一種藻毒素降解菌的原生質體製備與再生的製作方法

2023-06-02 13:09:06

專利名稱：一種藻毒素降解菌的原生質體製備與再生的製作方法
技術領域：
本發明涉及水處理微生物技術領域，具體涉及一種藻毒素降解菌的原生質體製備與再生。
背景技術：
近年來，隨著社會經濟的發展，大量含氮磷等營養元素的汙水進入自然水體，導致水體富營養化問題日漸嚴重，我國一些地區如太湖、巢湖及滇池等流域藍藻水華年年爆發。湖泊或水庫中發生藍藻水華，不僅削減其生態調節和水體自淨的能力，同時藻體堆積死亡、藻細胞破裂分解過程中，向水體釋放大量藻毒素。微囊藻毒素-LR (MC-LR)是目前我國出現頻率最高、毒性最強、急性危害最大的一類藻毒素，它對人類和其他生物的脾臟、肝臟、腎 髒、大腸、心臟等都具有明顯「三致」毒害作用，危及環境生態並對人們飲用水安全構成威脅。MC-LR分子形態呈七肽環狀，結構穩定，加熱、煮沸等一般方法不易將毒性去除，這也加大了控制和消除MC-LR汙染的難度。傳統的淨水工藝，如國內水廠廣泛採用的混凝、沉澱和過濾工藝不能有效去除MC-LR，其中混凝、沉澱通過去除藻類而去除細胞內的MC-LR，但不能去除細胞外溶解性MC-LR，而過濾可去除部分細胞內的MC-LR，但對細胞外MC-LR的去除作用較弱，不能保證出水MC-LR達標。因此，迫切需要尋求能有效去除飲用水中MC-LR的方法。國內外學者對環境水體中MC-LR的降解與去除進行了多方面研究，對飲用水中MC-LR比較有效的處理技術有活性炭吸附、光降解與光催化氧化、臭氧氧化、化學藥劑氧化、膜濾及生物降解等，但這些技術均存在一些不足一易產生二次汙染(生成較多有機副產物)、能耗大、運行成本高等，難以應用於實際工程中。微生物法是處理MC-LR較有效的一種方法，它既可以減少物理法人力、物力及財力的大量投入，又可以避免化學法二次汙染的風險。《生物學雜誌》(2010)第27卷第6期57-64頁報導了鍾升等從巢湖底泥中分離出5株菌，並利用其對微囊藻毒素進行降解，其中M9菌48h對MC-LR降解率達到62. 2%。專利授權發文號為2012061900548110的專利，張文藝等(即本發明人)從太湖藍藻重汙染河浜底泥中篩選到的一株MC-LR降解菌，對MC-LR的降解率可達到66. 95%。雖然目前已有不少關於MC-LR降解菌的研究報導，但從自然界中篩選得到能夠降解MC-LR的菌株種類不多，種群結構較單一，降解效率不高且降解菌的環境適應性不強，難以用於實際的工程中。本發明以篩得的自然菌株為基礎，採用原生質體融合技術製備該藻毒素降解菌的原生質體。原生質體融合技術起源於20世紀60年代，是將兩個遺傳性狀不同的親株通過基因重組得到兼具兩者優良性狀的融合菌，是一種構建高效工程菌的技術方法。《高校化學工程學報》(2009)第23卷第6期1064-1068頁報導了何光裕等採用原生質體融合技術製備2株脫色菌的原生質體，並由此構建了一種高效脫色工程菌H-1，對染料廢水有比較好的脫色效果。原生質體製備與再生是進行原生質體融合的首要和前提條件，它直接影響著後續融合實驗及融合子再生的順利進行。目前國內外研究顯示，菌株原生質體製備與再生率大多處於較低水平，且波動性很大。探索適合特定菌株的最佳製備與再生條件，提高其製備與再生率，對於該菌株後續轉基因研究具有重要意義。針對MC-LR的生物降解菌種類不多，種群結構較單一，降解效率不高等問題，研究MC-LR降解菌的原生質體製備與再生對後續構建高效MC-LR降解工程菌具有重要的理論和實用價值。本發明製備了本實驗室分離保存的I株MC-LR降解菌R3 (Lysinibacillusfusiformis)的原生質體，該菌是本實驗室從藍藻脫水壓濾液中分離出來的一株降解MC-LR的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌，當添加葡萄糖為外加碳源時其對MC-LR的去除率可達到59. 26%。該降解菌的國家發明專利申請號為201210275635. 3，並在美國國立生物技術信息中心(NCBI)GenBank進行了註冊(註冊序列號為JQ991002)，同時送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(保藏號為CGMCC NO. 6107)。

發明內容
本發明的目的是提供一種降解MC-LR的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌R3的原生質體制
備與再生。本發明所採用的具體技術方案如下本發明的原生質體製備與再生按照下述的具體步驟進行操作A、種子培養液的製備從紡錘形賴氨酸芽孢桿菌CGMCC NO. 6107的斜面培養基中挑取一環菌接入新鮮細菌液體培養基，28°C下活化培養5-60h至不同的生長期，得到種子培養液；B、菌絲懸液的製備將4mL上述種子培養液離心，使得菌體與培養液分離；棄去上清液，向沉澱的菌體中加入SMM緩衝液，離心洗滌菌絲3次；用1. 6-1. 96mL的SMM緩衝液重懸，得到菌絲懸液；C、細胞壁的酶解在上述的菌絲懸液中加入O. 04-0. 4mL的溶菌酶和2mL的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，其中溶菌酶濃度為10mg/mL，EDTA溶液濃度為O. 8mg/mL且加熱至酶解溫度32°C ;在溫度為32°C的水浴鍋中酶解lh，得到酶解溶液；D、原生質體懸液的製備將上述酶解得到的溶液離心，使得原生質體與酶解液分離；棄去上清液，向沉澱的原生質體中加入濃度為O. 55mol/L的NaCl溶液，離心洗滌原生質體3次；用濃度為O. 55mol/L NaCl溶液懸浮，得到原生質體懸浮液；E、原生質體的再生將上述步驟的原生質體懸浮液，振蕩混勻，用濃度為O. 55mol/L的NaCl溶液稀釋後，塗布於高滲固體培養基上，置於32°C恆溫培養箱中培養24-48h，得到原生質體再生菌落。製備率與再生率的計算將溶菌酶處理前的種子培養液用無菌蒸餾水，酶解後的原生質體懸浮液同時用無菌蒸餾水和濃度為O. 55mol/L的NaCl溶液均稀釋至10_6、10_7和10_8三個濃度梯度，分別吸取100 μ1、100 μ I和200 μ I塗布在細菌固體培養基、細菌固體培養基和高滲固體培養基上，其中用NaCl溶液稀釋的酶解後懸浮液放置15min，使原生質體充分吸水脹破後塗布，每個稀釋度做三個平行，於32°C恆溫培養箱中倒置培養24-48h，待菌落大小、形態生長較為良好時計其菌落數為A、B和C。根據下述公式計算原生質體的製備率和再生率。
權利要求
1.一種藻毒素降解菌的原生質體製備與再生方法，其特徵如下 從紡錘形賴氨酸芽孢桿菌CGMCC NO. 6107的斜面培養基中挑取一環菌接入新鮮細菌液體培養基，130r/min、28°C條件下活化培養5-60 h至不同的生長期，得到R3種子培養液；繼而製備菌絲懸液，32°C、1 h條件下酶解細胞壁，進行原生質體懸液的製備；將上述特徵溶菌酶處理前的種子培養液用無菌蒸餾水，酶解後的原生質體懸浮液同時用無菌蒸餾水和濃度為0. 55 mol/L的NaCl溶液均稀釋至10_6、10_7和10_8三個濃度梯度，分別塗布在細菌固體培養基、細菌固體培養基和高滲固體培養基上，置於32°C恆溫培養箱中培養24-48 h，得到原生質體再生菌落。
全文摘要
本發明涉及水處理微生物技術領域，具體涉及一種藻毒素降解菌的原生質體製備與再生。該菌分離自藍藻脫水壓濾液，經鑑定為錘形賴氨酸芽孢桿菌，現保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.6107，保藏名稱為MC-LR降解菌R3。本發明主要包括該菌種子培養液的製備、菌絲懸液的製備、細胞壁的酶解、原生質體懸液的製備和原生質體的再生。本發明所採用的原生質體製備與再生，對降解MC-LR的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌R3的原生質體製備率最高可達85.10%，再生率可達38.40%，且製備與再生過程中設備要求低，操作簡單，酶解時間與再生周期短，有利於R3後續融合子的製備及工程菌的構建。
文檔編號C12N1/20GK103013886SQ201210573998
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者張文藝, 李仁霞, 戴如娟, 鄭澤鑫, 佔明飛 申請人:常州大學