑制T細胞受到合適mCDR肽或鼠來源或人類來源的全抗DNA 16/6Id mAb的激發(Waisman等，1997)。本發明的發明人進一步證明肽mCDRI和mCDR3治療或預防由人抗DNA16/6Id mAb引起的SLE或者在易患SLE的小鼠(NZB x NZW)F1或MRL/lpr/lpr中自發發展出的已經建立的SLE(established SLE)(Eilat等，2000和2001)。
發明簡述現在根據本發明，已經發現基於人單克隆抗DNA 16/6Id抗體CDR的肽能夠免疫調節SLE相關反應。因此，測試基於人16/6Id CDR1和CDR3的肽，顯示所述肽抑制用鼠肽mCDR1(SEQ ID NO1)和mCDR3(SEQ ID NO3)或用全人抗DNA 16/6Id mAb免疫的小鼠體內的淋巴結細胞增殖，抑制SLE患者外周血淋巴細胞(PBL)對人抗DNA16/6Id mAb的增殖性反應，並緩解患有自發性或實驗性SLE的小鼠的疾病表現。
這些發現完全出乎意料，因為不是所有致病性自身抗體的CDR都同樣被患者的T細胞識別。如以前在本發明人的實驗室內證明的(Dayah等，2000)，SLE患者T細胞對抗DNA自身抗體2C4C2的CDR的識別比對基於抗DNA抗體5G12的CDR的識別要差。此外，已經證明基於上文提到的WO 96/30057中鼠自身抗體CDR的肽的許多類似物在抑制效應上並不有效，因此無法預測或提示在基於本發明人單克隆抗DNA抗體CDR的肽序列上的修飾是有效的。此外，對於人類應用，應當認為應用基於人類抗體的肽優於應用基於非人類抗體的肽。
因此，本發明在一方面涉及選自以下的合成肽
(a)一種至少12個胺基酸殘基、至多30個胺基酸殘基的肽或者所述肽的鹽或化學衍生物，所述肽包含人單克隆抗DNA 16/6Id抗體重鏈或輕鏈的互補決定區(CDR)的序列或所述互補決定區內存在的序列(下文稱為「hCDR序列」)，或者包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述hCDR序列的一個或多個胺基酸殘基；(ii)所述hCDR序列缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述hCDR序列添加一個或多個胺基酸殘基；(b)雙合成肽，所述雙合成肽包含兩種不同的所述(a)肽，這兩種肽相互之間直接共價連接或通過短連接鏈共價連接；(c)包含多個所述(a)肽序列的肽聚合物；和(d)附著到大分子載體上的(a)肽或(c)肽聚合物。
人單克隆抗DNA 16/6Id抗體在本文稱為「人16/6Id mAb」，是能夠在小鼠中引起SLE樣疾病的致病性人單克隆抗DNA抗體。
根據本發明包含上文所定義的hCDR序列的肽在本文中稱為「hCDR肽」。
在一個優選實施方案中，所述hCDR肽包括人16/6Id mAb重鏈的CDR序列，更優選是CDR1或CDR3，例如，包括但不限於本文稱為hCDR1和hCDR3的肽，所述兩種肽分別基本如SEQ ID NO6和SEQ ID NO7陳述的序列，如下所示GYYWSWIRQPPGKGEEWIG [SEQ ID NO6]YYCARGLLRGGWNDVDYYGMDV [SEQ IDNO7]另一方面，本發明提供藥用組合物，所述藥用組合物包含至少一種本發明的合成肽或肽聚合物以及藥學上可接受的載體。所述藥用組合物尤其通過調節SLE患者體內SLE相關反應，即負調節MMP-3和/或MMP-9的水平和/或IL-2和/或IFN-γ活性，或正調節TGF-β活性水平，從而尤其用於治療SLE和緩解其疾病臨床表現。
又一方面，本發明涉及用於治療SLE的方法，所述方法包括給予SLE患者有效量本發明的肽或肽聚合物。本發明還涉及免疫調節SLE患者體內的SLE相關反應的方法，例如負調節SLE患者體內MMP-3和/或MMP-9的水平和/或IL-2和/或IFN-γ活性，或正調節TGF-β活性水平，所述方法包括給子SLE患者有效量本發明的肽或肽聚合物。
再一方面，本發明涉及評價藥物在治療SLE患者中的有效性的方法，所述方法包括在不同時間間隔測量從用所述藥物治療的所述患者獲取的血液樣品中的MMP-3和/或MMP-9水平，由此把MMP-3和/或MMP-9水平降低與藥物療效聯繫起來。
本發明又一方面涉及評價藥物療效的方法，該方法包括在不同時間間隔從用所述藥物治療的患者獲取的血液樣品中的IL-2和/或IFN-γ水平，由此把IL-2和/或IFN-γ水平降低與藥物有效性聯繫起來。
另一方面，本發明涉及評價藥物在治療SLE患者中的有效性的方法，所述方法包括在不同時間間隔測量從用所述藥物治療的所述患者獲取的血液樣品中的TGF-β水平，由此把TGF-β水平升高與藥物有效性聯繫起來。
可以根據上面任何一種方法評價有效性的藥物可以是，例如但不限於，根據本發明的肽或上文提到的WO 96/30057中所述的鼠肽。
附圖簡述圖1顯示300μg hCDR1處理抑制用人16/6Id mAb免疫的小鼠的淋巴結細胞對不同濃度16/6Id mAb(0.1-10μg/孔)的增殖反應。
圖2顯示50μg hCDR1處理抑制用人16/6Id mAb免疫的小鼠的淋巴結細胞對不同濃度16/6Id mAb(0.1-10μg/孔)的增殖反應。
圖3A-C顯示用人16/6Id mAb免疫並用hCDR1或不相關肽p259-271處理的BALB/c小鼠中的細胞因子模式。圖3A-IFN-γ模式；圖3B-TGF-β模式；圖3C-IL-10模式。
圖4顯示最佳化刺激SLE患者和健康對照的PBL所需的人抗DNA16/6Id mAb濃度。用不同濃度16/6Id mAb刺激PBL。產生最高刺激指標的濃度定義為最適於觸發增殖反應。
圖5顯示在缺乏或存在hCDR1或hCDR3的情況下，來自一名用促分裂原植物凝集素(PHA)刺激的SLE患者的PBL增殖。
圖6顯示在缺乏或存在人肽hCDR1或hCDR3、或鼠肽mCDR3的情況下，來自一名用人16/6Id mAb刺激的SLE患者的PBL增殖。
圖7顯示在缺乏或存在hCDR1或hCDR3或鼠反向肽revmCDR1和revmCDR3的情況下，來自一名用人16/6Id mAb刺激的SLE患者的PBL增殖。
圖8顯示在缺乏或存在hCDR1或hCDR3的情況下，抑制用人16/6Id mAb觸發的SLE患者的PBL的IL-2分泌。
圖9顯示在缺乏或存在hCDR1或hCDR3的情況下，正調節一名代表性的用人16/6Id mAb刺激的SLE患者的PBL的TGF-β分泌。
圖10顯示在未處理或用300μg hCDR1處理或用反向肽revhCDR1(用作對照)處理的(NZB x NZW)F1小鼠中的抗DNA自身抗體水平。
圖11A-11D是照片，顯示來自易患SLE的(NZB x NZW)F1小鼠的有代表性的腎切片，所述小鼠從5個半月齡開始接受PBS(11A，11B)或用100μg hCDR1(11C，11D)處理。所述切片是在9月齡處死的小鼠的切片。為檢測Ig沉積，用綴合FITC的山羊抗鼠IgG(γ鏈特異性)溫育所述切片(11A、11C x 100；11B、11D x 400)。
圖12A-12F是照片，顯示來自易患SLE的(NZB x NZW)F1小鼠的有代表性的腎切片，所述小鼠用PBS(12A，12B)或用300μg hCDR1(12C，12D)處理，或者用反向肽revhCDR1(12E，12F)處理。所述切片是在9月齡處死的小鼠的切片。為檢測免疫複合物Ig沉積，用綴合FITC的山羊抗鼠IgG(γ鏈特異性)溫育所述切片(12A、12C、12E x100；12B、12D、12F x 400)。
圖13A-13C顯示用ELISA測量得到的在易患SLE的(NZB xNZW)F1小鼠脾細胞的Con A刺激培養物上清中的細胞因子模式，所述小鼠未處理或用hCDR1處理或用反向肽revhCDR1處理。圖13A-IFN-γ模式；圖13B-IL-10模式；圖13C-TGF-β模式。
圖14A-14F是照片，顯示患有16/6Id誘導的實驗性SLE的BALB/c小鼠有代表性的腎切片，所述小鼠用PBS(14A，14B)處理或用200μghCDR1(14C，14D)處理，或者用反向肽revhCDR1(14E，14F)處理。所述切片是在9月齡處死的小鼠的切片。為檢測免疫複合物Ig沉積，用綴合FITC的山羊抗鼠IgG (γ鏈特異性)溫育所述切片(14A、14C、14E x 100；14B、14D、14F x 400)。
圖15A-15E顯示用ELISA測量得到的在16/6Id誘導的實驗性SLE的BALB/c小鼠的16/6Id刺激的淋巴結培養物的上清中的細胞因子模式，所述小鼠未處理或用hCDR1處理(200或300μg)或用反向肽revhCDR1處理。在16/6Id觸發的脾細胞的上清中測得圖15A-IFN-γ模式；圖15B-TNF-α模式；圖15C-IL-10模式；圖15D-TGF-β模式；圖15E-TGF-β模式。
圖16A-16F是照片，顯示易患SLE的(NZB x NZW)F1小鼠有代表性的腎切片，所述小鼠未處理(16A，16B)或者接受來自用300μghCDR1(16C，16D)或反向肽revhCDR1(16E，16F)處理的小鼠的脾細胞。為檢測免疫複合物Ig沉積，用綴合FITC的山羊抗鼠IgG(γ鏈特異性)溫育所述切片(16A、16C、16E x 400；16B、16D、16F x 100)。
圖17A-17B描述MMP-3、MMP-2和MMP-9在(NZB x NZW)F1小鼠血清內出現的動力學。在指定時間點從(NZB x NZW)F1小鼠(10隻小鼠/組)採血。使用蛋白質印跡，測試從每組小鼠匯集的血清(4μl)中的MMP-3表達水平(圖17A)，使用凝膠酶譜法測試MMP-9和MMP-2活性(圖17B)。結果代表4個相似的實驗。
圖18A-18B描述MMP-3、MMP-2和MMP-9在BALB/c小鼠的血清內出現的動力學。在指定時間點從未免疫的BALB/c小鼠(10隻小鼠/組)或者用PBS/CFA(10隻小鼠/組)或16/6Id(在CFA中；10隻小鼠/組)免疫的小鼠採血。使用蛋白質引跡，測試從每組小鼠匯集的血清(4μl)中的MMP-3表達水平(圖18A)，使用凝膠酶譜法測試MMP-9和MMP-2活性(圖18B)。結果代表3個相似的實驗。
圖19A-19C描述免疫後BALB/c小鼠的腎切片針對MMP-3和MMP-9進行的免疫染色。未免疫的BALB/c小鼠或用PBS/CFA或16/6Id(在CFA中)免疫的小鼠(3隻小鼠/組)在接受16/6Id的加強後，於5.5個月處死。取出腎，將它們的5μm恆冷箱切片針對MMP-3(19A)和MMP-9(19B)進行免疫染色。進行對照染色以確認阻斷的效率(19C)。(x200)。結果代表3個類似的實驗。
圖20A-20B描述在用mCDR1處理的(NZB x NZW)F1小鼠的血清中MMP-3和MMP-9的水平。在預防實驗中，從小鼠2月齡開始，在10周內為小鼠(10/組)每周皮下注射給予mCDR1。結果代表處理結束後4個月所採的血清。在治療實驗中，從5月齡開始為小鼠(10/組)皮下注射PBS或250μg/小鼠mCDR1。結果代表處理結束後3周所採的血清。使用蛋白質印跡分析(20A)測試每個實驗組匯集血清中的MMP-3水平，使用凝膠酶譜法(20B)測試MMP-9活性。UT-未處理。結果代表2個相似的實驗。
圖21A-21B描述用mCDR1處理的16/6Id免疫BALB/c小鼠中MMP-3和MMP-9的水平。在預防實驗中，用mCDR1(100μg/小鼠)靜脈內處理小鼠(8/組)。所顯示的結果是使用處理結束後4.5個月所採血清獲得的結果。在治療實驗中，用100μg/小鼠mCDR1皮下處理小鼠(8/組)。結果是使用處理結束時所採血清獲得的結果。通過蛋白質印跡分析(21A)測試從每個實驗組匯集的血清中的MMP-3，通過凝膠酶譜法測試MMP-9活性(21B)。UT-未處理。結果代表2個相似的實驗。
圖22A-22B描述16/6Id免疫的BALB/c小鼠的腎切片針對MMP-3和MMP-9進行的免疫染色，所述小鼠接受mCDR1以預防(22A)或治療(22B)實驗性SLE。引發疾病8個月後處死小鼠，取出它們的腎。製備恆冷箱切片(5μm)，針對MMP-3、MMP-9以及免疫複合物沉積的存在進行免疫染色(x 200)。(W/O)-控制染色達到阻斷的效率，不使用第一抗體。結果代表2個相似的實驗。
圖23A-23B描述在用hCDR1處理的(NZB x NZW)F1小鼠血清中的MMP-3和MMP-9水平。在治療實驗中，從小鼠7月齡開始的十周內，每周一次用PBS或100μg或30μg/小鼠hCDR1皮下注射處理小鼠(10/組)。結果代表使用治療中期採集血清獲得的結果。通過蛋白質印跡分析(23A)測試從每個實驗組匯集的血清中的MMP-3水平，通過凝膠酶譜法測試MMP-9活性(23B)。UT-未處理。結果代表2個相似的實驗。
圖24描述一塊有代表性的凝膠，該凝膠顯示在SLE患者和健康對照的血清中MMP-2和MMP-9活性。通過凝膠酶譜法分析40個SLE患者以及25個健康對照的血清(5μl)中的MMP-2或MMP-9活性。本圖顯示用這兩個組的血清樣品獲得的代表性結果。
圖25描述一張圖，該圖顯示對SLE患者(黑柱)和健康對照(白柱)的血清中MMP-2和MMP-9活性的定量分析。使用比活測定試劑盒測定三十六份SLE患者血清樣品以及15份健康對照血清樣品的MMP-2或MMP-9活性。結果表示為平均值±s.e.m.。*P＝0.0302。
圖26A-26B是顯示SLE患者體內MMP-9活性水平和疾病活動指數(SLEDAI)的圖。使用比活測定試劑盒測定來自8名男性(圖26A)和27名女性(圖26B)SLE患者總共三十五份SLE患者血清樣品的MMP-9活性。給出根據患者SLEDAI的MMP-9活性分布。虛線表示健康對照體內的MMP-9活性。
圖27A-27B是圖，顯示從兩個SLE患者在4-6年病程中所採血清中MMP-2(白環)和MMP-9(黑環)活性的模式。使用比活測定試劑盒測定血清的MMP-2或MMP-9活性。所述測定一式兩份進行。
發明詳述在一方面，本發明涉及合成肽，所述合成肽包含在致病性人單克隆抗DNA 16/6Id抗體(本文中稱為「人抗DNA 16/6Id mAb」或「人16/6Id mAb」)重鏈或輕鏈的CDR序列，或包含在所述CDR序列中存在的序列，其中所述抗體在小鼠中引起SLE樣疾病。
本發明中源於人16/6Id mAb CDR的合成肽在本文中稱為hCDR肽，所述肽最好基於在人16/6Id mAb重鏈CDR。
人16/6Id mAb的VH序列的CDR區在Waisman等，1995的圖4A中加框顯示。所述人16/6Id mAb的重鏈的CDR區具有實質上由SEQID NO8到SEQ ID NO10所描述的序列，如下所示CDR1FSGYYWS [SEQ ID NO8]CDR2EINHSGSTNYKTSLKS[SEQ ID NO9]CDR3GLLRGGWNDVDYYYGMDV [SEQ ID NO10]本發明的hCDR肽包含至少12個胺基酸殘基、至多30個胺基酸殘基，並且優選包含與選自SEQ ID NO8、9和10之一的序列相同的序列，或更優選在所述SEQ ID NO8、9或10中存在的序列，或包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代SEQ ID NO8、9和10序列中的一個或多個殘基；(ii)SEQ ID NO8、9和10序列缺失一個或多個胺基酸殘基；或(iii)在SEQ ID NO8、9和10序列中添加一個或多個胺基酸殘基。
本發明的hCDR肽除所述hCDR序列外，還包含其它胺基酸殘基，最好是在所述hCDR序列側翼的人16/6Id mAb序列的胺基酸殘基，或者如下獲得的序列的胺基酸殘基用不同胺基酸殘基取代所述hCDR側翼序列的一個或多個胺基酸殘基、缺失所述hCDR側翼序列的一個或多個胺基酸殘基或在所述hCDR側翼序列中添加一個或多個胺基酸殘基。
因此，在一個實施方案中，本發明提供合成肽，所述合成肽基於人16/6Id mAb重鏈的CDR1，所述CDR1區是實質上如SEQ ID NO8所描述的序列，所述肽選自以下(a)一種肽或該肽的鹽或化學衍生物，所述肽包含SEQ ID NO8的序列或包含SEQ ID NO8中存在的序列，或者所述肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO8的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO8缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO8中添加一個或多個胺基酸殘基。
(b)雙合成肽，所述雙合成肽包含兩種不同的所述(a)肽，這兩種肽相互之間直接共價連接或通過短連接鏈共價連接；(c)包含多個所述(a)肽序列的肽聚合物；和(d)附著到大分子載體上的(a)肽或(c)肽聚合物。
在本發明的一個優選實施方案中，基於人16/6Id mAb的重鏈的CDR1的肽是具有實質上如SEQ ID NO11所描述的序列的肽X1YYWSWIX2QX3PX4X5GX6EWIG[SEQ ID NO11]其中X1是G或TG；X2是R或K；X3是P或S；X4是G或E；X5是K或D；X6是E、L或S。
在更優選的實施方案中，SEQ ID NO11的肽是具有實質上如SEQID NO6所述的序列的在本文中名為「hCDR1肽」或簡稱為「hCDR1」的19體肽，SEQ ID NO6如下所述GYYWSWIRQPPGKGEEWIG[SEQ ID NO6]在hCDR1中，在SEQ ID NO8內的序列GYYWS之後是人16/6IdmAb重鏈的CDR1天然序列，只是在所述肽hCDR1位置15上穀氨酸殘基(E)(粗體)取代mAb的天然亮氨酸(L)殘基。
在另一實施方案中，SEQ ID NO11的肽是通過在hCDR1肽序列中取代和/或添加胺基酸殘基而獲得的hCDR1肽的類似物，其例子是具有實質上如SEQ ID NO12到SEQ ID NO18序列的肽(其中取代或添加的胺基酸用粗體表示)
GYYWSWIRQPPGKGLEWIG[SEQ ID NO12]GYYWSWIRQPPGKGSEWIG[SEQ ID NO13]GYYWSWIRQPPGDGEEWIG[SEQ ID NO14]GYYWSWIKQPPGKGEEWIG[SEQ ID NO15]GYYWSWIRQSPGKGEEWIG[SEQ ID NO16]GYYWSWIRQPPEKGEEWIG[SEQ ID NO17]TGYYWSWIRQPPGKGEEWIG[SEQ ID NO18]在又一實施方案中，本發明提供合成肽，所述合成肽基於人16/6IdmAb重鏈的CDR3，所述CDR3區是實質上如SEQ ID NO10所描述的序列，所述肽選自以下(a)一種肽或該肽的鹽或化學衍生物，所述肽包含SEQ ID NO10的序列或包含SEQ ID NO10中存在的序列，或者所述肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO10的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO10缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO10中添加一個或多個胺基酸殘基；(b)雙合成肽，所述雙合成肽包含兩種不同的所述(a)肽，這兩種肽相互之間直接或通過短連接鏈共價連接；(c)包含多個所述(a)肽序列的肽聚合物；和(d)附著到大分子載體上的(a)肽或(c)肽聚合物。
在本發明的一個優選實施方案中，基於人16/6Id mAb重鏈CDR3的肽是具有實質上如SEQ ID NO19所描述的序列的肽YYCARX1LLX2X3X4X5X6DVDYX7GX8DV[SEQ ID NO19]其中X1是G或F；X2是R或A；X3是G或A；X4是G或A；X5是W或A；X6是N或A；X7是Y或W；X8是M或Q。
在更優選的實施方案中，SEQ ID NO19的肽是SEQ ID NO7的在本文中名為「hCDR3肽」或簡稱為「hCDR3」的肽，SEQ ID NO7如下所述YYCARGLLRGGWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO7]
在hCDR3中，人16/6Id mAb重鏈CDR3區的序列GLLRGGWNDVDYYYGMDV[SEQ ID NO10]的改變是缺失其中一個酪氨酸(Y)殘基，在該序列之前是所述mAb的天然序列。
在另一實施方案中，SEQ ID NO19的肽是通過在hCDR3肽序列中取代和/或添加胺基酸殘基而獲得的hCDR3肽的類似物，其例子是具有SEQ ID NO20到SEQ ID NO27序列的肽(其中取代或添加的胺基酸用粗體表示)YYCARGLLRGGWADVDYYGMDV[SEQ ID NO20]YYCARGLLRGGANDVDYYGMDV[SEQ ID NO21]YYCARGLLRGAWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO22]YYCARGLLRAGWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO23]YYCARGLLAGGWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO24]YYCARFLLRGGWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO25]YYCARGLLRGGWNDVDYYGQDV[SEQ ID NO26]YYCARGLLRGGWNDVDYWGMDV[SEQ ID NO27]在再一實施方案中，本發明提供合成肽，所述合成肽基於人16/6IdmAb重鏈的CDR2，所述CDR2區是實質上如SEQ ID NO9所描述的序列，所述肽選自以下(a)一種肽或該肽的鹽或化學衍生物，所述肽包含SEQ ID NO9的序列或包含SEQ ID NO9中存在的序列，或者所述肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO9的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO9缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO9中添加一個或多個胺基酸殘基；(b)雙合成肽，所述雙合成肽包含兩種不同的所述(a)肽，這兩種肽相互之間直接或通過短連接鏈共價連接；(c)包含多個所述(a)肽序列的肽聚合物；和(d)附著到大分子載體上的(a)肽或(c)肽聚合物。
本發明的合成肽具有12-30個胺基酸殘基、優選17-23個胺基酸殘基、最優選19-22個胺基酸殘基，可以通過化學合成或通過重組技術用本領域內眾所周知的方法生產。
當製備通過取代胺基酸殘基而獲得的如上所述類似物時，重要的是所述取代不明顯累積性改變未取代母肽的體積、疏水-親水模式和對應部分的電荷。因此，可以用親水性殘基取代疏水性殘基，或者相反，只要總效應不在實質上改變對應未取代母肽的體積、疏水-親水模式和電荷。
本發明還包括本發明肽的化學衍生物。所述「化學衍生物」包含並不通常是所述肽的一部分的其它化學部分，只要所述衍生物保留所述肽的至少部分功能以允許它可用於預防或抑制T細胞增殖性反應和自身免疫病，所述衍生物包括在本發明範圍內。例如，化學衍生物可能源於能夠與所述肽的選定測鏈或末端殘基反應的有機衍生劑的反應，並最好保留所述肽的至少部分功能，以特異性抑制對SLE引起的自身抗體有高反應性的小鼠T淋巴細胞的增殖反應和細胞因子分泌。在這些化學衍生物中，醯胺尤其受到關注，包括在C末端羧基的醯胺和在天冬氨酸殘基或穀氨酸殘基的游離羧基基團的醯胺。許多這樣的化學衍生物和製造它們的方法是本領域內眾所周知的。
本發明的範圍內還包括本發明所述肽的鹽和類似物。本文所用術語「鹽」指羧基基團的鹽以及所述肽分子的氨基基團的酸加成鹽。羧基基團的鹽可以通過本領域內已知的方法形成，包括無機酸鹽和有機鹼鹽，無機酸鹽例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽等等，有機鹼鹽例如與胺形成的鹽，所述胺例如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等等。酸加成鹽包括，例如，與無機酸如鹽酸或硫酸形成的鹽，以及與有機酸如乙酸或草酸形成的鹽。所述化學衍生物和鹽最好用於修飾所述肽的藥學特性，包括穩定性、溶解度等等。
可以如下選擇依照本發明的hCDR肽使用對誘導SLE的自身抗體有高反應性的小鼠，測試所述hCDR肽抑制所述小鼠T淋巴細胞增殖反應的潛力。一旦產生依照本發明的肽，本領域內一般技術人員不必進行過度實驗而使用如本文所述那些測試就可以容易地確定所述肽抑制小鼠(所述小鼠對誘導SLE的自身抗體有高反應性)T淋巴細胞增殖反應的能力。一個可以容易進行的測試是用於測試所述肽抑制某些特異性針對誘導SLE的自身抗體的T細胞系和集落體外增殖反應的能力。所述T細胞系和集落可以是，例如，採用以前描述的方法(Axelrod，O.和Mozes，E.Immunobiology，172，99(1986))從小鼠免疫淋巴結細胞建立的特異性針對16/6Id mAb的T細胞系和克隆(Fricke等，1991)。細胞每兩周就暴露於在富集培養基中輻射過的同系脾細胞上呈遞的刺激抗體。通過標準限制稀釋技術克隆所述T細胞。使用例如在WO 96/30057中材料與方法部分(g)描述的方法測試這些T細胞系和集落的增殖反應。
為選擇具有所需活性的類似物而可以進行的另一種測試是測試所述合成肽在母肽存在下抑制所述T細胞系和克隆幫助肽特異性B細胞的能力。也可以測試所述合成肽在生物素化後直接結合相關株抗原呈遞細胞上II類MHC產物的能力。為此目的，在水溶液中過量生物素-N-羥基琥珀醯亞胺存在下，0℃下N末端生物素化所述相關肽(Mozes等，1989)。小鼠脾粘附細胞或PBL-粘附細胞(1×106/樣品)在含0.1％牛血清白蛋白的PBS中(PBS/BSA)37℃下與生物素化肽溫育20小時，然後與藻紅蛋白-鏈黴抗生物素在4℃下溫育30分鐘。每次溫育後，細胞都用上述溶液洗滌兩次。此後，使用FACScan通過流式細胞術分析細胞。在每次分析中，最少檢查5000個細胞(關於上述方法參見例如Mozes等，1989)。
可以進行的另一個測試是測試所述肽抑制細胞因子分泌的能力，所述細胞因子分泌是指來自對誘導SLE的自身抗體有高反應性的小鼠的T細胞系或T淋巴細胞或淋巴結細胞的細胞因子分泌。如下檢測細胞因子通過ELISA評價IL-1活性，所述ELISA使用一對捕獲和檢測抗體(如下文針對IL-4、IL-6、IL-10所述)。使用依賴於IL-2的CTLL直接檢測IL-2，或通過ELISA檢測IL-2。通過ELISA測定上清液中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平，所述ELISA根據廠家指導使用針對各種細胞因子的抗體(Pharmingen，San Diego，Ca.，USA)。此外，可以通過如本文在下面實施例所述的ELISA評價所述肽提高免疫抑制性細胞因子TGF-β分泌水平的能力。
在這些體外測試的一種或多種中顯示陽性的肽預期將有體內活性。然而，不需要過度實驗，也可以進行體內測試。因此，例如，可以在第-3天或第0天為成年小鼠注射候選肽。然後用引起疾病的自身抗體或所述肽免疫小鼠。十天以後，測試所述小鼠淋巴結細胞應答所述免疫原而增殖的能力，以發現所述候選肽的抑制能力。
另一個這樣的體內動物試驗包括直接測量針對小鼠模型體內上文所述SLE產生的治療作用。可以注射所述肽入小鼠體內，其中通過不同途徑、以不同劑量並採用不同時間表，誘導實驗性SLE。此外，可以定期測試接受處理的小鼠，以測定所述肽對於所述小鼠體內由誘導SLE的自身抗體引發的自身抗體反應和疾病表現的效應。
另一種體內方法包括評價候選肽治療自發產生SLE的小鼠(如(NZB x NZW)F1小鼠)的能力，如本文實施例所述。
因此，可以看到，除已經在本文實施例中證明可操作的優選實施方案外，本領域內的一般技術人員將能夠根據本文陳述的方針確定也可操作的其它類似物，而不需要進行過度實驗。
在另一優選實施方案中，本發明提供多表位單肽，如二肽。在一個實施方案中，所述二肽包括基於同一CDR的兩種不同的肽，例如包括人16/6Id mAb重鏈CDR1序列(SEQ ID NO8)或CDR3序列(SEQ ID NO10)的兩種不同的肽。
在又一更優選的實施方案中，所述二肽包括兩種基於不同CDR的不同的肽，例如一種肽包括人16/6Id mAb重鏈CDR1的序列(SEQ IDNO8)，另一種肽包括人16/6Id mAb重鏈CDR3的序列(SEQ IDNO10)。
依照本發明的二肽最好包括兩種不同的肽，一種是SEQ ID NO11的肽，另一種是SEQ ID NO19的肽，更優選一種肽選自SEQ ID NO6和SEQ ID NO12-18，另一種肽選自SEQ ID NO7和NO20-27，最優選一種肽是SEQ ID NO6的肽，另一種是SEQ ID NO7的肽，所述兩種不同的肽相互之間或者直接共價連接，或者通過短連接鏈如一段丙氨酸共價連接，或通過推定的組織蛋白酶蛋白水解位點連接。關於這種位點，見例如美國專利5,126,249和歐洲專利495049。
在再一優選實施方案中，本發明提供多表位單肽，所述多表位單肽以肽聚合物的形式包括本發明的多個同種或不同的肽，通過用合適的聚合劑如0.1％戊二醛使所述肽聚合，得到所述肽聚合物(Audibert等，1981，Nature 289593)。所述聚合物最好包含5到20個肽殘基，優選包含SEQ ID NO6、7和11-27的肽。也可以通過使所述肽交聯或將多個肽附著到大分子載體上，形成所述肽聚合物。合適的大分子載體是，例如，蛋白質如破傷風類毒素，以及胺基酸的線性或分支共聚物，例如L-丙氨酸、L-穀氨酸和L-賴氨酸的線性共聚物和L-酪氨酸、L-穀氨酸、L-丙氨酸和L-賴氨酸(T，G)-A-L-的分支共聚物或者多鏈聚-DL-丙氨酸(M.Sela等，1955，J.Am.Chem.Soc.776175)。如下獲得所述綴合物例如，首先將所述肽與水溶性碳二亞胺(如1-乙基-3-(3′-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)偶聯，然後與所述大分子載體偶聯，如Muller，G.M.等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79569所述。進行胺基酸分析，與單獨所述載體的組成相比較，確定每種綴合物內偶聯的肽的含量。
根據本發明的又一實施方案，可以將一種或多種活性肽附著到合適的大分子載體上，或者在戊二醛存在下聚合。
將所述肽、它們的聚合物或它們與合適大分子載體的綴合物以保證它們的生物利用率、使它們適用於治療的形式給予患者。假如發現本發明一種以上的肽有顯著的抑制活性，就將這些肽以包含它們的混合物的製劑給予患者。
因此，本發明還涉及藥用組合物，所述藥用組合物包括至少一種依照本發明的合成肽或肽聚合物，可選還有藥學上可接受的載體。
在一個優選實施方案中，所述藥用組合物包括至少一種本發明的合成肽，更優選是選自以下的肽肽hCDRl[SEQ ID NO6]和hCDR3[SEQ ID NO7]以及通過在hCDR1和hCDR3序列中取代和/或添加胺基酸殘基而獲得的肽，尤其是選自以下的肽SEQ ID NO12到SEQ IDNO18以及SEQ ID NO20到SEQ ID NO27的肽。
本發明包括任何合適的給藥途徑，包括口服途徑、靜脈內途徑、皮下途徑、關節內途徑、肌內途徑、吸入途徑、鼻內途徑、鞘內途徑、腹膜內途徑、皮內途徑、經皮途徑或其它已知途徑，包括腸途徑。在優選實施方案中，通過口服途徑、鼻內途徑或皮下途徑給予本發明的肽。
本發明組合物的給藥劑量範圍應當足以產生所需效應，例如，根據體外T細胞增殖測量，在實質上預防或抑制針對誘導SLE的自身抗體的免疫反應，並進而顯著治療所述疾病。所述劑量應當不足以引起副作用，例如不希望有的交叉反應、全身化免疫抑制、過敏反應等等。
本發明的肽用於治療SLE的有效劑量在約1μg到1mg並高達100mg/kg體重的範圍內。
本發明的合成人類肽目標在於抑制或阻抑SLE患者的特異性抗原反應，而不影響所有其它免疫反應。該方法非常重要，因為大多數確診患者是年輕婦女，需要治療許多年，而目前接受的SLE治療涉及給予免疫抑制劑，如皮質甾類和/或細胞毒性藥物，而這些免疫抑制劑缺乏特異性，並且有多種副作用。
本發明還涉及治療系統性紅斑狼瘡(SLE)的方法，包括給予SLE患者有效量本發明的肽或肽聚合物。在一個優選實施方案中，所述方法包括給予SEQ ID NO6的肽。在另一個優選實施方案中，所述方法包括給予SEQ ID NO7的肽。
本發明還涉及免疫調節SLE患者體內SLE相關反應的方法，所述方法包括給予所述SLE患者有效量本發明的肽或肽聚合物。在一個實施方案中，所述方法包括負調節SLE患者體內基質金屬蛋白酶(MMP)-3和/或MM-9活性的水平。在另一實施方案中，所述方法包括免疫調節SLE患者體內細胞因子活性的水平，尤其是負調節SLE患者體內IL-2和/或IFN-γ活性的水平和/或正調節TGF-β活性的水平。在一個優選實施方案中，所述方法包括給予SEQ ID NO6的肽。在另一個優選實施方案中，所述方法包括給予SEQ ID NO7的肽。
本發明還提供評價藥物對於治療SLE患者的有效性的方法，所述方法包括在不同時間間隔測量從用所述藥物治療的所述患者獲得的血液樣品中MMP-3、MMP-9、IL-2、IFN-γ和/或TGF-β的水平，因為MMP-3、MMP-9、IL-2和/或IFN-γ的水平降低或TGF-β的水平升高與所述藥物的有效性相關。
本發明還涉及應用本發明的肽或肽聚合物製備藥用組合物，尤其用於治療SLE，更具體地說用於免疫調節SLE患者體內的SLE相關反應，例如負調節SLE患者體內的MMP-3和/或MMP-9和/或IL-2和/或IFN-γ水平，或正調節TGF-β的水平。
本發明將在下面非限制性的實施例和附圖中更詳細地說明。
實施例材料和方法小鼠。雌性(NZB x NZW)F1小鼠得自Jackson Laboratory(BarHarbor，ME)。6-8周齡BALB/c純系雌性小鼠得自Experimental AnimalUnit，The Weizmann Institute of Science，Rehovot，Israel。
抗DNA單克隆抗體。以前已經特徵鑑定攜帶16/6Id(IgGl/k)的人抗DNA mAb(Shoenfeld等，1982；Waisman等，1995)。所述mAb由在培養物中培養的雜交瘤細胞分泌，並使用蛋白G-Sepharose柱(Pharmacia，Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)純化。
合成肽。如以前所述(WO 96/30057)，或使用自動化合成儀(Applied Biosystems 430A型，Germany)採取該公司用於t-butyloxycarbonyl(t-Boc)技術的方法，製備合成鼠肽mCDR1(SEQ IDNO1)和mCDR3(SEQ ID NO3)以及按mCDR1和mCDR3的反向順序以及按人類肽hCDR1的反向順序合成的反向肽，所述反向肽在本文中分別定義為revmCDR1[SEQ ID NO28]、revmCDR3[SEQ IDNO29]和revhCDR1[SEQ ID NO30]，用作對照。
所述反向肽具有如下序列GIWELSKEPSQKVWQMYYGTrevmCDR1[SEQ ID NO28]SGQGWYDMAYPEWLFRACYYrevmCDR3[SEQ ID NO29]GIWEEGKGPPQRIWSWYYG revhCDR1[SEQ ID NO30]誘導和治療實驗性SLE。為誘導實驗性SLE，用1-2μg人mAb16/6Id免疫BALB/c小鼠，並在3周後加強。為預防實驗性SLE，在免疫的同時靜脈內(i.v.)或皮下給予小鼠hCDR1或hCDR3(mCDR1或revmCDR1在實施例12中用作對照)，此後5周每周對所述小鼠進行注射。在用16/6Id引起疾病三個半月後已經觀察到臨床表現時，開始對已經建立的疾病進行治療。在實施例12中，每周以100μg/小鼠的劑量注射小鼠(靜脈內或皮下)共10周。
用hCDR1或mCDR1肽預防和治療(NZB x NZW)F1小鼠體內的SLE樣疾病。為預防SLE，在觀察到2月齡的小鼠出現疾病表現之前，每周為小鼠皮下注射hCDR1(或實施例12中的mCDR1，250μg/小鼠)共10周。為治療已經建立的疾病，每周為5-7月齡的小鼠注射hCDR1(在實施例12中，皮下注射mCDR1，250μg/小鼠)共10周。
増殖性反應。通過Ficoll-Hypaque(Pharmacia)密度梯度離心從肝素化的靜脈血分離PBL。所有測定都在平底微量滴定板(Falcon，BectonDickinson，Oxmard，CA，USA)上一式三份進行，其中如所述(Dayan等，2000)在富集的RPMI-1640中培養2×105PBL。使所述PBL暴露於不同濃度(0.1-40μg/孔)的人抗DNA 16/6Id mAb，同時添加或不添加濃度至少超過16/6Id濃度十倍的各種基於CDR的肽。在每個實驗中使用植物凝集素(PHA；2μg/孔)作為培養條件的對照。所述培養物在37℃下7.5％CO2中溫育6天。在收穫細胞十八小時前，在所有培養物中加入[3H]-胸苷(5Ci/mmol的0.5μCi)(Nuclear Research Center，Negev，Israel)。結果表示為三份平行培養物平均胸苷摻入的每分鐘計數(CPM)±SD，或表示為刺激指數(S.I.；人16/6Id最佳濃度下的平均CPM與僅存在培養基時平均CPM的比值)。S.I.≥2被認為是陽性反應(Dayan等，2000)。高於50％的抑制(存在16/6Id和各種基於CDR的肽的情況下平均CPM與存在16/6Id而不存在基於CDR的肽的情況下的平均CPM的比值)被認為是陽性。
誘導細胞因子生產。小鼠用人16/6Id mAb免疫，並用或不用基於CDR的肽處理，在用所述肽處理的不同時期或處理後處死小鼠。收穫脾細胞和淋巴結細胞(LNC)，在16/6Id存在下溫育(5×106/ml)。在48小時和72小時後收集上清液。
評價上清液中的細胞因子。開始培養後48小時，收集上清液，保存於-70℃。通過ELISA測量IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α，所述ELISA根據廠家指導使用相關標準以及捕獲和檢測Ab(Pharmingen)。通過ELISA測定TGF-β。簡要地說，用重組人TGF-β1sRII/Fc嵌合物(R D Systems Inc.，Minneapolis，MN，USA)包被板，使用的第二Ab是生物素化抗人TGF-β1抗體(R D Systems Inc.)。所使用的底物溶液是TMB顏色試劑(Helix Diagnostics，WestSacramento，CA)，使用570-nm和630-nm濾片評價酶活性。
檢測SLE相關的臨床和病理學表現。使用Combistix試劑盒(AmesDivision，Bayer Diagnostics，Newbury，U.K.)半定量測量蛋白尿。在含1％乙酸(體積比)的蒸餾水中10倍稀釋肝素化血液，然後計數白細胞(WBC，就白細胞減少而言)。為進行免疫組織學分析，固定冰凍的腎切片(6μm)，用FITC綴合的山羊抗鼠IgG抗體(γ-鏈特異性；Sigma)。
ELISA。為測量抗DNA抗體，用甲基化BSA或聚L-賴氨酸(Sigma)包被96孔Maxisorb微量滴定板(Nunc)。洗板，然後用10μg/ml變性的小牛胸腺DNA(Sigma)或λ-噬菌體雙鏈DNA(Boehringer Mannheim，5μg/ml)包被板。在用不同稀釋度的血清溫育後，在板內加入綴合辣根過氧化物酶(Jackson ImmunoResearch)的山羊抗小鼠IgG(γ鏈特異性)，然後加入底物2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸)(Sigma)。使用ELISA讀板儀讀取結果。
測量MMP-2和MMP-9的活性。通過凝膠酶譜法測試MMP活性。通過1mg/ml明膠聚合的8％SDS-PAGE分離從不同實驗組個體小鼠匯集的血清。電泳後，凝膠在2.5％Triton X-100中洗滌30分鐘一次，除去SDS，然後在含50mM Tris-HCl，200mM NaCl，10mMCaCl2和0.02％(重量/體積)Brij 35的反應緩衝液(pH 7.5)中洗滌30分鐘一次。更換新鮮的反應緩衝液，將所述凝膠在37℃溫育24小時。通過用0.5％考馬斯亮藍染色凝膠，顯示明膠水解活性。
血清中MMP-3的蛋白質印跡。在12％SDS/PAGE上加載5μl每種血清的樣品，在還原條件下分離，然後轉移到硝酸纖維素上。用抗MMP-3抗體(Oncogene Research Products，MA，USA)探測印跡(0.5μg/ml，1小時，室溫)，並使用化學發光顯影。
針對MMP-3或MMP-9進行腎切片免疫染色。為針對MMP-3或MMP-9進行免疫染色，用冷丙酮固定(室溫下5分鐘)腎切片(5μm)，在PBS中洗滌兩次，在0.05％Triton X-100(在PBS中稀釋)中滲透(室溫下1分鐘)，然後在PBS中洗滌兩次。為獲得FITC標記的山羊抗小鼠的特異性抗MMP染色和避免對免疫複合物沉積的染色，用未標記的山羊抗小鼠IgG+IgM(在1％BSA/PBS中以1∶1稀釋；(Jackson ImmunoResearch Laboratories))封閉(室溫下1小時)，然後用含0.05％Tween的PBS洗滌3次。加入用1％BSA/PBS稀釋的單克隆抗MMP-9抗體(1∶100；Chemicon Intemational，Inc.)或抗MMP-3抗體(1∶50；Oncogene Research Products)，在室溫下溫育30分鐘。對於所有的免疫染色程序，都使用在1％BSA/PBS中稀釋的FITC標記的山羊抗小鼠IgG+IgM(Jackson ImmunoResearch Laboratories)(室溫下30分鐘)。
統計分析。結果表示為平均值±SD。使用卡方檢驗、Wilcoxon檢驗、Mann-Whitney檢驗和t-檢驗進行統計分析。P≤0.05被認為具有顯著性。
實施例1合成人肽hCDR1和hCDR3如所述，使用本領域內眾所周知的方法製備人hCDR1(SEQ IDNO1)和hCDR3(SEQ ID NO3)肽，例如使用自動化合成儀應用化學固相合成或液相合成，採用廠家用於叔丁氧基羰基(t-Boc)、芴甲氧羰基(Fmoc)或其它α-氨基保護基團程序的方法(見，例如，PeptidesSynthesis，Structure and Applications，B.Gutte編輯，Academic Press，1995；Peptide Synthesis Protocols，M.Pennington和B.Dunn編輯，Humana Press，1994；Schnolzer M.等，Boc-化學固相肽合成中的原位中和，困難序列的快速、高產量組裝。Int.J.Pept.Protein Res.40180-193，1992)。
實施例2用mCDR1和mCDR3免疫並用hCDR1和hCDR3處理的小鼠體內淋巴結細胞(LNC)增殖的抑制為確定人類肽hCDR1和hCDR3的抑制效應，我們首先測試它們在體內抑制用鼠肽mCDR1和mCDR3引發小鼠的能力。
為此，分別用mCDR1和mCDR3免疫BALB/c小鼠和SJL小鼠。將溶於CFA的免疫用鼠肽注射(10μg/小鼠)入hind footpad的真皮內。在免疫的同時，為BALB/c小鼠的組皮下(s.c.)注射溶於PBS中的200μg hCDR1，相似地為SJL小鼠的組注射hCDR3。免疫後十天，處死小鼠，收穫淋巴結，測試所述細胞在用免疫肽觸發後增殖的能力。簡要地說，在含有不同濃度(1-20μg/孔)鼠免疫肽並補充1％正常小鼠血清的富集RPMI-1640培養基中培養免疫後小鼠的LNC(0.5×106/孔，一式三份)。溫育四天後，添加3H-胸苷，繼續培養16小時。然後收穫細胞，用β-計數器計數放射性。
表1A和1B中的結果表示分別用mCDR1和mCDR3免疫並用hCDR1和hCDR3處理的小鼠的LNC增殖的最大抑制％。所述抑制根據未用抑制肽hCDR1和hCDR3處理的小鼠LNC的增殖進行計算。可以看到hCDR1和hCDR3能夠抑制對免疫用小鼠CDR肽的增殖反應。
表1AhCDR1抑制從BALB/c獲得的LNC應答mCDR1的增殖
表1BhCDR3抑制從SJL獲得的LNC應答mCDR3的增殖
實施例3用人抗DNA 16/6Id mAb免疫並用hCDR1和hCDR3處理的小鼠體內LNC增殖的抑制因為我們的目標是測試基於人16/6Id自身抗體的CDR的肽的抑制能力，所以重要的是了解肽hCDR1和hCDR3是否能夠抑制人16/6IdmAb完整分子的引發作用。為此，用溶於CFA的人16/6Id mAb(2μg/小鼠)在hind footpad真皮下引發BALB/c和SJL小鼠。在引發的同時，為BALB/c小鼠的組皮下給予溶於PBS中的200μg/小鼠hCDR1，為SJL小鼠皮下給予溶於PBS中的200μg/小鼠hCDR3。免疫後十天，處死小鼠，體外測試它們的LNC應答不同濃度(0.1-10μg/孔)人抗DNA16/6Id mAb而增殖的能力。
這些實驗有代表性的結果顯示於表2A和表2B。結果表示為與用16/6Id mAb免疫但未用肽hCDR1和hCDR3處理的小鼠相比，來自用所述肽免疫和處理的小鼠的淋巴結細胞應答免疫用人16/6IdmAb而增殖的最大抑制％。如結果所示，肽hCDR1和hCDR3都能夠有效抑制應答人16/6Id mAb的引發。
表2AhCDR1抑制來自BALB/c的LNC應答人16/6Id mAb的增殖
表2BhCDR3抑制來自SJL的LNC應答人16/6Id mAb的增殖
進一步的實驗證明在用人16/6Id mAb免疫的同時，經鼻給予低至10甚至2μg/小鼠肽hCDR1或hCDR3抑制淋巴結細胞應答所述免疫用抗體的增殖反應達到100％。
在另一個實驗中，用溶於CFA的1μg人16/6Id在hind footpad真皮下免疫BALB/c小鼠，然後或者皮下注射溶於PBS中的300μg/小鼠hCDR1，或者不進行進一步的處理。十天後，處死小鼠，測試它們的LNC在體外應答人16/6Id而增殖的能力。因此，在不同濃度(0.1-10μg/孔)人抗DNA 16/6Id mAb存在下溫育膕LNC(0.5×106)。在4天溫育期的結尾，在所述培養物中加入3H-胸苷，培養最後18小時。收穫細胞，計數放射性。
圖1顯示所述實驗的結果，證明hCDR1有效抑制受到處理的小鼠的淋巴結細胞的增殖反應。在不同濃度16/6Id mAb下增殖抑制％如下0.1μg/孔-47％；1μg/孔-66％；5μg/孔-76％；和10μg/孔-62％。
用溶於PBS中的50μg hCDR1/小鼠重複上面的同樣實驗。圖2顯示hCDR1非常有效地抑制用完整抗DNA 16/6Id大分子在小鼠體內進行的引發，甚至皮下注射少至50μg的hCDR1也顯著抑制淋巴結細胞應答16/6Id自身抗體而增殖的能力。在不同16/6Id mAb濃度下增殖的抑制％如下0.1μg/孔-98％；1μg/孔-76％；5μg/孔-73％；和10μg/孔-64％。
實施例4肽hCDR1免疫調節細胞因子產生用人16/6Id mAb刺激來自用50μg實施例3的hCDR1處理的BALB/C小鼠的淋巴結細胞，以產生細胞因子，並通過ELISA測試細胞因子(IFN-γ、TGF-β和IL-10)的分泌。
圖3顯示有代表性的實驗的結果。可以看到hCDR1負調節INF-γ的生產(圖3A)，正調節TGF-β(圖3B)和IL-10(圖3C)的分泌。應當注意到用作對照的肽(p259-271，一種致肌無力的肽)並不顯著影響INF-γ和IL-10的生產，並且對於正調節TGF-β並不那麼有效。
實施例5肽hCDR1和hCDR3抑制SLE患者的PBI應答人16/6Id mAb的增殖反應六十二名SLE患者參加我們的研究，包括9名男性(14.5％)和53名女性(85.5％)。診斷時的平均年齡是32.95±12.92歲(範圍12-61歲)，平均隨訪期是10.98±10.76年(範圍1-32年)。所有患者滿足至少四項美國風溼病學學院(American College of Rheumatology，ACR)修訂的SLE診斷標準(Tan等，1982)。從三個以色列醫療中心(Kaplan，Rehovot；Ichilov，Tel Aviv；Asaf-Harofeh，Rishon Lezion)招募患者。根據SLEDAI狼瘡活動性指數(Bombardier等，1992)確定疾病活動性。在研究SLE患者的同時，研究由36名性別和年齡相似的健康對照志願者組成的對照組。該研究得到醫療中心倫理委員會的批准。
我們感興趣的是研究基於人16/6Id mAb CDR1和CDR3的肽hCDR1和hCDR3是否能夠抑制SLE患者PBL針對人16/6Id mAb的特異性增殖反應。為此，我們首先必須鑑定其體內PBL能夠受到人16/6Id mAb的刺激而增殖的患者(應答者)。
因此，在人16/6Id存在下，順序培養62名SLE患者的PBL，並確定它們的增殖反應以及分泌IL-2的能力。在總共62名接受測試的SLE患者中，有24名患者(39％)的PBL有增殖應答(SI≥2，範圍2-5.6)，在總共55名接受測試的SLE患者中，有23名患者(42％)的PBL有IL-2分泌應答(SI≥2，範圍2-60)。在SLE患者組中應答者的頻率低於在作為對照測試的健康供體組中觀察到的頻率。因此，在總共36名健康供體中，有21名健康供體(58％)的PBL對16/6Id有增殖應答。應答16/6Id的SLE患者以及健康對照的增殖程度(SI水平)是相似的。然而，如圖4所示，與SLE患者相比，在更高的濃度才觀察到對照供體的PBL對16/6Id的增加應答。
在應答16/6Id的SLE患者和患者無應答者組之間，沒有出現性別和年齡的差異。然而，其PBL應答16/6Id而增殖的患者患病時間較短(應答者的平均患病時間是9.78±8.36年，而無應答者的平均患病時間是11.73±12.06年；P≤0.036)。表3綜述SLE患者中16/6Id應答者組以及無應答者組的臨床特徵。如我們可以從該表中看到的，兩組在大多數SLE相關臨床表現上是相似的。兩組間SLE疾病活動性分數(SLEDAI)以及SLE診斷標準的數目也是相似的。儘管如此，與無應答者組相比，在患者的應答者組中觀察到更高頻率的神經受累(癲癇發作以及精神病)和血液學受累以及更低比率的腎損害。然而，可能由於相關亞組中的患者數目少，上述差異沒有達到統計學顯著性。此外，在研究時在那些用類固醇或細胞毒性劑治療的患者之間，檢測到相對更少的應答者患者。值得注意的是與無應答者組相比，顯著更多的從未接受類固醇的患者對16/6Id有應答(應答者組是54％，而無應答者組是21％；P＝0.023)。
值得注意的是基於CDR的肽抑制健康供體PBL對16/6Id的增殖應答的功效遠遠低於其對SLE患者PBL的功效(未顯示)。
表3.SLE患者的臨床和實驗室標準。
A診斷標準*
B疾病活動性
C當前治療+
*根據ACR修訂的標準定義臨床損害程度。分別根據Hep2細胞以及Crithidia luciliae測定抗核抗體(ANA)以及抗dsDNA抗體。根據下面測試中一個或多個的反應性定義抗磷脂抗體(APLA)VDRL假陽性、狼瘡抗凝血劑(LAC)或針對抗心磷脂抗體的ELISA。
+以200-400mg/天的劑量應用抗瘧劑羥氯喹；類固醇治療定義為以日劑量≥5mg使用潑尼松；使用的細胞毒性劑是環磷醯胺(0.75-1.0g/m2；每月)或硫唑嘌呤(100-150mg/天)。
++在應答組和無應答組SLE患者之間觀察到差異趨勢的參數。
為測試肽hCDR1和hCDR3抑制SLE患者PBL對人16/6Id mAb的應答的能力，用不同濃度(0.1-20μg/孔)人16/6Id mAb，在或不在肽hCDR1和hCDR3存在下(50或100μg/孔)，體外刺激SLE患者的PBL(2×105/孔)，一式三份。溫育6天後，在每孔中加入3H-胸苷(0.5μCi在5Ci/mmol)，繼續溫育18小時。然後收穫細胞，用β-計數器測量放射性。結果表示為三份平行培養物的平均每分鐘計數(cpm)。然後計算刺激指數(最佳濃度16/6Id下cpm與不存在16/6Id時平均cpm的比值)。刺激指數(SI)≥2被認為是陽性。
在總共62名患者中，發現24名患者(39％)的PBL應答16/6Id mAb而增殖。對19名應答者SLE患者的PBL測試肽hCDR1和hCDR3抑制針對16/6Id自身抗體全分子的增殖反應的能力。
表4顯示這些實驗的結果。抑制超過50％的增殖能力被認為是陽性。該表顯示每種肽最高的陽性抑制能力。可以看到，在測試的19名應答者中，人hCDR1和hCDR3分別抑制16/19(84.2％)以及15/19(78.9％)的PBL增殖。兩種肽一起抑制19名受測試的應答者中18名患者(95％)的PBL增殖。還可以從表中看到，兩種肽抑制的程度相似。因此，可以得出結論基於人16/6Id mAb CDR1和CDR3的肽是SLE患者的PBL應答人16/6Id mAb的增殖的有效抑制劑。
表4肽hCDR1和hCDR3抑制SLE患者的PBL增殖。
實施例6.
hCDR1和hCDR3抑制能力的特異性重要的是證明基於hCDR的肽的抑制效應特異性針對SLE相關反應。為此，在用促細胞分裂原植物凝集素(PHA，2μg/ml)刺激過的SLE患者PBL培養物中加入肽hCDR1或hCDR3。圖5顯示用一名SLE患者的PBL進行的所述實驗的結果。肽hCDR1和hCDR3不能抑制PBL針對促細胞分裂原PHA的增殖反應(以cpm表示)，並且在存在或不存在(黑色柱)hCDR1或hCDR3的情況下，所述增殖反應相似地高。
在另一實驗中，用人16/6Id mAb刺激SLE患者的PBL培養物，然後所述培養物與人類肽hCDR1或hCDR3溫育，使用鼠肽mCDR3作為對照。圖6顯示用一名SLE患者PBL進行的所述實驗的結果。如圖6所示，雖然基於人自身抗體的肽hCDR1和hCDR3都有效抑制PBL針對人16/6Id mAb的增殖反應，但基於鼠抗體CDR3的肽mCDR3不抑制所述增殖。
在這些實驗中使用另外對照肽，即按鼠mCDR1和mCDR3肽的反向順序合成的肽(revmCDR1和revmCDR3)，結果顯示於圖7。可以看到，這兩種反向肽不能顯著抑制SLE患者PBL針對人16/6Id mAb的增殖反應，而肽hCDR1和hCDR3確實有效抑制所述增殖，這證明基於人hCDR的肽對增殖的抑制對於所述肽是特異性的，並且特異性針對SLE相關的T細胞反應。
實施例7.
在肽hCDR1和hCDR3存在下，SLE患者PBL的IL-2分泌受到負調節我們想知道hCDR肽是否能夠抑制在用人16/6Id mAb刺激後SLE患者PBL的IL-2分泌。所述抑制也提示所述基於人CDR的肽至少部分通過負調節IL-2分泌而抑制針對16/6Id mAb的增殖反應。為此，在存在或不存在肽hCDR1或hCDR3的情況下，將SLE患者的PBL與人16/6Id mAb一起溫育。溫育48小時後，收集所述培養物的上清。使用IL-2依賴性CTLL細胞系進行測定，確定所述上清中的IL-2水平。簡要的說，CTLL系的細胞(2×104/孔)在不同上清存在下溫育24小時，然後加入3H-胸苷，繼續溫育18小時。然後收穫細胞，用β計數器測量放射性。使用重組人IL-2作為標準，據此計算結果。測試所述肽抑制23名應答者PBL受到人16/6Id mAb刺激後的IL-2分泌的能力。結果綜述於表5，顯示hCDR1和hCDR3分別抑制21/23以及19/23名患者PBL的IL-2分泌。PBL增殖反應的抑制直接與所述基於CDR的肽的IL-2抑制相關。因此，在確定有抑制增殖的所有病例中，都觀察到IL-2分泌的抑制。
圖8顯示用一名SLE患者的PBL獲得的結果(IL-2的分泌以pg/ml表示)，結果顯示hCDR1和hCDR3一起抑制100％由人16/6Id mAb觸發的SLE患者PBL的IL-2分泌。
表5.hCDR1和hCDR3抑制IL-2分泌肽 抑制活性*％ 最大抑制％hCDR1 91(21/23) 84±31hCDR3 83(19/23) 78±34*認為僅存在16/6Id的情況下IL-2分泌是100％。認為50％或以上的抑制具有顯著性。
實施例8.
基於CDR的肽正調節免疫抑制性細胞因子TGF-β的分泌為闡明所述基於人CDR的肽抑制針對人單克隆抗DNA 16/6Id抗體的增殖反應的機制，測定細胞培養物上清中免疫抑制性細胞因子TGF-β的水平。這些實驗的基本原理基於我們以前的發現，即患SLE的小鼠的脾細胞培養物在用人抗DNA 16/6Id mAb誘導後TGF-β水平提高，或者在用基於鼠CDR的肽治療後自發出現{(NZB x NZW)F1小鼠}TGF-β水平提高(Eilat等，2001)。TGF-β水平提高與受治療小鼠的疾病表現緩解相關。
為此目的，各種SLE患者的PBL培養物與人16/6Id mAb在存在或不存在肽hCDR1或hCDR3的情況下溫育48小時後，從培養物中取出上清。通過ELISA，根據廠商指導測定TGF-β。簡要地說，用PBS稀釋的重組人TGFβsRII/Fc嵌合物(RD Systems)(100ng/ml)包被Maxisorb板(Nunc)。封閉後，加入細胞上清。溫育18小時後，加入檢測用生物素化的抗人TGF-β抗體(RD Systems)。所使用的底物溶液是TMB染色試劑(Helix Diagnostics)，使用MRX ELISA讀板儀，用570nm和630nm濾片評估酶活。結果綜述於表6。
圖9中的結果證明用致病性人16/6Id mAb刺激一名有代表性的SLE患者的PBL後，肽hCDR1和hCDR3觸發所述PBL的TGF-β分泌(以pg/ml表示)顯著正調節。
表6hCDR1和hCDR3肽正調節SLE患者PBL的16/6Id誘導刺激的TGF-β分泌。
肽 TGF-β的正調節％ 最大正調節％hCDR1100(19/19)305±221hCDR3100(19/19)338±242認為在16/6Id單獨存在下TGF-β的分泌(平均值636±25pg/ml)是100％。結果表示為在單獨存在16/6Id的情況以上的分泌百分率。
實施例9.
hCDR1免疫調節小鼠的SLE表現用hCDR1治療(NZB x NZW)F1小鼠後疾病表現的緩解。
如上文所示，基於人抗DNA 16/6Id mAb CDR的肽能夠以相似的效率抑制16/6Id mAb引發淋巴結細胞以及SLE患者PBL應答16/6IdmAb的增殖反應。因此，我們想查明這些肽是否能在動物模型中免疫調節SLE樣疾病。
所述實驗的目標在於查明所述人類肽治療已經建立的SLE疾病的能力，首先用hCDR1肽進行所述實驗。為此，設計一些實驗，其中用hCDR1肽在易患SLE的(NZB NZW)F1小鼠5個半月齡、已經觀察到SLE樣疾病的表現(抗dsDNA、蛋白尿等)時進行治療。每周皮下給予PBS中的hCDR1肽，共10周。測試不同劑量(50、100和200μg/小鼠)hCDR1肽的功效。對照組注射媒介物PBS。該治療導致抗dsDNA自身抗體滴度中度降低。因此，在1∶1250血清稀釋度，治療結束時分別對PBS處理的小鼠、50μg/小鼠、100μg/小鼠和200μg/小鼠hCDR1治療的小鼠的血清測得0.586±0.1、0.27±0.1、0.37±0.1和0.29±0.1的O.D.值。
我們進行另一個實驗，其中每周為7月齡(NZB x NZW)F1小鼠皮下注射PBS中的300μg hCDR1，共10周。在用hCDR1治療的小鼠的血清中能夠觀察到抗DNA抗體滴度輕度降低。然而，表7顯示用hCDR1治療導致蛋白尿降低以及受治療小鼠腎內的免疫複合物沉積(ICD)顯著減少。該表中的結果表示ICD的強度，其中0＝沒有ICD；1＝中度ICD；2＝嚴重ICD而3＝嚴重並且極強烈的ICD。
表7用hCDR1在7月齡治療的(NZB x NZW)F1小鼠的臨床表現
p相對於未處理組小鼠計算。
然後我們進行另一個實驗，該實驗使用400μg/小鼠的hCDR1，查明是否能夠通過增加所述肽的劑量獲得更多的有益效果。用400μg/小鼠的hCDR1治療對於抗DNA抗體滴度沒有更多的效果，並且如表8所示，其對腎病的效果與用300μg劑量治療後觀察到的效果相似。
表8用hCDR1在7月齡治療的(NZB x NZW)F1小鼠的臨床表現
p相對於未處理組小鼠計算。
因此，我們進行另一個實驗，其中用300μg hCDR1在7月齡治療小鼠，並且使用對照肽，所述對照肽即反向hCDR1。該實驗的目的是查明用hCDR1治療除緩解臨床表現外，是否免疫調節細胞因子產生。圖10證明抗DNA自身抗體水平輕度降低。表9顯示在不同時間點測量的蛋白尿。
表9用hCDR1在7月齡治療的(NZB x NZW)F1小鼠的臨床表現
在所有測量中可以看到用hCDR1治療的效果。腎損害是(NZB xNZW)F1小鼠中SLE樣疾病的主要表現之一。用hCDR1肽治療十周顯著減少腎損害。在治療腎損害這一方面，50μg劑量不如100和200μg劑量有效。後兩種劑量的有效性相似。
圖11A-11D是圖，顯示用100μg劑量hCDR1治療的小鼠有代表性的腎切片。因此，處死9月齡的小鼠，取出腎，立即在液氮中冰凍。5μm的冰凍恆冷箱切片風乾，在丙酮中固定。為檢測Ig沉積，用FITC綴合山羊抗小鼠IgG(γ鏈特異性)溫育切片。圖11A和11B顯示PBS處理組小鼠(對照)的腎切片，而圖11C和11D顯示用100μghCDR1治療的小鼠的腎切片。可以在圖中看到，所述治療減少免疫複合物的數目以及強度(11A、11C x 100；11B、11D x 400)。
各組(NZB x NZW)F1在小鼠7月齡、已經觀察到充分發展的疾病時接受hCDR1治療，獲得相似結果。用100μg/小鼠或300μg/小鼠治療小鼠10周。兩種劑量的治療都導致抗DNA自身抗體滴度中度降低，這與上述結果相似。還測量到蛋白尿相對於PBS處理組降低。用兩種劑量治療後腎病都得到緩解；然而，在用300μg劑量治療的小鼠的組內測得更顯著的效應。圖12A-12F是每組有代表性的小鼠腎切片，其中A、B代表未治療的小鼠；C、D代表用hCDR1治療的小鼠的腎，而E、F代表用反向hCDR1治療的小鼠的腎切片。A、C、E x 100而B、D x 400。
圖13A-13C顯示通過ELISA測得的治療(每周皮下注射，共10周)結束時3組小鼠用Con A刺激的脾細胞培養物的上清內細胞因子(INF-γ、IL-10和TGF-β)模式。可以看到，INF-γ(圖13A)和IL-10(圖13B，程度更低)在接受治療的小鼠體內受到負調節。在未刺激的細胞的上清中可以看到TGF-β分泌增加(圖13C，左)。Con A並不觸發所述細胞分泌更多的TGF-β(圖13C，右)。
上面綜述的結果指出用hCDR1長期治療緩解疾病表現並且免疫調節細胞因子分泌。
實施例10.
在誘導實驗性SLE後，用人hCDR1肽治療BALB/c小鼠我們想查明hCDR1肽是否能夠治療小鼠體內用人抗DNA 16/6IdmAb誘導的實驗性SLE。因此，用16/6Id致病性自身抗體免疫並加強BALB/c小鼠。加強注射三個半月後，當所述小鼠已經發展出疾病表現時，將它們分成三組。一組不接受治療，第二組用100μg/小鼠hCDR1治療，第三組用300μg/小鼠hCDR1肽治療10周。跟蹤小鼠的臨床表現。
表10展示治療結束時在接受測試的個體小鼠觀察到的結果。對於治療所用的兩種劑量，都觀察到所有測量的臨床表現得到緩解[抗dsDNA自身抗體、白細胞計數(WBC)和尿蛋白]。實驗結束時(加強注射後7個月)分析處死的小鼠的腎，顯示在用16/6Id mAb免疫和未治療的10隻小鼠中有9隻出現免疫複合物沉積。與此不同，在用16/6IdmAb免疫並分別用100μg/小鼠和300μg/小鼠hCDR1治療的小鼠中，分別僅在3/10和2/9小鼠的腎中觀察到免疫複合物沉積。因此，結果顯示人類肽hCDR1能夠治療已經建立的實驗性SLE。
表10用100μg或300μg hCDR1肽治療患有實驗性SLE的BALB/c小鼠的效果。
*＝與注射16/6Id組有顯著差異(P＜0.05)。
在另一個實驗中，用人16/6Id免疫和加強BALB/c小鼠，誘導實驗性SLE。加強兩個月後，將小鼠分組(每組8隻小鼠)。用200、300或400μg/小鼠治療所述小鼠10周。跟蹤觀察小鼠的抗體產生、白細胞減少、蛋白尿，並在治療結束兩個月後處死小鼠，分析它們腎內的免疫複合物沉積。結果綜述於表11，顯示治療對於16/6Id特異性抗體反應沒有效應。
表11用200μg、300μg或400μg hCDR1肽治療患有實驗性SLE的BALB/c小鼠的效應。
然而，治療影響抗DNA抗體滴度、白細胞減少、蛋白尿水平，更重要的是，影響腎內的免疫複合物沉積。實驗的對照組是同樣年齡的完全未接受免疫或治療的BALB/c小鼠。該實驗提示hCDR1有效治療實驗性SLE，但沒有觀察到400μg劑量的好處。
因此，進行另外一個實驗，其中用200和300μg/小鼠治療小鼠。在該實驗中使用對照肽反向hCDR1。該實驗的目的除比較200和300μg治療劑量外，是研究治療對於接受治療的小鼠體內細胞因子產生的影響。用16/6Id免疫和加強六十隻BALB/c小鼠。加強三個月後，將小鼠分組(每組15隻小鼠)，每組或者不進行進一步的治療，或者每周接受200或300μghCDR1的治療。另一組接受300μg反向hCDR1治療。第五組(對照)不接受免疫並且不接受進一步治療。跟蹤觀察小鼠的抗體產生和疾病表現。如表12所示，各組間小鼠血清內的抗16/6Id抗體水平(稀釋度1∶10000)並沒有差別。如該表所示，用200和300μg治療降低抗DNA抗體水平(血清稀釋度1∶1250)。表12也綜述不同組小鼠間的臨床表現。可以看到，雖然兩種劑量都有效降低白細胞減少和蛋白尿，但在該實驗中200μg劑量的效應沒有達到顯著性(實驗結束一個月後處死小鼠)。
表12用200μg或300μg hCDR1或300μg revhCDR1治療患有實驗性SLE的BALB/c小鼠的效應
圖14A-F顯示每組的一個腎，其中A、B代表未治療的小鼠；C、D代表用hCDR1治療的小鼠，E、F代表用反向hCDR1治療的小鼠的腎切片。圖A、C、E x 100而B、D、F x 400。
圖15A-E顯示接受治療的小鼠的用16/6Id刺激的淋巴結培養物上清內不同細胞因子的水平。後面的實驗在治療結束時進行(10次治療注射後)。可以看到，用hCDR1治療(兩種劑量)負調節INF-γ(圖15A)、IL-10(圖15C)和TNF-α(圖15B)。另一方面，hCDR1正調節TGF-β的水平。因為脾細胞通常比淋巴結細胞分泌更多的TGF-β(圖15D)，所以也測量在用16/6Id觸發的各組小鼠脾細胞上清內的TGF-β(圖15E)。
因此，在患有誘導型實驗性SLE的小鼠體內，hCDR1緩解疾病表現並免疫調節細胞因子分泌。
實施例11.
通過接受hCDR1治療的小鼠的脾細胞轉移對狼瘡表現的有益效應重要的是研究受治療小鼠的脾細胞是否能夠傳遞hCDR1治療的有益效應，即負調節疾病表現的效應。為此，我們進行一個實驗，其中將8月齡大的已經患有完全發展的狼瘡樣疾病的(NZB x NZW)F1小鼠分為2個組。組1不接受治療，向組2的小鼠轉移20×106個3月齡(NZB x NZW)F1小鼠的脾細胞，所述(NZB x NZW)F1小鼠已經接受300μg/小鼠hCDR1注射3次(皮下，每隔兩天)。所有脾細胞都胃腸外注射。測試小鼠的抗dsDNA自身抗體產生、疾病表現，並在轉移細胞4周後處死小鼠。轉移hCDR1治療小鼠的細胞導致抗DNA抗體的水平輕度降低。
表13證明轉移hCDR1治療小鼠的脾細胞導致顯著更低的蛋白尿，並且腎內的免疫複合物減少。
表13hCDR1治療小鼠脾細胞的小鼠接受者中的臨床狼瘡表現
p值相對於未治療小鼠的grl計算重複所述實驗幾次，使用revhCDR1作為對照。結果類似於第一個實驗的結果，即轉移受治療小鼠的細胞輕微影響抗DNA滴度，顯著影響蛋白尿和腎損害。表14顯示一個有代表性的實驗的臨床表現。
表14hCDR1治療小鼠脾細胞的小鼠接受者中的臨床狼瘡表現
p值相對於未治療小鼠的grl計算可以看到受治療小鼠的脾細胞能夠傳遞用hCDR1治療的負調節效應。
圖16A-F顯示組1(A、B-未治療小鼠)、組2(用hCDR1治療的2月齡小鼠的脾細胞的接受者)和組3(用revhCDR1治療的2月齡小鼠的脾細胞的接受者)的小鼠的腎切片。A、C、E x 400；B、D、F x 100。
上面實驗的結果指出以前用hCDR1治療的健康小鼠的免疫細胞可以傳遞hCDR1對疾病表現的緩解效應。
實施例12.
鼠mCDR肽負調節MMP-3和MMP-9基質金屬蛋白酶(MMP)(Shingleton等，1996；Goetzl等，1996；Massova等，1998)構成包含鋅的內切蛋白酶的一個家族，該家族在正常組織中細胞外基質的重建中起重要作用，並且促進病理學進行。它們具有共同的結構域，但在底物特異性、細胞來源以及誘導性上不同。
MMP作為酶原樣潛在前體合成，隨後轉化為活性形式。MMP-2和MMP-9都是明膠酶，能夠降解IV型膠原蛋白、變性的膠原蛋白、V型、VII型、X型和XII型膠原蛋白、玻連蛋白、聚集蛋白聚糖、galectin-3以及彈性蛋白。MMP-2是最廣泛表達的MMP。它由多種細胞產生，常常在惡性腫瘤轉移時水平升高。
在蛋白質和域結構方面，MMP-9是目前鑑定的最大和最複雜的成員。MMP-9表達的特徵在於在基因轉錄以及蛋白分泌(例如細胞因子、趨化因子、類二十烷酸)炎症介質水平受到嚴格控制的複雜調節，並且受到金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)作用的調節。此外，MMP-9活性受到pro-MMP-9的激活、血纖維蛋白溶酶原激活系統的成份或其它MMP的調節(Guedez等，1996)。
已經在各種自身免疫病如多發性硬化(Ozenci等，1999)及其動物模型實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)(Gijbels等，1994)、類風溼性關節炎(Keyszer等，1999)、急性熱病性多神經炎(Creange等，1999)、實驗性大皰性類天皰瘡(Liu等，1998)和實驗性自身免疫神經炎(Hughes等，1998)中，證明MMP涉及自身免疫病。據報導，狼瘡神經炎患者體內MMP-3和TIMP-2的血清水平顯著高於健康對照的血清水平，但沒有注意到與疾病活動性的相關性(Zucker，1999；Keyszer等，1999)。
MMP抑制劑在幾個自身免疫病動物模型中的抑制效應已經提示MMP的許多活性在炎症反應中的潛在重要性。在幾種炎症和自身免疫病中，在體內對MMP的特異性抑制會抑制水腫、病理性組織增殖以及對專化組織結構的損傷(Gijbels等，1994；Wallace等，1999；Conway等，1995)。
根據本發明，我們顯示MMP-3和MMP-9的水平在患有自發性SLE或誘導性實驗性SLE的小鼠的血清和腎內提高。我們已經證明基於CDR的鼠肽緩解小鼠中的狼瘡表現，用所述肽治療患有SLE的小鼠降低MMP-3和MMP-9在受治療小鼠的血清和腎內的水平，並且導致疾病表現緩解。預期本發明的人hCDR肽表現同樣效應。
實施例12(i)MMP-3、MMP-2和MMP-9在(NZBxNZW)F1小鼠血清內出現的動力學。
我們首先調查(NZB x NZW)F1小鼠內自發性SLE的發展是否與MMP-3、MMP-2和MMP-9在它們血清中水平的改變有關。因此，我們從2月齡觀察到疾病表現前開始，跟蹤調查它們的水平，直到8月齡所述小鼠患有充分發展的疾病以後。結果顯示於圖17。如圖17A所示，根據蛋白質印跡分析檢測，MMP-3的34kd和40kd形式在2月齡小鼠血清中都非常低。所有形式的水平朝著8月齡(最後一個測試時間點)的方向逐漸提高。相似地，圖17B顯示根據凝膠酶譜法，MMP-9在小鼠血清中的活性在2月齡低，然後隨著疾病進行逐漸提高直到8月齡。在圖17B中也可以看到MMP-2的水平並不隨著疾病進行顯著改變。
實施例12(ii)MMP-3、MMP-2和MMP-9在用16/6Id免疫的BALB/c小鼠血清內出現的動力學以前我們實驗室的結果已經顯示用16/6Id免疫後可以在BALB/c小鼠中誘導SLE(Mendlovic等，1988；Waisman等，1993)。因此，我們想測試SLE的誘導模型在MMP-3和MMP-9變化方面是否類似於(NZB x NZW)F1模型。由此，我們觀察該SLE實驗模型中的MMP-3和MMP-9水平。圖18顯示的結果指出MMP-3的水平(所有同種型)在加強10天後(免疫後4.5周)升高，並且比同等年齡的對照未免疫或CFA免疫BALB/c小鼠體內的水平更高(圖18A)。MMP-3的水平隨著年齡的增長在所有組中提高，然而，其水平在16/6Id免疫小鼠中總是高於對照組。與此不同，在加強後2個月之前，都沒有檢查到MMP-9活性的誘導型變化(圖18B)。在加強後約4個月可以觀察到MMP-9在16/6Id免疫小鼠體內的活性比在未免疫小鼠體內的活性更高。
實施例12(iii)在用16/6Id免疫的BALB/c小鼠的腎切片中，MMP-3和MMP-9的特異性正調節。
由於用16/6Id免疫BALB/c小鼠導致SLE特徵性的臨床表現，其中包括腎損害(Mendlovic等，1988；Waisman等，1993)，並且因為(NZB x NZW)F1小鼠體內的腎損害據報導與MMP-3和MMP-9水平的提高相關(Nakamura等，1993)，所以我們觀察這些酶在用16/6Id免疫的BALB/c小鼠腎內的表達。作為對照，我們使用CFA免疫的小鼠以及年齡匹配的未免疫小鼠。在加強時間點為這兩個對照組注射PBS。用16/6Id加強後兩個月和5個月，針對MMP-3或MMP-9免疫染色小鼠腎切片。圖19顯示加強後5個月取得的腎的免疫組織學。如在圖中可以看到的，用CFA免疫小鼠正調節MMP-3(19A)、MMP-9(19B)在腎、腎小球和周圍組織中的表達。然而，用在CFA中的16/6Id免疫進一步顯著提高這兩種MMP的表達水平。在用16/6Id加強後兩個月已經觀察到這種升高(數據未顯示)。還顯示所述染色的非特異性背景水平(19C)。
實施例12(iv)鼠肽mCDR1肽負調節(NZB x NZW)F1小鼠血清中MMP-3的水平和MMP-9的活性。
由於我們發現MMP-3和MMP-9的水平在SLE的兩個實驗模型中都升高，因此我們想檢查在用mCDR1肽治療後觀察到的SLE臨床症狀緩解(Eilat等，2000；Eilat等，2001)是否伴隨MMP-3和MMP-9水平的降低。因此，我們在小鼠2月齡(在觀察到臨床表現之前)處理自發發展出SLE樣疾病的(NZB x NZW)F1小鼠每周為它們皮下注射PBS中的mCDR1(250μg/小鼠)共10周。該實驗方案導致所有臨床症狀的緩解(Eilat等，2000)。如在圖20中可以看到的，血清內MMP-3兩條在下面的帶減少(20A)，MMP-9活性降低(20B)。所述減少和降低與臨床表現的減少相關(Eilat等，2000)。如在圖20A中所看到的，MMP-3的45kd形式不受影響。
我們還想查明mCDR1肽是否能夠負調節MMP-3已經升高的水平以及MM-9的活性。因此，我們觀察(NZB x NZW)F1小鼠血清中MMP-3的水平和MMP-9的活性，所述小鼠在已經觀察到疾病表現時接受mCDR1治療。我們使用反向mCDR1作為對照肽。如圖所示(圖20，右邊)，用mCDR1治療病鼠特異性負調節血清中的MMP-3水平(20A)和MMP-9活性(20B)，而用revmCDR治療則沒有觀察到這種效果。
實施例12(v)mCDR1肽負調節16/6Id免疫小鼠血清內的MMP-3水平和MMP-9活性。
如我們已經證明的，MMP-9活性在兩個SLE實驗模型[(NZB xNZW)F1和16/6Id誘導型]中升高。因為mCDR1肽在兩個模型中都緩解疾病，並且負調節受治療(NZB x NZW)F1小鼠血清內的MMP-3水平和MMP-9活性，我們進一步尋找治療對16/6Id免疫BALB/c小鼠血清內這些酶的效應。圖21顯示一個預防實驗和一個治療實驗的結果。該圖顯示mCDR1也能調節該實驗模型中的MMP-3和MMP-9。在所述預防實驗方案和所述治療實驗方案中都觀察到MMP-3水平和MMP-9活性的負調節。因此，在誘導疾病階段或在完全發展的疾病階段，體內給予mCDR1能夠降低MMP-3(21A)和MMP-9(21B)的水平。這種降低是特異性的，因為用反向mCDR1治療並不影響MMP-3或MMP-9活性(未顯示)。使用MMP-9活性測定系統(得自Amersham-Pharmacia Biotech UK Limited，England)得到的初步結果顯示未免疫BALB/c小鼠的血清活性相當於7ng/ml純的活性MMP-9。用16/6Id免疫提高所述活性到16ng/ml，而用mCDR1肽治療負調節所述活性到幾乎正常的水平(8.5ng/ml)。
實施例12(vi)mCDR1肽治療對16/6Id免疫BALB/c小鼠腎切片中MMP-3和MMP-9水平的效應。
因為MMP-3和MMP-9在患有誘導型實驗性SLE的小鼠的腎中提高，所有我們想觀察mCDR1肽治療對受治療小鼠腎內後面MMP表達的效應。圖22證明在預防實驗(圖22A)和治療實驗(圖22B)中，mCDR1負調節受治療小鼠腎內MMP-3和MMP-9的表達水平。在腎小球和間質都觀察到MMP水平的降低。所觀察到的MMP表達減少與使用抗Ig針對免疫複合物沉積的染色減少相關(圖22B)。
因為MMP-3和MMP-9明顯參與SLE的發病機理，所以我們測試人hCDR1肽是否能夠在緩解疾病表現的同時，相關地負調節後者的水平。為此，每周一次皮下注射100μg或300μg/小鼠hCDR1，共10周，治療各組(NZB x NZW)F1小鼠，然後在治療期間的不同時期測試各組匯集的血清內的MMP水平。圖23顯示一個實驗的結果，其中在小鼠7月齡觀察到所有臨床表現後開始對小鼠進行治療。結果是在治療中間、5次注射hCDR1後收集的血清的結果。圖23的結果指出用300μg hCDR1治療小鼠負調節MMP-3水平和MMP-9活性。這些結果與用hCDR1治療後疾病表現的顯著緩解一致。
討論上面的結果顯示MMP-3和MMP-9在SLE鼠模型的血清中和腎內都升高。鼠mCDR1肽能夠負調節患有SLE的小鼠血清中和腎內的MMP-9和MMP-3水平。證明在SLE的自發模型中，血清中MMP-9和MMP-3的正調節都出現在頭3.5個月內。在誘導模型中，血清中MMP-3水平提高出現非常早(用16/6Id加強後10天)，而MMP-9活性的升高在約3-4個月之後出現。16/6Id誘導模型允許我們跟蹤疾病最早幾個階段的過程，根據該模型的結果，看起來MMP-3涉及誘導疾病，而MMP-9涉及疾病發展。
我們的結果顯示在SLE的小鼠模型中MMP-3升高，該結果與下面的結果一致MMP-3在SLE患者血清中顯著增加(Kotajima等，1998)，以及(NZB x NZW)F1小鼠體內MMP-3轉錄物隨神經炎的進行顯著增加(Nakamura等，1993)。總而言之，這些結果提示MMP-3可能促進狼瘡神經炎中腎小球損傷的發展。
我們的結果顯示在SLE的誘導模型和自發模型中，血清中的MMP-2活性水平並不隨著疾病進行而顯著升高。這些結果與以前報導的結果(Zucker，1999)相符，即MMP-2水平在SLE中不提高。因此，用基於CDR1的肽治療並不調節該酶(數據未顯示)。MMP-2的水平組成型分泌，在其它病理條件下(例如視神經炎和多發性硬化)也不改變，而MMP-9的水平相對於健康對照升高(Gijbels等，1992；Paemen等，1994)。
有趣的是，mCDR1肽特異性並直接影響SLE相關的T細胞反應，它可以負調節已經正調節(治療方案)的MMP-3和MMP-9水平，以及防止它們升高(預防方案)。
還未報導過SLE患者體內或SLE動物模型中血清內的MMP-9活性。這是首次顯示SLE和MMP-9之間的相關關係，並且首次證明MMP-9在患有SLE的小鼠的血清和腎中升高。雖然MMP-9在血清中的升高相對較晚(約加強後4個月)，但誘導疾病後在早期階段(2個月)就觀察到腎內MMP-9的升高(數據未顯示)。本文還首次顯示緩解小鼠SLE表現的肽(如上文所示的mCDR1和hCDR1)也負調節血清中和腎內的MMP-9。後面的數據還得到初步結果的支持，所述初步結果使用MMP-9活性測定系統，顯示用16/6Id免疫升高MMP-9活性，而用基於CDR1的肽治療負調節該活性到未免疫小鼠的活性水平。
本文還首次證明在自身免疫病的實驗模型中，MMP-3和MMP-9的誘導動力學不同，所述實驗模型如本文專門針對SLE所示。這可能指出上述MMP在所述疾病的發病機理中的不同作用。我們的結果證明免疫調節SLE相關T細胞反應並負調節疾病表現的肽能夠控制那些MMP在血清和腎中的分泌(雖然不一定是由T細胞本身分泌)。這些結果指出MMP-3和MMP-9在SLE的發病機理中起作用，並且可能一方面作為疾病進行的替代標記，另一方面作為給定治療緩解疾病的替代標記。
實施例13.
MMP-9活性(而不是MMP-2活性)在SLE患者的血清中升高在本實施例中，我們測定40名SLE患者血清中的MMP-9和MMP-2水平，我們證明SLE患者血清中MMP-9活性而不是MMP-2活性相對於健康對照顯著上升。高MMP-9活性與盤形疹、雷諾現象、肺炎、黏膜潰瘍以及抗磷脂抗體(ApLA)的存在相關。此外，MMP-9升高的水平與男性患者組內的SLE活動性相關。
材料和方法患者。四十名患者參加本研究，包括32名女性和8名男性。所有患者表現至少四項美國風溼病學學院(American College ofRheumatology，ACR)針對診斷SLE建立的修訂診斷標準(Winchester，1996)。本研究中二十五名性別和年齡相匹配的健康志願者作為對照組。患者在診斷時的平均年齡是29±9.7歲(範圍從15-48歲)，平均隨訪期是11±10年(範圍1-32年)。根據SLEDAI狼瘡活動性指數(Bombardier等，1992)確定疾病活動性。該研究得到以色列Rehovot的Kaplan醫療中心倫理委員會的批准。
通過活性測定試劑盒測量MMP-2和MMP-9。通過特異性BiotrakMMP-2或MMP-9活性測定試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech UKLimited，UK)，根據廠家的操作指南測量MMP-2和MMP-9的活性。血清分別稀釋1∶100倍和1∶32倍，以測定MMP-2和MMP-9活性。在每個測定中加入合適的標準。為測量MMP總含量，使用對氨基苯乙酸汞(APMA)激活MMP的原形式。
通過凝膠酶譜法測量MMP-2和MMP-9活性。通過明膠酶譜法測定MMP-2和MMP-9活性。通過1mg/ml明膠聚合的8％SDS-PAGE分離5μl血清樣品。凝膠在2.5％Triton X-100中洗滌30分鐘一次，除去SDS，然後在含50mM Tris-HCl，200mM NaCl，10mM CaCl2和0.02％(重量/體積)Brij 35的反應緩衝液(pH7.5)中洗滌30分鐘一次。更換新鮮的反應緩衝液，將所述凝膠在37℃溫育24小時。通過用0.5％考馬斯亮藍染色凝膠，顯示明膠水解活性，然後通過光密度測定法進行定量。
統計分析。使用卡方檢驗或Fisher精確檢驗(Fisher exact test)、非配對t-檢驗和兩尾P值評估數據。也使用Superman分析和多變量分析。
實施例13(i)MMP-9活性而不是MMP-2活性在SLE中升高如上文所述，MMP-9涉及幾種自身免疫病以及SLE的動物模型。因此。我們感興趣的是研究MMP-9是否也在SLE患者的血清中升高。為此目的，我們通過凝膠酶譜法檢查40名SLE患者和25名健康對照的血清，其中可以看到MMP-9和MMP-2的活性。圖24顯示一塊有代表性的凝膠。如在該圖中可以看到的，MMP-9在SLE患者血清中的水平相對於健康對照提高。對40名SLE患者和25名健康對照的血清酶譜法的光密度測定法分析指出SLE患者的平均MMP-9活性是109±5.6光密度單位，健康對照的平均MMP-9活性是76.5±4.2光密度單位(p＝0.0001)。高於85光密度單位的活性值(健康對照平均值+2s.e.)被認為是高的。結果證明在68％的SLE患者體內出現高活性水平MMP-9。僅3％健康對照表現高MMP-9活性(p＝0.001)。對同樣血清樣品中MMP-2水平的光密度測定法分析揭示SLE患者和健康對照血清間MMP-2活性的差異不顯著。因此，針對健康對照和SLE患者分別測得109±7和123±5(平均活性光密度單位±標準差)的值(p＝0.0531)。為進一步定量血清中的MMP-9和MMP-2活性水平，我們使用活性測定試劑盒。
圖25顯示MMP-9活性在SLE患者血清中相對於在健康對照血清中的水平提高到三倍，並且這種提高在統計學上顯著(P＝0.0302)。與此不同，兩組間MMP-2水平的差異不顯著(P＝0.1254)。
由於我們以及其他人(Ebihara等，1998和1999)在患有非SLE慢性腎衰竭(如糖尿病、高血壓)的患者血清中檢測到可能由於MMP-9的保留而產生的高MMP-9水平，因此我們分析在所測試的SLE患者組內MMP-9水平與腎功能之間的相關性。在肌酸酐水平和MMP-9水平間沒有觀察到相關性(r2＝0.01)，這指出SLE患者體內MMP-9水平升高不是該酶由於腎損害而保留的結果。
實施例13(ii)MMP-9活性與臨床和實驗室參數之間的相關性SLE患者血清中MMP-9活性水平的升高促使我們尋找臨床和實驗室參數與血清MMP-9水平之間的可能相關性。進行統計學分析(卡方分析或Fisher精確檢驗)，研究每種臨床表現具有高的和正常的MMP-9水平的患者數目(表15)，並且考慮具有或不具有某種臨床症狀的患者的實際平均MMP-9活性水平。兩個分析的結果是相似的。值得注意的是，對於所有的臨床症狀，MMP-9水平升高的患者百分率遠遠高於健康對照組內的百分率。MMP-9水平與性別、患病時間或發病年齡不相關(Person，Spearman)。
圖15顯示根據患者MMP-9活性水平(低於或等於健康對照＝正常)排列的SLE患者的臨床和實驗室特徵。高水平MMP-9與雷諾現象的存在顯著相關(P＝0.0138)，並且與APLA顯著相關(P＝0.041)。對於肺炎、盤狀疹、神經學疾病和黏膜潰瘍觀察到強相關關係。然而，具有後面表現的患者數目太少，無法進行統計分析。多變量分析揭示雷諾現象和低補體(C3、C4)水平與高MMP-9水平呈正相關(P＝0.0001和0.0137)。與此不同，光敏感性、關節炎和血液學疾病與MMP-9活性水平呈負相關(P＝0.0381、0.0014和0.0065)。
表15根據患者MMP-9水平具有高的和正常的MMP-9活性的患者的臨床特徵。
根據ACR修訂的標準(Winchester，1996)定義臨床損害程度。分別使用Hep2細胞和Crithidia luciliae測定抗核抗體(ANA)和抗ds DNA抗體。根據下面測試中一個或多個的反應性定義抗磷脂抗體(APLA)假陽性VDR、狼瘡抗凝血劑(LAC)或針對抗心磷脂抗體的ELISA。
我們還查找男性患者(圖26A)和女性患者(圖26B)在SLEDAI和MMP-9活性之間的可能相關性。有趣的是，相關係數在男性中顯著並且是肯定的(r2＝0.6333)，但對於女性不顯著並且是否定的(r2＝0.0571)。使用BILAG評分系統得到相似的結果。因此，男性的MMP-9活性和BILAG分數之間觀察到肯定的相關係數(r2＝0.6442)，而女性的該相關係數不顯著。
我們還想確定患者應用的各種治療形式與MMP-9活性之間是否存在相關性。如在表16(A)中看到的，在患者的當前治療與MMP-9活性之間沒有顯著的相關性。然而，當我們在他們病程內的任何時間觀察患者時(表16(B))，高MMP-9水平與細胞毒性劑的應用相關(82％)。
表16根據患者MMP-9水平分類的SLE患者的治療形式
以200-400mg/天的劑量應用抗瘧劑羥氯喹。類固醇治療定義為以日劑量≥5mg使用潑尼松；使用的細胞毒性劑是環磷醯胺(0.5-1g/m2，每月)或硫唑嘌呤(100-150mg/天)。
實施例13(iii)在不同時間點從各個SLE患者取得的血清樣品中MMP-9活性的變化由於疾病活動性隨時間變化，因此我們測量在4-6年隨訪期內取得的各個患者血清樣品內MMP-9和MMP-2的活性水平。分析在不同時間點取得的九名患者的血清。MMP-2的水平在患者和健康對照間沒有顯著變化。在測試的9名患者中，對5名患者可以觀察到各個患者血清樣品中MMP-9活性隨時間的變化。圖27顯示2名有代表性的SLE患者的結果。如可以看到的，MMP-9活性，而不是MMP-2活性，在同一患者體內隨時間而變化。這些變化與根據SLEDAI或BILAG系統測定的疾病活動性指數不相關。在不同時間點從5名健康對照取樣，在他們的血清中沒有檢測到MMP-9活性的變化(數據未顯示)。在4名其他SLE患者中，沒有觀察到MMP-9或MMP-2活性隨時間有實質性的變化，並且各個患者情況各不相同，MMP-9活性水平保持高或低的水平。
討論本研究首次顯示MMP-9涉及人SLE。我們顯示MMP-9而不是MMP-2的活性在68％SLE患者血清中相對與健康對照顯著升高。高MMP-9水平與雷諾現象、肺炎、神經性異常、盤狀疹和APLA的存在相關。在同一名患者疾病不同時期的血清中觀察到MMP-9活性的變化。女性患者中MMP-9活性水平並不與疾病活動性指數(SLEDAI、BILAG)相關，但男性患者中MMP-9活性水平與SLE活動性相關。
本研究顯示MMP-2活性水平在SLE患者血清中並未顯著升高。這些結果與以前的報導(Zucker，1999)一致，即MMP-2水平在SLE中不提高。在MMP-9水平相對於健康對照提高的其它病理狀況中(例如視神經炎和多發性硬化)，MMP-2水平也是組成型並且未改變(Gijels等，1992；Paemen等，1994)。
SLE的發病機理中可能涉及另一種MMP，即MMP-3，因為MMP-3在SLE患者血清中顯著升高(Kotajima等，1998)。本實施例中顯示的具有升高的MMP-9活性的SLE患者的頻率(68％)類似於SLE患者(76％)和RA患者(82％)中報導的高MMP-3水平的頻率。此外，隨著腎炎在(NZB x NZW)F1小鼠體內的進行，MMP-3轉錄物顯著增加(Nakamura等，1993)。
SLE患者血清中增加的MMP的來源仍然未知。已經顯示MMP-9由外周血細胞如T細胞、中性白細胞和巨噬細胞分泌(綜述見Goetzl等，1996)。在MMP-9活性水平和患者體內外周血細胞數目之間沒有相關性，這個事實提示MMP-9不是由外周血免疫細胞分泌，而是由SLE影響的器官如腎或肺/胸膜分泌。所有患肺炎的SLE患者都表現高MMP-9活性水平，這個觀察提示病肺是高MMP-9水平的一種來源。此外，細胞毒性治療(體現SLE相關器官損傷的嚴重性)與血清中高MMP-9水平之間的聯繫也支持這種意見，即患病器官是SLE患者體內MMP-9活性的來源。然而，仍然存在少數外周血淋巴細胞分泌更高MMP-9活性水平的可能性。
TNF-α和IL-1在人類疾病(Dean等，2000)和鼠模型(Segal等，1997；Theofilopoulos等，1999；Eilat等，2001)的SLE發病機理中都起重要作用。已經在幾個系統中顯示這些細胞因子誘導MMP-9產生(Guedez等，1996)，因此，有可能誘導MMP-9是這些細胞因子在SLE中的部分致病效應。已經報導由健康個體的外周血單核細胞自發分泌的MMP-9水平在暴露於TNF-α和IL-1β時受到正調節(Saren等，1996)。此外，T細胞和巨噬細胞的MMP通過切割膜結合形式而有利於TNF-α的分泌(Gearing等，1994)。因此，這些例子證明MMP對促炎細胞因子的相互調節效應，反之亦然。然而，在一些患者的血清中MMP-9活性水平在隨訪期內保持在正常範圍內，而在大多數患者的血清中測量到高MMP-9活性水平，這個事實提示遺傳因素參與MMP-9的調節。
本文的結果指出MMP-9可能在SLE的發病機理中起作用，並且在監測用幹預MMP-9活性的藥物治療的患者時，測量這種金屬蛋白酶的血漿/血清活性水平可能提供重要的信息。
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序列表110YEDA Research and Development Co.LtdMOZES，Edna120合成人肽以及用於治療系統性紅斑狼瘡的含所述肽的藥用組合物130TEVA-003 PCT150IL 1416471512001-02-2616030170PatentIn版本3.1210121120212PRT213鼠4001Thr Gly Tyr Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu1 5 10 15Glu Trp Ile Gly20210221120212PRT213鼠
4002Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Ala Lys Ala Thr20210321120212PRT213鼠4003Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Leu Trp Glu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp1 5 10 15Gly Gln Gly Ser20210421119212PRT213鼠4004Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly
210521117212PRT213鼠4005Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Thr1 5 10 15Leu210621119212PRT213人4006Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly210721122212PRT213人4007
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val2021082117212PRT213人4008Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser1 5210921116212PRT213人4009Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Ser Leu Lys Ser1 5 10 152101021118212PRT213人40010
Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met1 5 10 15Asp Val2101121119212PRT213人工序列220
223基於人16/6Id mAb CDR1的肽。
220
221MISC FEATURE222(1)..(19)223位置1的Xaa是Gly或Thr Gly；位置8的Xaa是Arg或Lys；位置10的Xaa是Pro或Ser；位置12的Xaa是Gly或Glu；位置13的Xaa是Lys或Asp；位置15的Xaa是Glu、Leu或Ser.
40011Xaa Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Xaa Gln Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Glu1 5 10 15Trp Ile Gly2101221119212PRT213人工序列
220
223SEQ ID NO11的肽，其中其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Leu。
40012Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly2101321119212PRT213人工序列220
224SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Ser。
40013Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Ser Glu1 5 10 15Trp Ile Gly2101421119212PRT213人工序列
220
225SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Asp，而Xaa(15)是Glu。
40014Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asp Gly Glu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly2101521119212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Lys，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Glu。
40015Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Lys Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly2101621119212PRT213人工序列
220
223SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Ser，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Glu。
40016Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Glu Glul 5 10 15Trp Ile Gly2101721119212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Glu，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Glu。
40017Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Glu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly2101821120212PRT213人工序列
220
223SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Thr Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Glu。
40018Thr Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu1 5 10 15Glu Trp Ile Gly202101921122212PRT213人工序列220
223基於人16/6Id mAb CDR3的肽。
220
221MISC_FEATURE222(1)..(22)224位置6的Xaa是Gly或Phe；位置9的Xaa是Arg或Ala；位置10的Xaa是Gly或Ala；位置11的Xaa是Gly或Ala；位置12的Xaa是Trp或Ala；位置13的Xaa是Asn或Ala；位置18的Xaa是Tyr或Trp；位置20的Xaa是Met或Gln。
40019Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Xaa Gly Xaa Asp Val
202102021122212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Ala，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
40020Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Ala Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val202102121122212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Ala，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
40021Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Ala Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val
202102221122212PRT213人工序列220
223SEQ IDNO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Ala，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
40022Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Ala Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val202102321122212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Ala，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
40023Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Ala Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val
202102421122212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Ala，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
40024Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Ala Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val202102521122212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Phe，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
40025Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val
202102621122212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Gln。
40026Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Gln Asp Val202102721122212PRT213人工序列220
223SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Trp，而Xaa(20)是Met。
40027Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Trp Gly Met Asp Val
202102821120212PRT213人工序列220
223以SEQ ID NO1反向順序製備的合成肽。
40028Gly Ile Trp Glu Leu Ser Lys Glu Pro Ser Gln Lys Val Trp Gln Met1 5 10 15Tyr Tyr Gly Thr202102921120212PRT213人工序列220
223以SEQ ID NO3反向順序製備的合成肽。
40029Ser Gly Gln Gly Trp Tyr Asp Met Ala Tyr Pro Glu Trp Leu Phe Arg1 5 10 15Ala Cys Tyr Tyr20
2103021119212PRT213人工序列220
223以SEQ ID NO6反向順序製備的合成肽。
40030Gly Ile Trp Glu Glu Gly Lys Gly Pro Pro Gln Arg Ile Trp Ser Trp1 5 10 15Tyr Tyr Gly
權利要求
1.一種合成肽，所述合成肽選自以下(a)一種至少12個胺基酸殘基、至多30個胺基酸殘基的肽，或者所述肽的鹽或化學衍生物，所述肽包含由人單克隆抗DNA 16/6Id抗體重鏈或輕鏈互補決定區(CDR)組成的序列或所述互補決定區內存在的序列(下文稱為「hCDR序列」)，或者所述肽包括如下獲得的序列(i)用不同要基酸殘基取代所述hCDR序列的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述hCDR序列缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述hCDR序列中添加一個或多個胺基酸殘基；(b)一種雙合成肽，所述雙合成肽包括相互之間直接共價連接或通過一個短連接鏈共價連接的兩種不同的(a)所述肽；(c)一種肽聚合物，所述肽聚合物包括多個(a)所述肽序列；以及(d)連接到大分子載體的(a)所述肽或(c)所述肽聚合物。
2.依照權利要求1的合成肽，其中所述hCDR序列包括由人單克隆抗DNA 16/6Id抗體重鏈CDR組成的序列或所述CDR內存在的序列。
3.依照權利要求1或2的合成肽，所述合成肽包括其它的胺基酸殘基。
4.依照權利要求3的合成肽，其中所述其它的胺基酸殘基是下面序列的胺基酸殘基在所述hCDR序列側翼的人16/6Id mAb序列，或用不同胺基酸殘基取代所述hCDR側翼序列的一個或多個胺基酸殘基、從所述hCDR側翼序列缺失一個或多個胺基酸殘基、和/或在所述hCDR側翼序列添加一個或多個胺基酸殘基而獲得的序列。
5.依照權利要求2到4中任一項的合成肽，所述合成肽選自以下(a)一種肽或該肽的鹽或化學衍生物，所述肽包含由SEQ ID NO8序列組成的序列或SEQ ID NO8內存在的序列，或者所述肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO8中的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO8中缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO8中添加一個或多個胺基酸殘基；(b)一種雙合成肽，所述雙合成肽包括相互之間直接共價連接或通過一個短連接鏈共價連接的兩種不同的(a)所述肽；(c)一種肽聚合物，所述肽聚合物包括多個(a)所述肽序列；以及(d)連接到大分子載體的(a)所述肽或(c)所述肽聚合物。
6.依照權利要求5的合成肽，所述合成肽包含由SEQ ID NO8序列組成的序列或SEQ ID NO8序列內存在的序列，或者所述合成肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO8中的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO8中缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO8中添加一個或多個胺基酸殘基。
7.依照權利要求6的合成肽，所述合成肽選自SEQ ID NO11序列組成的肽。
8.依照權利要求7的合成肽，所述合成肽選自SEQ ID NO12到NO18的序列所組成的肽。
9.依照權利要求7的合成肽，所述合成肽由SEQ ID NO6序列組成。
10.一種肽，所述肽由SEQ ID NO6序列組成。
11.依照權利要求2到4中任一項的合成肽，所述合成肽選自以下(a)一種肽或該肽的鹽或化學衍生物，所述肽包含由SEQ ID NO10序列組成的序列或SEQ ID NO10內存在的序列，或者所述肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO10中的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO10中缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO10中添加一個或多個胺基酸殘基；(b)一種雙合成肽，所述雙合成肽包括相互之間直接共價連接或通過一個短連接鏈共價連接的兩種不同的(a)所述肽；(c)一種肽聚合物，所述肽聚合物包括多個(a)所述肽序列；以及(d)連接到大分子載體的(a)所述肽或(c)所述肽聚合物。
12.依照權利要求11的合成肽，所述合成肽包含由SEQ ID NO10序列組成的序列或SEQ ID NO10序列內存在的序列，或者所述合成肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO10中的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO10中缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO10中添加一個或多個胺基酸殘基。
13.依照權利要求12的合成肽，所述合成肽選自由SEQ ID NO19序列組成的肽。
14.依照權利要求13的合成肽，所述合成肽選自由SEQ ID NO20到NO27的序列組成的肽。
15.依照權利要求13的合成肽，所述合成肽為由SEQ ID NO7序列組成的肽。
16.一種肽，所述肽由SEQ ID NO7序列組成。
17.依照權利要求2到4中任一項的合成肽，所述合成肽選自以下(a)一種肽或該肽的鹽或化學衍生物，所述肽包含由SEQ ID NO9組成的序列或SEQ ID NO9內存在的序列，或者所述肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO9中的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO9中缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO9中添加一個或多個胺基酸殘基；(b)一種雙合成肽，所述雙合成肽包括相互之間直接共價連接或通過一個短連接鏈共價連接的兩種不同的(a)所述肽；(c)一種肽聚合物，所述肽聚合物包括多個(a)所述肽序列；以及(d)連接到大分子載體的(a)所述肽或(c)所述肽聚合物。
18.依照權利要求17的合成肽，所述合成肽包含由SEQ ID NO9組成的序列或SEQ ID NO9序列內存在的序列，或者所述合成肽包含如下獲得的序列(i)用不同胺基酸殘基取代所述SEQ ID NO9中的一個或多個胺基酸殘基；(ii)從所述SEQ ID NO9中缺失一個或多個胺基酸殘基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO9中添加一個或多個胺基酸殘基。
19.依照權利要求2的雙合成肽，其中兩種不同的肽各自包含由不同的人16/6Id mAb重鏈CDR組成的序列或不同的人16/6Id mAb重鏈CDR內存在的序列，所述兩種不同的肽相互之間或者直接共價連接，或者通過短的連接鏈共價連接。
20.依照權利要求19的雙合成肽，其中一種權利要求6的肽共價連接一種權利要求12的肽。
21.依照權利要求20的雙合成肽，其中一種SEQ ID NO11的肽共價連接一種SEQ ID NO19的肽。
22.一種雙合成肽，其中SEQ ID NO6的肽共價連接SEQ ID NO7的肽。
23.依照權利要求1到4中任一項的肽聚合物，所述肽聚合物包含多個選自SEQ ID NO6、7和11-27的相同序列。
24.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含至少一種依照權利要求1到23的合成肽或肽聚合物以及藥學上可接受的載體。
25.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含具有SEQ ID NO6的序列的肽以及藥學上可接受的載體。
26.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含具有SEQ ID NO7的序列的肽以及藥學上可接受的載體。
27.依照權利要求24到26中任一項的藥用組合物，所述藥用組合物用於治療系統性紅斑狼瘡。
28.依照權利要求24到27中任一項的藥用組合物，所述藥用組合物適用於口服給藥、靜脈內給藥、皮下給藥、關節內給藥、肌肉內給藥、吸入給藥、鼻內給藥、鞘內給藥、腹膜內給藥、皮內給藥、經皮給藥或腸內給藥。
29.一種治療系統性紅斑狼瘡(SLE)的方法，所述方法包括給予SLE患者有效量的依照權利要求1到23中任一項的肽或肽聚合物。
30.依照權利要求29的方法，所述方法包括給予所述SLE患者有效量SEQ ID NO6的肽。
31.依照權利要求29的方法，所述方法包括給予所述SLE患者有效量SEQ ID NO7的肽。
32.一種免疫調節系統性紅斑狼瘡(SLE)患者SLE相關反應的方法，所述方法包括給予所述SLE患者有效量依照權利要求1到23中任一項的肽或肽聚合物。
33.依照權利要求32的方法，所述方法包括負調節SLE患者體內基質金屬蛋白酶(MMP)-3的水平和/或MMP-9活性。
34.依照權利要求32的方法，所述方法包括免疫調節SLE患者體內細胞因子活性水平。
35.依照權利要求34的方法，所述方法包括負調節SLE患者體內IL-2的水平和/或IFN-γ活性。
36.依照權利要求34的方法，所述方法包括負調節SLE患者體內TGF-β活性水平。
37.依照權利要求32到36中任一項的方法，所述方法包括給予所述SLE患者有效量SEQ ID NO6的肽。
38.依照權利要求32到36中任一項的方法，所述方法包括給予所述SLE患者有效量SEQ ID NO7的肽。
39.一種評價藥物治療SLE患者的有效性的方法，所述方法包括在不同時間間隔測量從用所述藥物治療的所述患者獲取的血液樣品中MMP-3和/或MMP-9的水平，由此把MMP-3和/或MMP-9的水平降低與所述藥物的有效性聯繫起來。
40.一種評價藥物治療SLE患者的有效性的方法，所述方法包括在不同時間間隔測量從用所述藥物治療的所述患者獲取的血液樣品中IL-2和/或IFNγ-的水平，由此把IL-2和/或IFN-γ的水平降低與所述藥物的有效性聯繫起來。
41.一種評價藥物治療SLE患者的有效性的方法，所述方法包括在不同時間間隔測量從用所述藥物治療的所述患者獲取的血液樣品中TGF-β的水平，由此把TGF-β的水平升高與所述藥物的有效性聯繫起來。
全文摘要
至少12個胺基酸殘基、至多30個胺基酸殘基的合成肽，所述合成肽包含由人抗DNA 16/6Id單克隆抗體重鏈或輕鏈互補決定區(CDR)組成的序列或在所述互補決定區內發現的序列，或者所述合成肽包含通過在所述序列取代和/或缺失和/或添加一個或多個胺基酸殘基而獲得的序列，所述肽的鹽、化學衍生物和聚合物可用於免疫調節系統性紅斑狼瘡相關反應。
文檔編號A61P29/00GK1503806SQ02808712
公開日2004年6月9日 申請日期2002年2月26日 優先權日2001年2月26日
發明者E·莫澤斯, E 莫澤斯 申請人:耶達研究及發展有限公司