絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的診斷工具的製作方法
2023-06-02 07:53:56 1
本發明屬於診斷領域，涉及一種絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的診斷工具，還涉及血液中dhrs12基因在製備絕經後婦女原發性骨質疏鬆症診斷工具中的應用。
背景技術：
骨質疏鬆症(osteoporosis，op)是一種以骨量低下、骨微結構破壞、導致骨脆性增加、易發生骨折為特徵的全身性骨病(who)。2001年美國國立衛生研究院(nih)提出骨質疏鬆症是以骨強度下降、骨折風險性增加為特徵的骨骼系統疾病，骨強度反映了骨骼的兩個主要方面，即骨礦密度和骨質量。
該病可發生於不同性別和任何年齡，但多見於絕經後婦女和老年男性。骨質疏鬆症分為原發性和繼發性兩大類。原發性骨質疏鬆症又分為絕經後骨質疏鬆症(i型)、老年性骨質疏鬆症(ii型)和特發性骨質疏鬆(包括青少年型)3種。絕經後骨質疏鬆症一般發生在婦女絕經後5-10年內，因絕經後卵巢合成雌激素減少所致，為骨量減少和骨組織微結構破壞，以致骨骼脆性增高從而易發生骨骼的一種全身性疾病。女性絕經後骨密度(bonemineraldensity，bmd)丟失速度很快，年丟失率為1.5％-2.5％，從而導致骨密度急劇下降，使得絕經後女性成為骨質疏鬆症的高發人群。
具有以下高危因素者易患絕經後骨質疏鬆症：
雌激素缺乏：雌激素缺乏，被認為是引起絕經後骨質疏鬆症的主要因素，絕經後卵巢功能減退，分泌雌激素水平降低，同時伴有維生素d、鈣的攝入不足，造成繼發性骨丟失。
遺傳因素：骨質疏鬆症多見於白種人，其次是黃種人，而黑種人最少。骨密度為診斷骨質疏鬆症的主要指標，骨密度值主要決定於遺傳因素，其次是受環境因素的影響。
營養因素：鈣缺乏，已發現青幼年時鈣的攝入量與成年人的骨量峰直接有關。低鈣飲食(<10mg·kg-1·d-1)者有3/4患有骨質疏鬆，而高鈣飲食(10mg·kg-1·d-1)者有1/4患有骨質疏鬆；長期蛋白質營養缺乏，造成血漿蛋白降低，骨基質合成不足，新骨生成落後，如同是伴有鈣的缺乏，骨質疏鬆會加快出現；維生素c缺乏，是骨基質羥脯氨酸合成不可缺少的，如缺乏可使骨基質合成減少。
廢用因素：肌肉對骨組織是一種機械力的影響，肌肉發達則骨骼粗壯，骨密度高。老年人活動減少，肌肉強度減弱，機械刺激減少，骨量減少。同時肌肉強度的減弱和協調障礙是老年人較容易摔倒，伴骨量減少時，則已發生骨折。
其他因素：酗酒、嗜煙、過多咖啡和咖啡因的攝入、肝素使用均是本病的危險因素。酒精中毒可影響鈣的吸收，酒精也直接作用於成骨細胞，抑制骨的形成。咖啡因攝入過多是尿鈣和內源性糞鈣丟失：肝素可引起骨質疏鬆，一般研究表明每天接受1500u以上的肝素治療患者中60％的發展成為骨質疏鬆症。
此外，年齡增長、服用皮質類固醇和抗驚厥藥物、具有骨質疏鬆症家族史或具有影響骨量的特殊基因、早絕經或絕經前行雙側卵巢切除術也是絕經後骨質疏鬆症的高危因素。
絕經後骨質疏鬆症早期可以沒有任何症狀，骨質在不知不覺中流失，直到發生骨折後才被意識到，亦被稱之為「無聲殺手」，由於早期沒有典型的臨床症狀，所以常常不能引起醫患足夠的重視，以致許多患者只能無奈的面對從病痛到恢復的漫漫長路。
診斷骨質疏鬆症，首先必須進行骨密度的測定。骨密度實際上就是表示骨的健康程度，或是反過來說表示骨的老化程度。常用的檢測手段：
x線攝片法：使用歷史最早，但由於有放射性，其測驗結果不能量化，已逐漸被取代。
單光子測定儀：費用低、方便、輻射量小而安全。但因不能測軀幹骨以及不能區別皮質骨、松質骨、軟組織等而受限制，已逐漸被取代。
定量超聲法：低廉、方便、又無放射性損傷。適合各年齡段人群的骨狀態普查工作。不僅能檢測骨密度，還能了解骨的質量即可反應骨的微結構及彈性。但目前只用於跟骨、脛骨和指骨，不能進行全身骨骼的檢測。
雙能x線吸收法：是目前最理想的測定法，是診斷骨質疏鬆症的金標準，國內外通用，可測全身各部位骨骼，也能測軟組織厚度，但該設備數量較少且價格昂貴，因此對於骨質疏鬆症患者的診斷來說經濟負擔大。為此尋找一種敏感性高、準確度高且價格合理的診斷骨質疏鬆症的方法是亟待解決的問題。
近年來，遺傳因素已經成為了骨生物學中最活躍的研究領域之一，很多基因已經被確定為調節古骨密度的候選基因。這些候選基因大多數都是影響骨代謝的基因。如維生素d受體(vdr)、脂蛋白受體相關基因5(lrp5)、i型膠原蛋白(colia1)、雌激素受體α、轉化生長因子tgfβ1、骨形態發生蛋白(bmps)、runx2、osterix(osx)、sclerostin、tcirg1、igf-1、il-1(骨質疏鬆症，張弛，中國骨質疏鬆雜誌，2010年10月，802-813)。此外，已經有相當數量的專利申請涉及骨質疏鬆症的基因診斷，如申請號為：201610272604.0、201610922798.4、201510628024.6、201510628081.4、201510725408.x、201510628042.4、201610530383.2、201510629348.1、201510627056.4、201510627060.0、201610555353.7的專利。可見利用基因來診斷骨質疏鬆症成為了今後骨質疏鬆症早期診斷的發展趨勢。
技術實現要素：
本發明首次發現dhrs12(dehydrogenase/reductase12)基因在絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者的血液中的含量比正常人低很多，dhrs12基因的差異表達可作為診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的一種方法，據此可以開發診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的工具。
具體的，本發明提供了檢測dhrs12基因表達的產品在製備診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的工具中的應用。
進一步，上面所提到的檢測產品包括：通過rt-pcr、實時定量pcr、免疫檢測、原位雜交、晶片或高通量測序平臺檢測dhrs12基因的表達水平以診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的產品。
進一步，所述用rt-pcr診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的產品至少包括一對特異擴增dhrs12基因的引物；所述用實時定量pcr診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的產品至少包括一對特異擴增dhrs12基因的引物；所述用免疫檢測診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的產品包括：與dhrs12蛋白特異性結合的抗體；所述用原位雜交診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的產品包括：與dhrs12基因的核酸序列雜交的探針；所述用晶片診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的產品包括：蛋白晶片和基因晶片；其中，蛋白晶片包括與dhrs12蛋白特異性結合的抗體，基因晶片包括與dhrs12基因的核酸序列雜交的探針。
在本發明的具體實施方案中，所述用實時定量pcr診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的產品至少包括一對特異擴增dhrs12基因的引物的序列如seqidno.3和seqidno.4所示。
優選地，所述診斷工具包括晶片、試劑盒、試紙或高通量測序平臺。其中，高通量測序平臺是一種特殊的診斷工具，檢測dhrs12基因表達的產品可以應用於該平臺實現對dhrs12基因的表達情況的檢測。隨著高通量測序技術的發展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知dhrs12基因的異常與絕經後婦女原發性骨質疏鬆症相關也屬於dhrs12基因的用途，同樣在本發明的保護範圍之內。
本發明還提供了一種診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的工具，所述產品包括晶片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。
其中，所述晶片包括基因晶片、蛋白質晶片；所述基因晶片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用於檢測dhrs12基因轉錄水平的針對dhrs12基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質晶片包括固相載體以及固定在固相載體的dhrs12蛋白的特異性抗體；所述基因晶片可用於檢測包括dhrs12基因在內的多個基因(例如，與絕經後婦女原發性骨質疏鬆症相關的多個基因)的表達水平。所述蛋白質晶片可用於檢測包括dhrs12蛋白在內的多個蛋白質(例如與絕經後婦女原發性骨質疏鬆症相關的多個蛋白質)的表達水平。通過將多個與絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的標誌物同時檢測，可大大提高絕經後婦女原發性骨質疏鬆症診斷的準確率。
其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用於檢測dhrs12基因轉錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括dhrs12蛋白的特異性抗體。進一步，所述試劑包括使用rt-pcr、實時定量pcr、免疫檢測、原位雜交或晶片方法檢測dhrs12基因表達水平過程中所需的試劑。優選度，所述試劑包括針對dhrs12基因的引物和/或探針。根據dhrs12基因的核苷酸序列信息容易設計出可以用於檢測dhrs12基因表達水平的引物和探針。
所述高通量測序平臺包括檢測dhrs12基因表達水平的試劑。
所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測dhrs12基因的轉錄水平。
與dhrs12基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個鹼基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個鹼基對或更長，甚至整個基因。由於不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個鹼基對，最長一般不超過30個鹼基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個鹼基對最佳。所述探針自身互補序列最好少於4個鹼基對，以免影響雜交效率。
進一步，所述dhrs12蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述dhrs12蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scfv、fab、f(ab』)2、fv等。只要所述片段能夠保留與dhrs12蛋白的結合能力即可。用於蛋白質水平的抗體的製備時本領域技術人員公知的，並且本發明可以使用任何方法來製備所述抗體。
在本發明的具體實施方案中，所述針對dhrs12基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物如seqidno.4所示。
用於診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的dhrs12基因及其表達產物的來源包括但不限於血液、組織液、尿液、唾液、脊髓液等可以獲得基因組dna的體液。在本發明的具體實施方案中，用於診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的dhrs12基因及其表達產物的來源是血液。在發明的具體實施方案中，血液是取自絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者和正常骨密度女性的血液。
本發明的dhrs12基因的具體序列可在國際公共核酸序列資料庫genebank中查詢到。
本發明的dhrs12基因的編碼序列包括以下任一一種dna分子：
(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；
(2)在嚴格條件下與1)限定的dna序列雜交且編碼相同功能蛋白質的dna序列；
(3)與(1)或(2)限定的dna序列具有70％、優選地，90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的dna分子。
在本發明的具體實施方案中，所述dhrs12基因的編碼序列是seqidno.1所示的dna序列。
在本發明的上下文中，dhrs12基因表達產物包括dhrs12蛋白以及dhrs12蛋白的部分肽。所述dhrs12蛋白的部分肽含有與絕經後婦女原發性骨質疏鬆症相關的功能域。
「dhrs12蛋白」包括dhrs12蛋白以及dhrs12蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括dhrs12蛋白保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與dhrs12的dna雜交的dna所編碼的蛋白質。
優選地，dhrs12蛋白是具有下列胺基酸序列的蛋白質：
(1)由序列表中seqidno.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；
(2)將seqidno.2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與seqidno.2所示的胺基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的胺基酸序列衍生的蛋白質。取代、缺失或者添加的胺基酸的個數通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
(3)與seqidno.2所示的胺基酸序列具有至少80％同源性(又稱為序列同一性)，更優選地，與seqidno.2所示的胺基酸序列至少約90％至95％的同源性，常為96％、97％、98％、99％同源性的胺基酸序列構成的多肽。
在本發明的具體實施方案中，所述dhrs12蛋白是具有seqidno.2所示的胺基酸序列的蛋白質。
通常，已知的是，一個蛋白質中一個或多個胺基酸的修飾不會影響蛋白質的功能。本領域技術人員會認可改變單個胺基酸或小百分比的胺基酸或對胺基酸序列的個別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質的改變產生具有相似功能的蛋白質。提供功能相似的胺基酸的保守替換表是本領域公知的。
通過添加一個胺基酸或多個胺基酸殘基修飾的蛋白質的例子是dhrs12蛋白的融合蛋白。對於與dhrs12蛋白融合的肽或者蛋白質沒有限制，只要所得的融合蛋白保留dhrs12蛋白的生物學活性即可。
本發明的dhrs12蛋白也包括對seqidno.2所示的胺基酸序列的非保守修飾，只要經過修飾的蛋白質仍然能夠保留dhrs12蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質中突變的胺基酸數目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
在本發明的上下文中，「診斷絕經後婦女原發性骨質疏鬆症」既包括判斷絕經後婦女是否已經患有原發性骨質疏鬆症、也包括判斷絕經後婦女是否存在患有原發性骨質疏鬆症的風險，還包括預測絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者的預後，還包括判斷患有原發性骨質疏鬆症的絕經後婦女在經過治療後是否已經復發。
附圖說明
圖1顯示利用qpcr檢測dhrs12基因在絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者和正常絕經女性中的表達差異；
圖2顯示利用測序檢測dhrs12基因在絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者和正常絕經女性中的表達差異。
具體的實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1篩選絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者和正常絕經女性中差異表達的基因
1、研究對象：
選擇絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者3例，年齡分別為81歲、68歲、79歲；正常絕經女性2例，年齡分別為67歲、68歲。
絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者的納入標準：絕經超過12個月的漢族絕經後婦女，患者均知情同意；
絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者的排除標準包括①既往接受過抗骨吸收藥物(包括降鈣素、雙磷酸鹽、雌激素等)或促骨形成藥物(如甲狀旁腺素等)治療者(單純使用鈣劑和/或維生素d者除外)；②長期服用糖皮質激素者；③合併有惡性腫瘤、骨轉移腫瘤和其他內分泌、骨代謝病史(如類風溼性關節炎、甲亢、腎上腺疾病等)者；④脊柱或髖部等部位新鮮骨折或髖關節手術置換者；⑤嚴重肝腎疾病、長期臥床≧3個月者；⑥精神障礙、認知障礙。
2、血液總rna提取
使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進行血液總rna的提取。
基本步驟：
(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；
(2)加入氯仿幫助有機相和水相分層；
(3)異丙醇沉澱rna；
(4)漂洗rna沉澱；
(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉澱。
3、rna樣品的質量分析
利用nanodrop2000對所提rna的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。單次建庫要求rna總量5μg，濃度≥200ng/μl，od260/280介於1.8～2.2之間。
5、片段化rna
illumina平臺是針對短序列片段進行測序，mrna平均長度可能達幾kb，因此需要對其進行隨機打斷。利用金屬離子，可以將rna隨機斷裂成200bp左右的小片段。
6、反轉合成cdna
在逆轉錄酶的作用下，利用隨機引物，以mrna為模板反轉合成一鏈cdna，進行二鏈合成時，dntps試劑中用dutp代替dttp，使cdna第二鏈中鹼基包含a/u/c/g。
7、連接adaptor
雙鏈的cdna結構為粘性末端，加入endrepairmix將其補成平末端，隨後在3』末端加上一個a鹼基，用於連接y字形的接頭。
8、ung酶消化cdna二鏈
在pcr擴增前，用ung酶將cdna第二鏈消化，從而使文庫中僅包含cdna第一鏈。
9、illuminax-ten上機測序
illuminax-ten測序平臺，進行2*150bp測序。
10、生物信息學分析
測序數據獲得以後的rawdata分析過程如下所示：
(1)用cutadapt對reads的5』和3』段進行trim，trim掉質量<20的鹼基，並且刪掉n大於10％的reads；
(2)tophat比對到參考基因組上。所用的參考基因組版本為grch38.p7，fasta和gff文件下載自ncbi；
(3)cuffquant定量mrna的表達量並標準化輸出；
(4)在r環境下用degseq包比較對照組跟疾病組mrna的表達差異。顯著差異mrna篩選條件：p-value<0.05。
11、結果
rna-seq結果顯示(如圖2所示)，與正常絕經女性相比，絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者血液中dhrs12基因的mrna水平顯著下降，差異具有統計學意義(p<0.05)。
實施例2qpcr實驗驗證絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者和正常絕經女性中差異表達的基因
1、研究對象：
選擇絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者30例，正常絕經女性30例，年齡在65-82歲之間。
絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者的納入標準：絕經超過12個月的漢族絕經後婦女，患者均知情同意；
絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者的排除標準包括①既往接受過抗骨吸收藥物(包括降鈣素、雙磷酸鹽、雌激素等)或促骨形成藥物(如甲狀旁腺素等)治療者(單純使用鈣劑和/或維生素d者除外)；②長期服用糖皮質激素者；③合併有惡性腫瘤、骨轉移腫瘤和其他內分泌、骨代謝病史(如類風溼性關節炎、甲亢、腎上腺疾病等)者；④脊柱或髖部等部位新鮮骨折或髖關節手術置換者；⑤嚴重肝腎疾病、長期臥床≧3個月者；⑥精神障礙、認知障礙。
2、血液總rna提取
使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進行血液總rna的提取。
基本步驟：
(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；
(2)加入氯仿幫助有機相和水相分層；
(3)異丙醇沉澱rna；
(4)漂洗rna沉澱；
(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉澱。
3、逆轉錄
用逆轉錄緩衝液對lμg總rna進行逆轉錄合成cdna。採用25μl反應體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉錄緩衝液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。
4、qpcr
採用25μl反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重複三次以上以保證結果的可靠性。
配製以下反應體系：sybrgreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。
引物序列如下：
擴增dhrs12基因的正向引物序列為5』-cagtccgaaagaacaccat-3』(seqidno.3)，反向引物序列為5』-ctccgtcagaaccacttg-3』(seqidno.4)；
擴增gapdh基因的正向引物序列為5』-tttaactctggtaaagtggatat-3』(seqidno.5)，反向引物序列為5』-ggtggaatcatattggaaca-3』(seqidno.6)。
擴增程序：95℃5min，(95℃10s，60℃60s)*45個循環。以sybr
green作為螢光標記物，在lightcycler螢光實時定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。
5、結果
結果如圖1所示，與正常絕經女性相比，絕經後婦女原發性骨質疏鬆症患者血液中dhrs12基因的mrna水平顯著下降，差異具有統計學意義(p<0.05)，結果同rna-seq實驗。
上述實施例的說明只是用於理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護範圍內。
sequencelisting
首都醫科大學附屬北京友誼醫院
絕經後婦女原發性骨質疏鬆症的診斷工具
6
patentinversion3.5
1
816
dna
人源
1
atgaatctgcatgtaaagactttgtccctcatgacttggaggtccagattcctggaagag60
tctttttggtcactggaggaaacagcggcattggcaaagcaactgcccttgaaatcgcca120
agcgagaacatttttctgcacattgtggacttgtctgatcccaagcaaatctggaaattt180
gttgaaaatttcaagcaggaacataaactccatgttctgatcaataatgcaggttgcatg240
gtcaataaaagagagctcacagaagatggacttgaaaaaaactttgctgccaatactctg300
ggtgtgtacattctcacgaccggcctgatccctgtgctggagaaagaacacgacccccga360
gtgataaccgtctcctcaggaggaatgttggttcagaaactgaacaccaatgatctccag420
tccgaaagaacaccatttgatggaactatggtctatgcacaaaacaagaggcagcaagtg480
gttctgacggagcggtgggcccaagggcacccggccatccatttttcttccatgcatcct540
ggctgggccgacaccccagacaggaatgagcaggagctgaggaaggtagtgggagaggcc600
cagactgcctcaccactccccaggtttttggaaataatgatgcatgaaggtaaatgccag660
ccacaaggacacagctcgaatgatctggaagcgtgttggagcagcggtggaggggagcag720
aattctcttccggattggcctcaccaactccatgacctcaggcagctcacctgggctctc780
tgcagctctttcctcctctacaaacaagggaactga816
2
271
prt
人源
2
metasnleuhisvallysthrleuserleumetthrtrpargserarg
151015
pheleuglugluserphetrpserleuglugluthralaalaleuala
202530
lysglnleuproleulysserprosergluasnilepheleuhisile
354045
valaspleuseraspprolysglniletrplysphevalgluasnphe
505560
lysglngluhislysleuhisvalleuileasnasnalaglycysmet
65707580
valasnlysarggluleuthrgluaspglyleuglulysasnpheala
859095
alaasnthrleuglyvaltyrileleuthrthrglyleuileproval
100105110
leuglulysgluhisaspproargvalilethrvalserserglygly
115120125
metleuvalglnlysleuasnthrasnaspleuglnsergluargthr
130135140
propheaspglythrmetvaltyralaglnasnlysargglnglnval
145150155160
valleuthrgluargtrpalaglnglyhisproalailehispheser
165170175
sermethisproglytrpalaaspthrproaspargasngluglnglu
180185190
leuarglysvalvalglyglualaglnthralaserproleuproarg
195200205
pheleugluilemetmethisgluglylyscysglnproglnglyhis
210215220
serserasnaspleuglualacystrpserserglyglyglyglugln
225230235240
asnserleuproasptrpprohisglnleuhisaspleuargglnleu
245250255
thrtrpalaleucysserserpheleuleutyrlysglnglyasn
260265270
3
19
dna
人工序列
3
cagtccgaaagaacaccat19
4
18
dna
人工序列
4
ctccgtcagaaccacttg18
5
23
dna
人工序列
5
tttaactctggtaaagtggatat23
6
20
dna
人工序列
6
ggtggaatcatattggaaca20