篩選防治動脈粥樣硬化藥物的方法
2023-06-02 15:39:11 4
專利名稱：篩選防治動脈粥樣硬化藥物的方法
技術領域：
本發明涉及到基於細胞生物學篩選藥物的方法，尤其涉及到篩選防治動脈粥樣硬化藥物的方法。
動脈粥樣硬化相關性疾病冠心病和腦中風仍然是目前死亡率最高的疾病之一。對動脈粥樣硬化機理的深入研究近年來一直是一項國際前沿學科。
一般認為，動脈粥樣化損傷形成的一個最早期過程是來源於血液的單核細胞變成巨噬細胞後在內皮下膜處聚集，然後發展成為含脂質的泡沫細胞。低密度脂蛋白(LDL)經氧化修飾而成的氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)可以誘導多個細胞功能的變化，該變化可能參與到動脈粥樣化的形成。在這個動脈粥樣硬化的早期階段，oxLDL可導致血管細胞的增殖、遷移，並能阻礙內皮細胞的再生，且其本身就是一種單核細胞和T淋巴細胞的強烈趨化物。oxLDL可以促進幾乎所有的動脈血管細胞中的粘附分子、細胞因子、趨化因子、熱休克蛋白和共凝蛋白的表達，並可以抑制內皮細胞來源的舒血管因子、一氧化氮和前列環素的產生，還可誘導出多種促炎症細胞因子和生長因子。最近有些證據表明oxLDL的主要磷脂成分溶血卵磷脂(LPC)有與oxLDL類似的多種生物活性，如可調節血管舒張、蛋白激酶C、巨噬細胞分化、一氧化氮合酶、核因子κB、細胞因子、生長因子和粘附分子等。LDL中的磷脂醯膽鹼(PC)經過氧化修飾轉化成LPC，並通過激活炎症部位的磷脂酶A2而產生。LPC在動脈粥樣硬化或炎症形成過程中逐漸積累，其動脈壁中的濃度也隨之增加。LPC也是單核細胞和T淋巴細胞的一種強有力的趨化因子，但其趨化作用的分子機理仍在研究之中。
普遍認為oxLDL直接作用於細胞表面的清除受體而非LDL受體。oxLDL和清除受體相互作用時可導致細胞吸收oxLDL(包含有LPC)。最近有證據證明在巨噬細胞中的oxLDL能誘導細胞內鈣離子濃度迅速和短暫的增加，並能抑制核因子κB的激活，此兩種作用都對百日咳毒素(PTX)特別敏感，這個結果提示oxLDL也可能是通過G蛋白所介導的信號途徑來發揮作用的。在HL-60細胞中LPC也是通過PTX敏感的G蛋白來刺激磷脂酶C(PLC)。但至今LPC的特異性細胞膜受體仍未被發現。
細胞信號轉導則是目前國際上一大研究熱點。研究表明有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)具有許多重要的細胞學功能，如促細胞增值、分化、凋亡等等。MAPK是一種由多種胞外刺激細胞反應而產生重要功能的絲氨酸-蘇氨酸激酶，它包括以下四種亞家族(New L.et al.,Trends CardiovascMed.1998；8:220-229；Sugden PH.et al.,Circ Res.1998；83:345-352):胞外信號調節激酶(ERK1/2也稱P42/44MAPK)、應激激活蛋白激酶(JNK/SAPK)、BMK和最近發現的p38MAPK等亞家族。P42/44MAPK是被多種生長因子特異激活，並和細胞增殖和生長有關。p38MAPK亞家族至少包括四個成員，在刺激反應和炎症周圍被強烈激活。p38MAPK一系列的激活反應能誘發血管內皮細胞生長因子(VEGF)所導向的內皮細胞的遷移，而這種遷移在動脈粥樣硬化形成中起著重要的作用(Rousseau S.et al.,Oncogene.1997；15(18):269-277)。以前的研究顯示oxLDL在平滑肌細胞和巨噬細胞中激活P42/44MAPK(Kusuhara M.et al.,Arterioscler ThrombVasc Biol.1997；17:141-148；Deigner HP.et al.,FEBS Lett.1996；385:149-153)和p38MAPK(Jing Q.et al.,Circ Res.1998；84:831-839)。LPC也能激活P42/44MAPK(Yamakawa T.et al.,Hypertension.1998；31:248-253)和JNK(Fang X.et al.,J Biol Chem.1997；272:13683)，但LPC在單核細胞中能否激活p38MAPK仍不清楚。所以，本研究主要探討oxLDL和LPC對p38MAPK的影響、其可能的信號途徑和潛在的生化關係，從而尋找防治動脈粥樣硬化的新方法。
本發明的目的是提供一種篩選防治動脈粥樣硬化藥物的方法。它是通過對oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和激活及THP-1單核細胞的趨化作用進行測定分析，篩選防治動脈粥樣硬化的藥物，以利於尋找療效好的防治動脈粥樣硬化的藥物。
本發明篩選防治動脈粥樣硬化藥物的方法是採用Western-雜交分析、免疫沉澱和激酶測定以及Transwell趨化分析等測定技術，通過對oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化和激活及THP-1單核細胞的趨化作用，抑制p38MAPK後oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化和及THP-1單核細胞的趨化作用分析，找到一種篩選防治動脈粥樣硬化藥物的方法，它包括下列步驟(A)THP-1單核細胞培養THP-1單核細胞按常用的方法培養。
(B)脂蛋白分離和氧化LDL通過連續超離心從新鮮人血漿中分離得到。得到的LDL通過用Bradford蛋白試劑盒定量測定其蛋白含量。然後用二價銅離子孵育緩慢氧化成oxLDL。實驗表明加入二價銅離子對p38MAPK磷酸化沒有影響。
(C)測定藥物對oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化的抑制程度，並與已知特異性抑制劑作對照，其具體步驟以下面的實驗為基礎1、用oxLDL和LPC刺激THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化和激活首先，於兩組THP-1單核細胞中分別加入抗雙重磷酸化的p38MAPK抗體和識別磷酸化與沒有磷酸化的p38MAPK抗體(總的p38MAPK抗體)，然後每一組分別加入空白對照品、oxLDL、LDL、LPC、PC、膽固醇、25羥基膽固醇、氧化白蛋白刺激THP-1細胞，採用Western-雜交分析測定p38磷酸化的程度。由圖1可以看出，加入總的p38MAPK抗體的THP-1單核細胞被以上試劑刺激後強烈地引起p38MAPK磷酸化，且用總的p38MAPK抗體檢驗同一樣品的結果表明，用以上試劑短時處理THP-1單核細胞後不改變總的p38MAPK的量。而加入抗雙重磷酸化的p38MAPK抗體的THP-1單核細胞被以上試劑刺激後，只有oxLDL和LPC對p38MAPK磷酸化有強烈刺激作用，而其它如LDL、PC、膽固醇、25羥基膽固醇、氧化白蛋白都幾乎無刺激作用。對比之下，表明oxLDL和LPC能強烈刺激THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化。另外，LPC刺激p38MAPK磷酸化的程度隨LPC濃度和時間的不同而發生變化，由圖2可以看出，p38MAPK磷酸化的反應速度隨著LPC濃度的增加而增加，給予25微克/毫升濃度刺激5分鐘達到最大反應，給予2.5微克/毫升濃度刺激5分鐘達到1/2最大反應；由圖3可以看出，用同一濃度(25微克/毫升)的LPC刺激THP-1單核細胞，1分種時引起明顯的p38MAPK磷酸化，在5分鐘時達到最大的p38MAPK磷酸化刺激作用，30-60分鐘之後，p38MAPK磷酸化慢慢減弱。
在無血清培養基中分別用oxLDL和LPC刺激THP-1單核細胞，在裂解緩衝液中裂解，裂解細胞用總的p38MAPK抗體溫育，p38MAPK激活在免疫沉澱中用p38MAPK分析試劑盒測定，通過Western-雜交分析測量p38MAPK介導的重組體活化轉錄因子-2(ATF-2)融合蛋白的磷酸化標記物來確定。由圖4可以看出，oxLDL和LPC對p38MAPK激活有明顯的刺激作用。
2、用G蛋白的阻斷劑百日咳毒素(PTX)抑制oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化用G蛋白的一種阻斷劑PTX處理THP-1單核細胞，然後用oxLDL和LPC刺激THP-1單核細胞，用Western-雜交分析測定oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化。由圖5、6可以看出，PTX處理細胞後明顯抑制oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化。
測定藥物對oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化的抑制程度時，按照上述方法，並用PTX作陽性對照做實驗，測定藥物是否有與陽性對照物類似的功效。
(D)測定藥物減弱oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞趨化作用程度，並與已知特異性抑制劑作對照，其具體步驟以下面的實驗為基礎抑制p38MAPK減弱oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞趨化作用用oxLDL、LDL、LPC、PC分別處理THP-1單核細胞，用Transwell細胞趨化性分析方法測定，由圖7、8可以看出，oxLDL和LPC對THP-1單核細胞有明顯的趨化作用，且其趨化細胞的數量與oxLDL和LPC的濃度的大小有關，而LDL和PC卻無此效果。進一步測定oxLDL和LPC激發的p38MAPK激活和趨化作用的潛在關係，p38MAPK的特異性抑制劑SB203580處理THP-1細胞，用Transwell細胞趨化性分析方法進行測定，由圖9可以看出，用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580處理THP-1單核細胞後，大大抑制了oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞趨化作用。進一步用體外p38MAPK分析試劑盒進行實驗，SB203580能阻斷p38MAPK激活，也能抑制oxLDL和LPC介導的趨化作用，其作用強度與濃度有關。
測定藥物減弱oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞趨化作用的程度時，按照上述方法，並用SB203580作陽性對照做實驗，測定藥物是否有與陽性對照物類似的功效。
因此，用以上實驗篩選樣品時，首先用樣品的合適溶劑配1至3個常規濃度的樣品溶液，作THP-1單核細胞毒性實驗與對THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和THP-1單核細胞趨化作用的影響實驗，如樣品液對THP-1單核細胞沒有毒性作用，也不直接引起THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和THP-1單核細胞趨化作用，就可按下列步驟進行實驗THP-1單核細胞培養；脂蛋白分離和氧化；測定藥物對oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和激活的抑制程度，並與空白液、PTX作對照；測定藥物減弱oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞趨化作用的程度，並與空白液、SB203580作對照。如果藥物通過以上步驟實驗與陽性對照物比較，對THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化或THP-1單核細胞趨化性作用有相似的功效，就可以作為防治動脈粥樣硬化藥物。
本發明篩選治療動脈粥樣硬化藥物的方法的優點是採用Western-雜交分析、免疫沉澱和激酶分析以及Transwell趨化分析等實驗室常用測定技術，對oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和激活及THP-1單核細胞趨化作用進行測定分析，能簡便、有效地篩選防治動脈粥樣硬化的藥物，以利於臨床用藥。
本發明
如下圖1各種試劑引起的THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化比較1空白對照 2oxLDL 3LDL 4LPC5PC6膽固醇 725-羥基膽固醇8氧化白蛋白圖2THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化與LPC濃度的關係3THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化與LPC刺激時間的關係4oxLDL/LPC引起的THP-1細胞的p38MAPK激活1空白對照 2oxLDL3LPC圖5PTX對LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化的影響1空白對照 2LPC 3PTX+LPC圖6PTX對oxLDL介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化的影響1空白對照2oxLDL 3PTX+oxLDL圖7oxLDL、LDL濃度與其介導的THP-1單核細胞趨化作用的關係8LPC、PC濃度與其介導的THP-1單核細胞趨化作用的關係9SB203580抑制THP-1單核細胞後對oxLDL、LPC介導的THP-1單核細胞趨化作用的影響1: 空白對照， 空白對照+SB203580 2 oxLDL， oxLDL+SB2035803: LPC， LPC+SB203580圖10樣品A與PTX對oxLDL、LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化的比較圖1: 空白對照2 oxLDL， LPC3: oxLDL+PTX， LPC+PTX 4 oxLDL+樣品A， LPC+樣品A圖11樣品A與SB203580對oxLDL、LPC介導的THP-1單核細胞趨化作用的比較圖1 空白對照 2 oxLDL， LPC3: oxLDL+SB203580， LPC+SB2035804: oxLDL+樣品A， LPC+樣品A注圖5-圖11中*、#表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
本發明通過以下的實施例作進一步闡述，但並不限制本發明的範圍。
下列實施例中所用試劑RPMI1640、牛胎血清、HRP購自GIBCO-BRL(Gaithersburg,MD)。抗雙重磷酸化p38MAPK抗體，總的p38MAPK抗體，p38MAPK分析試劑盒購自New England Biolabs Inc.(Beverly,MA)。硝酸化纖維素膜、增強化學發光系統(ECL)購自Amersham PharmaciaBiotech(Buckinghamshire,England)。SB203580 購自 CalbiochemInc.(La Jolla,CA)。LPC、PC和其它試劑購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。
實施例1 THP-1單核細胞培養THP-1單核細胞(來源於American Type Culture Collection,Rcok)，於加入1％熱滅活牛胎血清、100個單位/毫升青黴素、100毫克/毫升鏈黴素和2毫摩爾/升穀氨醯胺的RPMI1640培養基中，在溫度37℃、含5％CO2 95％空氣的溼空氣中培養。
實施例2 脂蛋白分離和氧化LDL(密度1.019-1.063克/毫升)通過連續超離心從新鮮人血漿中分離得到。得到的LDL在4℃ 0.15毫摩爾/升氯化鈉和0.01％EDTA溶液中滲析，並通過用Brodford蛋白試劑盒定量測定每一份蛋白含量，去掉EDTA後，LDL被二價銅離子的孵育緩慢氧化(5微摩爾/升硫酸銅，20小時，37℃)，通過滲析去掉二價銅離子。實驗表明載體加入二價銅離子MAPK磷酸化沒有影響。氧化修飾的程度通過在PH8.6的巴比妥緩衝液的瓊脂糖凝膠上測量巴比妥酸反應物質(TBARS)和電泳遷移率評價。得到的oxLDL相當於25納摩爾/毫克TBARS蛋白，由於LDL顯示沒有發現TBARS，在瓊脂糖凝膠中oxLDL的電泳遷移比LDL快2-3倍。氧化白蛋白按以前描述配製來作為一種對照品(Jing Q.et al.,Circ Res.1999；84:831-839.)。
實施例3不同試劑對THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化比較實驗於各組106個THP-1單核細胞中分別加入0.5ul抗雙重磷酸化的p38MAPK抗體和0.5ul總的p38MAPK抗體，然後分別加入空白對照品、oxLDL(50ug/ml)、LPC(25ug/ml)、PC(25ug/ml)、膽固醇(25ug/ml)、25羥基膽固醇(25ug/ml)、氧化白蛋白(100ug/ml)各1ml在37℃刺激THP-1單核細胞5分鐘，用下面的Western-雜交分析方法測定THP-1單核細胞p38MAPK的磷酸化。
Western-雜交分析方法細胞培養的密度為106/毫升，生長培養基中加RPMI1640，附加0.1％血清發作24小時，在無血清培養基中37℃對各種試劑進行處理。細胞於SDC加樣緩衝液包括62.5毫摩爾/升蘇氨酸、PH6.8、2％SDS、10％甘油中裂解。等份細胞裂解後用於測定蛋白，樣品在95℃加熱5分鐘並在4℃時離心(13000轉，5分鐘)，上清液用10％SDS-PAGE分析，蛋白變構為硝化纖維素黏膜，黏膜被5％脫脂奶粉在TBST(20毫摩爾/升三氯甲烷，PH8.0，150毫摩爾/升氯化鈉，和0.1％吐溫-20)中阻斷，黏膜被重要的抗體雜交(抗雙重磷酸化的p38MAPK抗體和總的p38MAPK抗體)。辣根過氧化物酶偶連抗體(HRP)根據廠商指導的ECL方法發現。蛋白分子重量測定由預染標準參照物確定。重複免疫印跡法，在62.5毫摩爾/升蘇氨酸、PH6.7。2％SDS和0.1摩爾/升2-巰基乙醇50℃時放置30分鐘使黏膜畫上條紋。結果見圖1。
實施例4不同濃度LPC對THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化的影響於各組106個THP-1單核細胞中加入0.5ul抗雙重磷酸化的p38MAPK抗體，然後分別加入1ml不同濃度的LPC(0.0、1.0、2.5、10.0、25.0ug/ml)，在37℃刺激THP-1細胞5分鐘，同實施例3中用Western-雜交分析方法測定THP-1單核細胞p38MAPK的磷酸化。結果見圖2。
實施例5不同LPC刺激時間對THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化的影響於各組106個THP-1單核細胞中加入0.5ul磷酸化的p38MAPK抗體，然後加入同一濃度LPC(25ug/ml)1ml在37℃刺激THP1細胞，對LPC快速照射1分鐘發生對p38MAP磷酸化重要的刺激作用，同實施例3中用Western-雜交分析方法測定THP-1單核細胞p38MAPK的磷酸化。通過三個獨立實驗的結果，採用均值±SD(標準差)處理數據，用t-檢驗進行統計。結果見圖3。
實施例6 PTX對oxLDL、LPC介導的THP-1單核細胞的p38MAPK磷酸化的影響於各組106個THP-1單核細胞中分別加入空白對照品、PTX(100ng/ml，24小時)1ml處理細胞，然後分別用1ml oxLDL(50ug/ml)、1ml LPC(25ug/ml)在37℃刺激THP-1細胞5分鐘，採用實施例3中Western-雜交分析方法測定THP-1單核細胞p38MAPK的磷酸化。結果見圖5、6。
實施例7 免疫沉澱和激酶測定對p38MAPK激活分析採用免疫沉澱和激酶測定方法進行測定，其具體操作如下在無血清培養基中用1mloxLDL刺激106個THP-1單核細胞在裂解緩衝液中裂解，對p38MAPK激活分析。在裂解細胞中加入總的p38MAPK抗體(1∶100稀釋)在4℃溫育過夜，然後在葡聚糖A凝膠玻珠中4℃放置2小時並輕度振蕩，玻珠用裂解緩衝液洗4次，用激酶緩衝液洗2次，p38MAPK激活在免疫沉澱中用p38MAPK分析試劑盒測定。通過實施例3中Western-雜交分析用磷酸化活化轉錄因子-2(ATF-2)抗體檢測p38MAPK介導的重組體ATF-2融合蛋白的磷酸化標記物來確定。結果見圖4。
實施例8不同濃度的oxLDL、LDL、LPC、PC對THP-1單核細胞的趨化作用實驗用不同濃度的oxLDL、LDL、LPC、PC(濃度見圖7、8)各600ul分別在37℃刺激THP-1單核細胞(106個/100ml)5分鐘，用下面的Transwell細胞趨化性分析方法測定THP-1單核細胞的趨化作用。Transwell細胞趨化性分析方法趨化分析用Transwell細胞趨化性分析方法，細胞於RPMI1640中加0.1％BSA在37C5％CO2隔夜放置，oxLDL、LPC或趨化試劑各600微升加於24孔容積為600微升的組織培養板上，Transwell(直徑5毫米，孔徑5微米)每100微升容積加入106個細胞於Traswell頂層37℃溫育1小時。細胞經過黏膜底層時被收集並用顯微鏡計數。在Transwell細胞趨化分析中，用臺盼藍(trypan blue)排除法和乳酸脫氫酶洩漏法測定發現，用SB203580不能觀測到顯著的細胞的毒性。通過三個獨立實驗的結果，用均值±SD統計，用t-檢驗對分析結果進行處理。結果見圖7、8。
實施例9p38MAPK的特異性抑制劑SB203580對oxLDL、LPC介導的THP-1單核細胞的趨化作用的影響用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580(5μmol/L)600μl處理THP-1單核細胞15分鐘，然後分別加入空白對照品、oxLDL(50ug/ml)、LPC(25ug/ml)各600ul在37℃刺激THP-1單核細胞5分鐘，用實施例8中Transwell細胞趨化性分析方法測定THP-1單核細胞的趨化作用。結果見圖9。
實施例10 篩選樣品A的實驗首先，取樣品A 1mg，用雙蒸水配成濃度為100ug/ml、10ug/ml、lug/ml的樣品溶液，用MTT法作THP-1單核細胞毒性實驗(Mosmann.T.J ImmonolMethods.1983；65:55-63)，與對THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和THP-1單核細胞趨化作用的影響實驗(同實施例3、8)，從實驗結果得知濃度為10ug/ml樣品液對THP-1單核細胞沒有毒性作用，也不直接引起THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和THP-1單核細胞趨化作用。取10ug/ml樣品液按下列步驟進行實驗THP-1單核細胞培養(方法同實施例1)，脂蛋白分離和氧化(方法同實施例2)，測定藥物對oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和激活的抑制程度(方法同實施例3、6、7)，並用空白液、PTX作對照(結果見圖10)，測定藥物減弱oxLDL和LPC介導的THP-1單核細胞趨化作用的程度(方法同實施例8、9)，並用空白液、SB203580作對照(結果見圖11)。從實驗結果得知，樣品A與陽性對照物有類似的功效，該樣品A可作為防治動脈粥樣硬化的藥物。
權利要求
1.一種篩選防治動脈粥樣硬化的藥物的方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(A)THP-1單核細胞的培養；(B)脂蛋白分離和氧化；(C)測定藥物對氧化型低密度脂蛋白和溶血卵磷脂介導的THP-1單核細胞p38MAPK磷酸化和激活的抑制程度，並與已知抑制劑作對照；(D)測定藥物減弱氧化型低密度脂蛋白和溶血卵磷脂介導的THP-1單核細胞趨化作用的程度，並與已知抑制劑作對照。
全文摘要
一種篩選防治動脈粥樣硬化藥物的方法,包括THP－1單核細胞培養、脂蛋白分離和氧化、測定藥物對oxLDL和LPC介導的THP－1單核細胞p38MAPK磷酸化和激活的抑制程度,及測定藥物減弱oxLDL和LPC介導的THP－1單核細胞趨化作用的程度,並與已知特異性抑制劑作對照等步驟。能簡便、有效地篩選出防治動脈粥樣硬化的藥物。
文檔編號C12Q1/00GK1304040SQ99119810
公開日2001年7月18日 申請日期1999年10月22日 優先權日1999年10月22日
發明者裴鋼, 荊清, 程智潔, 張文波, 肖海蓮 申請人:中國科學院上海細胞生物學研究所