棉花真葉直接分化組織培養方法及其專用培養基的製作方法

2023-06-02 13:20:56 2

專利名稱：棉花真葉直接分化組織培養方法及其專用培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養領域，特別涉及一種大田棉花植株真葉組織培養方 法其專用培養基。
背景技術：
棉花組織培養中，體細胞胚發生和植株再生可分為4步外植體脫分化誘導出愈 傷組織、愈傷組織再分化為胚性愈傷組織、胚性愈傷組織培養出體細胞胚、體細胞胚萌發獲 得植株再生。從外植體脫分化生長出愈傷組織比較容易，沒見受基因型限制的報導。從愈 傷組織誘導分化出胚性愈傷組織，是棉花組織培養的瓶頸，受基因型限制的報導集中在胚 性愈傷組織的誘導階段。基因型限制，首先表現在棉屬中不同棉種的體細胞胚發生和植株再生能力不同。 研究人員通過對多個棉種進行比較發現，只有陸地棉、雷蒙德氏棉、夏威夷棉能形成體細胞 胚。董合忠和陳志賢比較了 4個棉花栽培種的體細胞胚發生能力，發現陸地棉較易誘導體 細胞胚，亞洲棉次之，海島棉和非洲棉較差(董合忠1991 ；陳志賢，李淑君.1987)。棉屬共 有50個種，包括45個野生種，4個栽培種，迄今為止僅克勞茨基棉、戴維遜氏棉、陸地棉、海 島棉、亞洲棉、草棉、雷蒙德氏棉和夏威夷棉8個種獲得了體細胞胚，其中陸地棉、海島棉、 亞洲棉、草棉和戴維遜氏棉獲得了再生植株。此外，在體細胞胚發生和植株再生能力上，各個棉花品種間也存在差異。 Trolinder對陸地棉28個品種進行了研究，結果只有珂字312和T25具有較高的體細胞胚 發生能力，而其它品種較難或不能進行體細胞胚發生(Trolinder N L5Xhixian C.)。董合 忠等根據胚性愈傷組織成胚數量和發育成植株的多少將陸地棉品種分為四類第一類是體 細胞發生能力強，易成苗的品種，如珂字312、珂字201等；第二類是具有一定的體細胞胚 發生能力，成苗數量中等，經多次繼代篩選後可得到較多的體細胞胚和部分再生植株，如岱 字15、岱字16等；第三類是體細胞胚發生能力差，畸形胚多，經長時間繼代篩選後方可得到 個別植株，如魯棉1號、7號等；第四類是體細胞胚極難或不能發生，如斯字棉215、斯字506 等。棉花種質資源豐富，目前僅珂字棉系列，中棉系列、魯棉系列等少數品種獲得了體細胞 胚和再生植株。研究表明陸地棉不同外植體類型之間在愈傷組織誘導和分化方面存在極大差異。 因此，棉花組織培養體系的改良與外植體的篩選，歷來是組織培養工作者的研究重點之一。 棉花下胚軸比子葉或葉作外植體優越(Troloinder等1988)。子葉節附近是下胚軸最易形 成愈傷組織的部分(Finerl984，張獻龍等1990)。Finer等(1984)發現用成熟棉株的莖、 葉、葉柄作外植體與用無菌苗相比，難以誘導愈傷組織。譚曉連等(1988)研究了盆栽擬似 棉的葉、葉柄和莖在離體培養中的反應，發現採用莖最容易誘導體細胞胚胎發生和植株再 生。未授粉胚珠產生的愈傷組織不如授粉胚珠(宋平，1987)。外植體的放置方向很重要， 利用下胚軸作外植體時，必須使表皮與培養基接觸，若使切口與培養基接觸，會產生生長緩 慢的紅色愈傷組織(Price等)。下胚軸最易，中胚軸和上胚軸次之，子葉較差，葉片和莖段最差，近年來研究毛根能夠再生，但難易程度缺少比較(焦改麗等，200 ；張海等Q002)報 道了棉花子葉離體培養與植株再生，但再生頻率不高。不同研究者得出的結論有一定差異，可能與不同遺傳型材料對誘導培養體系存在 較大的差異有關。而總的來說，幼嫩組織比成熟組織易誘導棉花體細胞胚胎發生(遲吉娜， 等2004)。張朝軍等建立了棉花大田葉柄組織培養體系，並利用葉柄組織培養體系選育了高 分化率材料(專利號ZL200610089439. 1)。利用大田成熟植株組織或器官作為外植體建立 組織培養體系，是棉花組織培養研究的熱點之一。目前應用於棉花愈傷組織誘導的基本培養基很多，如MS，LS, White, BT, BS, Hitsch，CM-l，SM，KM，P等，但以MS和LS應用較多。棉花不同外植體的組織培養用培養基， 主要是基於MS培養基進行改良。

發明內容
本發明的目的在於提供一種棉花葉片直接誘導胚性愈傷組織的培養基。本發明提供的棉花葉片直接誘導胚性愈傷組織的培養基，是在MSBl基本培養液 中添加如下物質得到的培養基KT、6-BA、2，4-D，IAA，碳源和凝膠劑；所述培養基中KT的終濃度是0. 005-0. 15mg/L、6-BA終濃度是0. 005-0. 15mg/L、2， 4-D 的終濃度是 0. 0001-0. 001mg/L、IAA 的終濃度是 0. 001-0. 02mg/L。上述MSBl基本培養液是將硝酸銨減半、硝酸鉀增加一半的MS培養基的無機鹽與 B5培養基的有機成分組成，其溶劑是水，溶質見表1。表1. MSBl基本培養液的溶質KNO3 NH4NO3 MgS04.7H20
KH2PO4 CaCl2.2H20 微量元素 FeS04-7H20 MnSO4H2O
Γ ZnS04.7H20
H3BO3 KI
NaMn04-2H20 CuS04.5H20 CoC1.6H20
有機成分 VB1 VB6
煙酸 肌醇
大量元素培養基中濃度(g·!/1)
2.85 0.825 0.37 0.17 0.44
培養基中濃度(mgt1) 746 16.900 8.600 6.200 0.830 0.250 0.025 0.025
培養基中濃度(mg·!/1) 10.0 1.0 1.0
_100.0_上述凝膠劑可以是瓊脂粉、卡拉膠或Gel rite等組織培養常用固化劑，優選的是 美國Sigma公司生產的Gel rite (sigma公司生產，貨號是G1910)。當然也可以是瓊脂粉， 用量是6. 5-7.0克/L，也可以是卡拉膠等組織培養常用凝膠劑，用量以2. 2g/L Gel rite能 達到的培養基硬度為基礎，適當調整用量。上述碳源可以是葡萄糖或蔗糖，胚性愈傷組織誘導階段用葡萄糖，胚狀體萌發階 段用蔗糖。進一步，上述棉花葉片直接誘導胚性愈傷組織的培養基中KT為0. 005-0. 15mg/L、 6-BA 為 0. 005-0. 15mg/L、2，4-D 為 0. 0001-0. 001mg/L, IAA 為 0. 001-0. 02mg/L,葡萄糖為 25-35g/L和 Gel rite 為 1.8-2. 5g/L。最優地，棉花葉片直接誘導胚性愈傷組織的培養基中KT為0. 05mg/L、6_BA為 0. lmg/L、2，4-D 為 0. 005mg/L, IAA 為 0. 005mg/L,葡萄糖為 25g/L 和 Gel rite 為 2. 2g/L。本發明的另一目的在於提供一種生產棉花再生苗的方法。本發明提供的生產棉花再生苗的方法，包括以下步驟1)將棉花葉片置於上述的棉花葉片直接誘導胚性愈傷組織的培養基中培養，得到 胚性愈傷組織；2)將步驟1)得到的胚性愈傷組織在胚狀體萌發培養基中繼代培養，獲得胚狀體， 得到棉花再生苗。上述的胚狀體萌發培養基，是在MSBl基本培養液中，添加KT、6_BA、蔗糖和Gelrite得到的培養基，所述MSBl基本培養液溶劑是水，溶質見表1。所述胚狀體萌發培養基中KT的終濃度是0.001-0. 15mg/L,6-BA的終濃度為 0. 005-0. 15mg/L，蔗糖 25_35g/L，Gel rite 的終濃度是 2. 0-2. 5g/L。進一步，上述胚狀體萌發培養基中KT的終濃度是0. 001-0. lmg/L, 6_BA的終濃度 為 0. 005-0. 15mg/L，蔗糖的終濃度為 28_32g/L，Gel rite 的終濃度是 2. 0-2. 3g/L。最優地，上述胚狀體萌發培養基中KT的終濃度是0. 01mg/L,6-BA的終濃度為 0. 01mg/L，蔗糖的終濃度為30g/L，Gel rite的終濃度是2. 2g/L。上述步驟1)中的棉花葉片是經過預處理的，所述預處理是將棉花葉片用0. 的 HgCl2進行消毒，然後用無菌水衝洗至少一次。上述棉花葉片可以是陸地棉的不同品種的真葉，不適合子葉、苞葉等部分。特別適 合中棉所24、中棉所27、冀合713或冀合321，同時該方法也適合珂字棉312、珂字201，及中 394、中091等易於組織培養的棉花材料。本發明的方法是利用大田棉株的真葉作為外植體建立組織培養體系，最終建立葉 片直接分化的、穩定高效的組織培養體系。該體系由葉片直接誘導分化出胚性愈傷組織，而 不經過愈傷組織，有效的縮短了棉花組織培養周期，可以用於外源基因的快速遺傳轉化、也 可以用於分化率遺傳研究、易於組織培養的材料選育等方面。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、棉花再生苗的獲得及其統計觀察1、胚性愈傷組織的製備1)外植體的預處理取大田棉花植株的真葉作為外植體。將棉花葉片取回後，先準備8個經高溫滅菌 (121°C，14min)的培養皿，第1、6、7、8號培養皿中加入適量滅菌水(121°C，Hmin)，第2、3、 4培養皿中加入質量百分濃度為0. 的HgCl2溶液。其中棉花設置3個品種，分別是中棉所24，中國農業科學院棉花研究所科技貿易公司銷售；冀合321，中國農業科學院棉花研究所科技貿易公司銷售；中棉所27，中國農業科學院棉花研究所科技貿易公司銷售。預處理具體操作先將從大田採摘的葉片在第1培養皿中衝洗一遍，然後依次 移到第2、3、4培養皿中浸泡滅菌，在每個培養皿中浸泡l-2min，在質量百分濃度為0. 1% HgCl2中浸泡滅菌總時間在4-5min比較合適，由於葉片背面葉毛較多，滅菌時要充分攪動， 以免在葉片表面形成小氣泡，使滅菌不徹底，易造成汙染；在第6、7、8號培養皿中各衝洗1 次，要徹底衝洗掉殘留的HgCl2,殘留的HgCl2也可以造成葉片死亡、胚性愈傷組織誘導、生 長困難等。衝洗後的葉片在主葉脈區域切成0.5cmX0. 5cm左右的外植體備用(注意不要 去除葉脈)。2)胚性愈傷組織的獲得將步驟1)得到的備用外植體，在無菌條件下接到經高溫滅菌的棉花葉片直接誘導胚性愈傷組織的培養基(簡稱ECl培養基)上(培養基配好後，倒入IOOml三角瓶中，每 瓶加約60ml，經高溫滅菌後備用。滅菌條件是121°C，14min)，注意葉片正面向上，用葉片背 面接觸培養基。25天後，可觀察到愈傷組織生長，35-60天後，可以獲得胚性愈傷組織。其中，ECl培養基是在MSBl基本培養液的基礎上，加激動素(KT)、6_BA、2，4_D、 IAA、葡萄糖、Gel rite (Sigma，貨號G1910)；其中，KT的終濃度是0. 05mg/L、6_BA的終濃 度是0. lmg/L、2，4-D的終濃度是0. 005mg/L、IAA的終濃度是0. 005mg/L、葡萄糖的終濃度 是25g/L、Gelrite的終濃度是2. 2g/L，調節pH至5. 8，其中所述MSBl基本培養液的溶劑是 水，溶質見表1。培養條件是，將三角瓶放置在2000-40001X的光照強度下培養，以30001x光強較 好；每天光培養14小時，暗培養10小時；培養室溫度控制在20-30°C。3)統計觀察實驗設置三個品種，重複3次，每處理為一升培養基，分裝在18個IOOml的三角瓶 中，每瓶接5片外植體。實驗結果見下表2。從表2可以看出，中棉所M誘導率最高，冀合 321次之，中棉所27最低。說明和無菌棉下胚軸一樣，胚性愈傷組織的誘導存在基因型差
已 升。表2.不同材料葉片分化率統計
材料名稱中棉所24冀合321中棉所27重複IIIIIIIIIIIIIII111外植體(個)909090909090909090胚性愈傷組織(塊)838486636859363732誘導率(％)92.293.3 ·95.67075.665.64041.135.62、胚性愈傷組織分化成苗1)胚狀體萌發培養基的製備胚狀體萌發培養基(命名為SEl培養基)是在MSBl基本培養液的基礎上添加KT、 6-BA、蔗糖和Gel rite。其中KT的終濃度是0. 01mg/L，6_BA的終濃度是0. 01mg/L，蔗糖 的終濃度是30g/L，Gel rite的終濃度2. 2g/L，調節pH為6. 5，其中所述MSBl基本培養液 的溶劑是水，溶質見表1。2)分化苗的獲得將上述步驟1中製備的胚性愈傷組織置於上述步驟2的步驟1)中得到的胚狀 體萌發培養基中培養，培養條件是，將三角瓶放置在2000-40001X的光照強度下培養，以 30001x光強較好。每天光培養14小時，暗培養10小時。每40天繼代一次，繼代培養2-3 次後，就可以得到再生苗。3)統計觀察為了明確不同材料來源的胚性愈傷組織對成苗培養基的反應，選用中棉所24、中 棉所27、冀合321三個棉花品種，每品種選取來自葉片的胚性愈傷組織20塊，每塊分接到3 瓶成苗培養基上。下次繼代時統計成苗數。繼代培養時，每瓶繼代一瓶，不擴繁。從表3結 果可以看出，中棉所24、中棉所27與冀合321相比，成苗數較少。說明成苗培養階段也存在基因型差異。表3.不同材料胚性愈傷組織的成苗數
材料名稱中棉所24冀合321中棉所27重複IIIIlIIIIIIIIIIIII胚性愈傷組織(塊)202020202020202020第一次繼代成苗數011100120第二次繼代成苗數121298111713125
第三次繼代成苗數21251829372316 242S實施例2、棉花再生苗的獲得及其統計觀察本實施例與實施例1的區別在於以下三點，其餘步驟完全相同1、所用原材料僅為中棉所24，由中國農業科學院棉花研究所早熟育種課題組培 育，由中國農業科學院棉花研究所科技貿易公司銷售。2,ECl培養基在MSBl基本培養液的基礎上添加了激動素(KT)、6_BA、2，4_D、IAA、 葡萄糖、Gel rite ；其中，KT的終濃度是0. 005mg/L、6_BA的終濃度是0. 005mg/L、2，4-D的 終濃度是0. 0001mg/L、IAA的終濃度是0. 001mg/L、葡萄糖的終濃度是25g/L、Gel rite的 終濃度是1. 8g/L，調節pH至5. 8。3、SEl培養基是在MSBl基本培養液的基礎上添加KT、6_BA、蔗糖和Gel rite ； 其中KT的終濃度是0. 001mg/L,6-BA的終濃度是0. 005mg/L，蔗糖的終濃度是25g/L，Gel rite的終濃度是2. 0g/L，調節pH為6. 2。將實驗結果見表4。從表2、表4可以看出，激素水平的降低，對胚性愈傷組織誘導 率影響較小。從胚性愈傷組織誘導實驗觀察看出，胚性愈傷組織出現較晚，約30天後才觀 察到胚性愈傷組織。在繼代培養階段，由於胚性愈傷組織生長緩慢，導致在胚狀體萌發階段 生長速度受限，獲得再生植株的時間推後，數量減少。表4中棉所M葉片的組織培養效果
重複IIIIII外植體(個)909090胚性愈傷組織(塊)768169誘導率(％)84.49076.7胚性愈傷組織(塊)202020第一次繼代成苗數000第二次繼代成苗數462第三次繼代成苗數193126實施例3、棉花再生苗的獲得及其統計觀察本實施例與實施例1的區別在於以下三點，其餘步驟完全相同
1、所用原材料僅為中棉所24，由中國農業科學院棉花研究所早熟育種課題組培 育，由中國農業科學院棉花研究所科技貿易公司銷售。；2,ECl培養基在MSBl基本培養液的基礎上添加了激動素(KT)、6_BA、2，4_D、IAA、 葡萄糖、Gel rite ；其中，KT的終濃度是0. 15mg/L、6_BA的終濃度是0. 15mg/L、2，4_D的終 濃度是0. 001mg/L、IAA的終濃度是0. 02mg/L、葡萄糖的終濃度是35g/L、Gel rite的終濃 度是2. 58/1，調節？!1至5.8。3,SEl培養基是在MSBl基本培養液的基礎上添加KT、6_BA、蔗糖和Gel rite ；其 中KT的終濃度是0. lmg/L、6-BA的終濃度是0. 15mg/L蔗糖的終濃度是35g/L、Gel rite 的終濃度是2. 5g/L，調節pH至6. 5。將實驗結果見表5。從表2、表5可以看出，由於激素水平的升高，對胚性愈傷組織 誘導率有較大影響。從胚性愈傷組織誘導實驗觀察看出，由於激素水平的增加，非胚性愈傷 組織生長旺盛，一般在20天後即可觀察到愈傷組織。愈傷組織的大量生長，影響了胚性愈 傷組織的獲得與生長。約30天後才在愈傷組織周圍的部分區域觀察到部分胚性愈傷組織。 在繼代培養階段，由於愈傷組織生長較快，幹擾了胚性愈傷組織的生長，使胚狀體萌發階段 生長速度受限，獲得再生植株的時間推後，數量減少。表5中棉所M葉片的組織培養效果
重複IIIIII外植體(個)909090胚性愈傷組織(塊)342938誘導率(％)37.832.242.2胚性愈傷組織(塊)202020第一次繼代成苗數000第二次繼代成苗數548第三次繼代成苗數14112權利要求
1.一種棉花葉片直接誘導胚性愈傷組織的培養基，是在MSBl基本培養液中添加如下 物質得到的培養基KT、6-BA、2，4-D、IAA、碳源和凝膠劑；所述MSBl基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；所述培養基中KT的終濃度是0. 005-0. 15mg/L、6-BA終濃度是0. 005-0. 15mg/L、2，4_D 的終濃度是 0. 0001-0. 001mg/L、IAA 的終濃度是 0. 001-0. 02mg/L。
2.根據權利要求1所述的培養基，其特徵在於所述凝膠劑是瓊脂粉、卡拉膠或Gel rite，優選是Gel rite ；所述碳源是葡萄糖或蔗糖。
3.根據權利要求2所述的培養基，其特徵在於所述培養基中KT、6-BA、2，4-D、IAA、葡 萄糖與Gel rite的終濃度分別是如下1)或2)1)KT為 0. 005-0. 15mg/L、6-BA 為 0. 005-0. 15mg/L、2，4-D 為 0. 0001-0. 001mg/L，IAA 為 0. 001-0. 02mg/L,葡萄糖為 25_35g/L 和 Gel rite 為 1. 8-2. 5g/L ；2)KT 為 0. 05mg/L、6-BA 為 0. lmg/L、2，4_D 為 0. 005mg/L, IAA 為 0. 005mg/L，葡萄糖為 25g/L 和 Gel rite 為 2. 2g/L。
4.一種生產棉花再生苗的方法，包括以下步驟1)將棉花葉片置於權利要求1-3任一所述的培養基中培養，得到胚性愈傷組織；2)將步驟1)得到的胚性愈傷組織在胚狀體萌發培養基中繼代培養，獲得胚狀體，得到 棉花再生苗。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述胚狀體萌發培養基，是在MSBl基本培 養液中，添加KT、6-BA、蔗糖和Gel rite得到的培養基；所述胚狀體萌發培養基中KT的終 濃度是 0. 001-0. 15mg/L，6-BA 的終濃度為 0. 005-0. 15mg/L，蔗糖 25_35g/L，Gel rite 的終 濃度是2. 0-2. 5g/L ；所述MSBl基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於所述胚狀體萌發培養基中KT的終濃度是 0. 001-0. lmg/L，6-BA 的終濃度為 0. 005-0. 15mg/L，蔗糖的終濃度為 28-32g/L,Gel rite 的 終濃度是2. 0-2. 3g/L。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於所述胚狀體萌發培養基中KT的終濃度是 0. 01mg/L,6-BA的終濃度為0. 01mg/L，蔗糖的終濃度為30g/L，Gel rite的終濃度是2. 2g/ L0
8.如權利要求4-7任一所述的方法，其特徵在於所述棉花葉片是經過預處理的，所述 預處理是將棉花葉片用0. 的HgCl2進行消毒，然後用無菌水衝洗至少一次。
9.如權利要求4-8任一所述的方法，其特徵在於所述棉花葉片是真葉。
10.如權利要求4-9任一所述的方法，其特徵在於所述棉花是中棉所24、中棉所27、 冀合321、冀合713、珂字棉312、珂字201、中394或中091。
全文摘要
本發明公開了一種棉花真葉直接分化組織培養方法及其專用培養基。本發明提供的專用培養基是棉花葉片直接分化出胚性愈傷組織時所用的培養基，它是在MSB1基本培養液中，添加如下物質得到的培養基KT、6-BA、2，4-D，IAA，葡萄糖和凝膠劑；上述KT的終濃度是0.005-0.15mg/L、6-BA終濃度是0.005-0.15mg/L、2，4-D的終濃度是0.0001-0.001mg/L、IAA的終濃度是0.001-0.02mg/L、葡萄糖的終濃度是25-35g/L、Gel rite的終濃度是1.8-2.5g/L。本發明的方法是利用田間棉株的葉片作為外植體建立組織培養體系，最終建立葉片直接誘導胚性愈傷組織的、穩定高效的組織培養體系。
文檔編號A01H4/00GK102057870SQ200910238159
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月17日 優先權日2009年11月17日
發明者張朝軍, 李付廣, 李鳳蓮, 武芝俠, 王曄, 王玉芬 申請人:中國農業科學院棉花研究所