一種突變頭孢菌素c醯化酶的製作方法

2023-06-02 06:42:51

專利名稱：一種突變頭孢菌素c醯化酶的製作方法
一種突變頭孢菌素C醯化酶技術領域
本發明屬於酶工程和工業生物技術領域，具體涉及一種耐產物抑制型突變頭孢菌素C醯化酶、該酶基因的載體、轉化體及其在一步酶法生產7-氨基頭孢烷酸中的應用。
背景技術：
微生物生產的頭孢菌素C (C印halosporin C，CPC)醯化酶，可以高效催化頭孢菌素C脫去側鏈生成7-氨基頭孢燒酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)。頭孢菌素類藥物(Cephalosporins)與青黴素一樣,是一族β-內醯胺類廣譜抗生素，通過幹擾細菌細胞壁的合成並加速細胞壁的破壞而起到殺菌的作用。利用微生物產生的頭孢菌素C醯化酶催化生產7-氨基頭孢烷酸具有工藝簡單、安全、高效、汙染小等優點，因此逐漸成為7-氨基頭孢烷酸生產的主要方法。
一步酶法生產7-氨基頭孢烷酸的研究重點在於高產頭孢菌素C醯化酶的菌株的發現和改造以及對頭孢菌素C醯化酶自身結構的改造。其中，在對CPC醯化酶的改造研究方面，酶活低、底物轉化率低和嚴重的產物抑制問題是制約CPC醯化酶用於催化CPC生產 7-ACA的工業化的主要因素。
在酶活的改造研究方面，有學者對源於P. diminuta N176的CPC醯化酶在215 位、296位和309位三個位點進行了突變，突變體表現出了比GL-7-ACA更高的CPC酶活 (Pollegioni L, Lorenzi S，Rosini E, et al. Protein Science, 2005, 14(12): 3064 3076)。韓國學者對來自Pseudomonas strain SE83 acy II的CPC酸化酶通過多點突變(Vall22Ala-Glyl40Ser-Phe297Arg- Ile314Thr- Ile415Val -Ser710Cys)提高了酶對底物CPC的活性和特異性，其CPC酶活相對於野生菌提高了 8 10倍左右(W0 2005/014821 Al)。清華大學通過密碼子設計和基因合成獲得了高活性CPC醯化酶，並通過對底物入口處相關胺基酸殘基的突變(Ala675Gly)，使得酶活進一步提高了 35% (中國發明專利，申請號201110460235· 5 ;Yu H. Μ.等，Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012, 113，36-41)。清華大學還通過對組成型宿主菌株E. coli JM105 (賽百盛公司)和誘導型表達型宿主菌株E. coli JM109 (DE3)(鼎國公司)底物分解相關基因β _內醯胺酶基因ampC和乙醯基酯酶基因aes的敲除，使得底物轉化率顯著提高(Yu H. M.等，Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012, 113, 737 - 741)。發明內容
本發明的目的在於提供一種突變頭孢菌素C醯化酶及其基因。
本發明的目的還在於提供上述突變頭孢菌素C醯化酶的表達載體和轉化體。
本發明的目的又在於提供上述突變頭孢菌素C醯化酶及其基因、含突變頭孢菌素 C醯化酶基因的表達載體和轉化體在製備7-ACA中的應用。
一種突變頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)醯化酶，其具有SEQ ID NO:2所示胺基酸序列，其是通過對SEQ ID N0:1所示基因編碼的頭孢菌素C醯化酶胺基酸序列的第227位Ala和第228位Met進行缺失突變得到的，此突變頭孢菌素C醯化酶命名為CPCAcy_D2。
上述的突變頭孢菌素C醯化酶，其具有SEQ ID NO: 3所示胺基酸序列，其是通過對 SEQ ID N0:1所示基因編碼的胺基酸序列中的第212位Ala、第213位Asp、第214位Leu和第215位Ala進行缺失突變得到的，此突變頭孢菌素C醯化酶命名為CPCAcy_D4。
編碼上述突變頭孢菌素C醯化酶的基因。
含上述突變頭孢菌素C醯化酶基因的表達載體。
上述突變頭孢菌素C醯化酶的基因的表達載體為誘導型或組成型表達載體，誘導型表達載體為PET或其它系列誘導型表達載體，如誘導型表達載體PET28 ;組成型表達載體，為麥芽糖結合蛋白MBP融合表達的pMKC組成型表達載體或其它高效組成型表達載體。
上述突變頭孢菌素C醯化酶基因的轉化體，轉化體為誘導型或組成型的重組大腸桿菌。
誘導型表達載體的宿主菌優選為E. coli BL21(DE3) (Promega公司)或 JM109(DE3)(鼎國公司)或其它適宜菌株等作為受體菌。
組成型表達載體的宿主菌優選為E. coli TBl (New England Biolab公司)或Ε· coli JM105(賽百盛公司)或其它適宜菌株等作為受體菌。
上述突變CPC醯化酶基因轉化體的構建方法為常規的氯化鈣法或電穿孔轉化法 (Sambrook J等· Molecular Cloning: A Laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)。
上述突變CPC醯化酶、攜帶有上述突變CPC醯化酶編碼基因的表達載體或轉化體在製備7-氨基頭孢烷酸上的應用。
本發明突變CPC醯化酶的粗酶液首先採用硫酸銨飽和沉澱進行初步純化，進一步採用樹脂、矽膠或其它載體進行固定化，即可用於從CPC製備7-氨基頭孢烷酸。
本發明的有益效果為(I)本發明改良的頭孢菌素C醯化酶的產物耐受性顯著提升，在6g/L濃度的7-ACA溶液中，酶活保留率從7. 5%分別提高到17. 5% (CPCAcy-D2)和 40% (CPCAcy-D4) ；(2)本發明改良頭孢菌素C醯化酶表達活性高，即穩定性的提升沒有導致頭孢菌素C醯化酶活性的下降。採用本發明提供的改良頭孢菌素C醯化酶，能夠高效催化底物CPC生成產物7-ACA，具有良好的工業應用前景。


圖I攜帶改良頭孢菌素C醯化酶基因的重組質粒pET28_CPCacyM示意圖。
圖2突變頭孢菌素C醯化酶與原酶的蛋白質電泳帶I 為 CPCAcy-D4 (D4);帶 2 為 CPCAcy-D2 (D2);帶 3 為原酶對照 CPCacy (C)； 帶4為蛋白質分子量標準。
圖3改良頭孢菌素C醯化酶與原酶的產物耐受性比較具體實施方式
實施例I
突變頭孢菌素C醯化酶CPCacy_D2的基因突變
從原CPC醯化酶SEQ ID NO :1所對應的基因序列(中國發明專利ZL200810102219. 7中所述的SEQ ID NO 4)出發，使用pUC18_acy (中國發明專利ZL 200810102219. 7)作為模板，採用聚合酶鏈式反應(PCR)方法構建突變頭孢菌素C醯化酶CPCacyM。按照TaKaRa MutanBEST試劑盒所述步驟，用一對Upl-Downl引物(Upl : GGCGGTGATGCCAGCGACGCA ； Down I TCCAGCCGTTGATGCATTACTGAAA )對質粒 pUC18_acy 進行反向擴增，使其在α亞基C端處缺失掉227-228位Ala-Met這2個胺基酸殘基。
PCR 的反應體系為無菌水 37. 7 μ L, 10 X Pyrobest Buffer, 5 μ L ；dNTPs (每種dNTP濃度2. 5mM)，4yL ;上下遊引物(濃度20 ymolL—1)，各I μ L ;質粒模板，I μ L ; Pyrobest DNA 聚合酶(5 U μ L O, O. 3 μ L ;總體積,50 μ L.
反應條件為94°C，5min ； 94°C O. 5min、60°C O. 5n、72 °C 5min，循環 30 次；最後 72 °C 15min。
首先採用本領域技術人員熟知的方法進行末端連接，再將連接反應產物轉化宿主菌E. coli JM109 (DE3)的感受態細胞(鼎國公司)，採用氨苄青黴素(Amp+) LB固體培養基(培養基組成為50ml/300ml搖瓶，蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，卡那黴素， 50mg/L,瓊脂粉，15g/L，pH 7. O)平板挑選陽性克隆，得到含有突變頭孢菌素C醯化酶基因片斷的重組質粒pUC18-CPCacyM_D2。將重組質粒提交諾賽基因公司進行DNA測序，測序結果證明所得的突變頭孢菌素C醯化酶在α亞基C端處缺失掉227-228位Ala、Met殘基，編碼蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO :2，即突變型CPCAcy-D2。
實施例2
改良後的突變頭孢菌素C醯化酶CPCacy_D4基因突變及其轉化體構建
其它條件同實施例1，但所用PCR引物改為Up2-Down2，其中，Up2的基因序列為 GCATTACGTCCAGCCGTTGATGCAT ；Down2 的基因序列為AGGCGTGGAAGCGGAGCGTCTGGAG。PCR 擴增、連接後獲得重組質粒pUC18-CPCacyM_D4，攜帶第212-215位Ala-Asp-Leu-Ala缺失的突變CPC醯化酶基因。編碼蛋白的胺基酸序列為SEQ ID N0:3，即突變型CPCAcy-D4。
實施例3
表達載體pET28_CPCacyM和pMKC-CPCacy M構建和轉化體構建
(I)質粒pET28_CPCacyM_D2的構建對實施例I獲得的質粒載體pUC18_acyM_D2和 pET28a (Novagen公司)分別採用BamHI/Hindlll雙酶切。酶切反應體積50 μ L，質粒用量 17 μ L，各酶用量I μ L，緩衝液5 μ L，採用無菌水補足至50 μ L。37°C反應過夜，獲得酶切產物CPC醯化酶基因和pET28a的線性質粒骨架。PCR產物回收試劑盒(天根生化科技(北京) 有限公司)純化酶切產物後，將CPC醯化酶基因和pET28a的線性質粒骨架以3 1的濃度比例用T4 DNA連接酶在4°C進行連接反應，連接反應時間為14 h至16h。將連接反應物轉化宿主菌E. coli DH5a感受態細胞，塗布LB平板(卡那黴素抗性，Kan+)，挑選陽性克隆，進行搖瓶培養12h。收穫細胞，採用常規試劑盒提取小量質粒進行常規酶切和電泳驗證，獲得重組質粒 pET28-CPCacyM_D2。
(2)轉化體 E. coli JM109(DE3)/ pET28_CPCacyM_D2 和 E. coli BL21(DE3)/ pET28-CPCacyM_D2的構建將質粒pET28-CPCacyM_D2分別採用常規電穿孔轉化法(電轉儀伯樂公司，電壓1250V)轉化宿主大腸桿菌E. coli JM109 (DE3)和E. coli BL21(DE3)，轉化後的細胞加入800 μ I的SOC液體培養基(配方見《分子克隆指南》)，置於37°C，220rpm搖床培養30min活化。取50 μ I菌液塗布於含有50 μ g/ml卡那抗生素的LB固體培養基平板，放入37°C培養箱培養20小時，分別獲得基因重組菌JM109 (DE3) / pET28-CPCacyM_D2和 BL21(DE3)/ pET28-CPCacy.D2。
(3)質粒pET28-CPCaCyM_D4的構建及其轉化體構建對實施例2獲得的質粒載體 pUC18_acyM_D4和pET28a (Novagen公司)分別採用如實施例3中(I)、(2)所示方法，獲得重組質粒 pET28-CPCacyM4 以及轉化體 JM109 (DE3) / pET28-CPCacyM4 和 BL21 (DE3) / pET28-CPCacy.D4。
攜帶突變頭孢菌素C醯化酶基因的重組質粒pET28_CPCacyM如圖I所示；其中，M 表示227-228位的Ala-Met缺失突變或212-215位Ala-Asp-Leu-Ala缺失突變。
(4)質粒pMKC_CPCacyM_D2和pMKC_CPCacyM_D4的構建及其轉化體構建質粒 pMKC-CPCacy* 和 pMKC-CPCacy* 的構建方法同實施例 3(1)，採用 BamHI/Hindlll 雙酶切，獲得突變CPC醯化酶(CPCAcy-D2或CPCAcy_D4)全基因。同時採用相同方法酶切質粒載體 pMKC-Acy (Yu HM 等· Journal of Molecular Biocatalysis B: Enzymatic, 2006, 43，118-123)，獲得pMKC的線性質粒骨 架。用PCR產物回收試劑盒純化後，將CPCAcy_D2或 CPCAcy-D4基因和pMKC的線性質粒骨架在4°C採用T4 DNA連接酶進行連接反應14h，構建組成型表達重組質粒pMKC-CPCacy M_D2及pMKC-CPCacy M_D4。轉化方法同實施例3(2)，採用電穿孔轉化法將pMKC-CPCacy* 及pMKC-CPCacy M_D4分別轉化大腸桿菌E. coli JM105(天根生化科技(北京)有限公司)，獲得轉化體 JM 105/pMKC-CPCaCyM_D2 以及 JM 105/pMKC-CPCaCyM_D4。
實施例4
突變頭孢菌素C醯化酶CPCacy_D2和CPCacy_D4在轉化體中的表達
將實施例3獲得的本發明改良頭孢菌素C醯化酶CPCacy_D2和CPCacy_D4的誘導型表達菌株 E. coli JM109 (DE3) /ρΕΤ28-0Ρ0ΒογΜ2 和 JM109 (DE3) / ρΕΤ28-0Ρ0ΒογΜ4 進行搖瓶培養，並以未突變CPC醯化酶重組菌Ε. coli JM109(DE3)/pET28-CPCacy為對照。首先在含50 mg/L卡那黴素的LB培養基中(培養基組成為10ml/50ml搖瓶，蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，pH 7.0)分別接種單菌落，37 °C,200 rpm培養12h，製作種瓶。
從種瓶中按照5%接種量轉接到含50mg/L卡那黴素的發酵培養基中(50ml/300ml 搖瓶，培養基為玉米漿50 g/L，酵母膏10 g/L，NH4Cl 2. 5 g/L，甘油5. O g/L，KH2PO4 2. 3 g/L, K2HPO4 16.4 g/L，乳糖 3g/L，pH 7· 5)，28。。、200 rpm 條件下搖瓶培養 24 小時。
以CPC為底物，採用對二甲氨基苯甲醛(PDAB)顯色法測定CPC醯化酶的酶活。首先製備粗酶液5ml菌液在4°C、10000 rpm離心10 min，所得沉澱用0. IM PBS緩衝液(pH8.5)洗滌兩次後重懸於20ml緩衝液(菌體OD600約為I. 0)，冰浴超聲破碎10 min (320 W, 7X3X60次)；在4°C，12000 rpm離心5 min獲取上清酶液；20 μ I底物(0. IM PBS緩衝液，pH 8.5，配製20 mg/ml CPC溶液)，20 μ I酶，37 °C反應5 min後，加入200 μ I終止液 (20%乙酸與0. 05 mol/L NaOH溶液2:1體積混合)，12000rpm離心3min,取200 μ I上清液加入40 μ I顯色劑(按PDAB與甲醇質量體積比為5 :95配成)，反應IOmin,測定415nm的吸光度，測定CPC醯化酶的酶活。酶活單位定義為每分鐘催化生成I ymol 7-ACA所需的酶量。
酶活測定結果表明，重組菌E. coli JM109(DE3)/pET28_CPCacy、E. coli JM109 (DE3) /ρΕΤ28-0Ρ0βουΜ2 和 JM109 (DE3) / ρΕΤ28-0Ρ0ΒογΜ4 表達的原酶 CPCacy 和突變酶CPCacy-D2、CPCacy-D4的酶活分別為3219、3380以及3350 U/L。收集菌體，超聲破碎後取上清液進行常規十二烷基磺酸鈉_聚丙烯醯胺蛋白質凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測酶的表達，結果表明，本發明入編CPC醯化酶和原酶都獲得了大量的活性蛋白，如圖2所示。
與此類似，對重組菌E. coli BL21 (DE3)/pET28_CPCacy、BL21 (DE3) (DE3)/ pET28-CPCacyM_D2 和 BL21 (DE3) / pET28_CPCacyM_D4 進行了搖瓶培養。結果表明，原酶 CPCacy 和突變酶CPCacy_D2、CPCacy_D4的酶活進一步提高約40%。
同樣，對組成型表達菌JM105/pMKC_CPCacy、JM105/pMKC_CPCacy Μ2 和 JM105/ pMKC-CPCacy^114進行平行培養，種瓶和搖瓶培養基和培養方法同前，只是在搖瓶培養過程中不加入誘導劑乳糖，直接在28°C相同條件下搖瓶培養24小時。結果表明，組成型表達的改良CPC醯化酶和原酶的酶活與誘導型表達相當，且改良醯化酶CPCacy_D2、CPCacy-D4的酶活略高於原酶CPCacy (分別提高5%和3%)。
實施例5
改良頭孢菌素C醯化酶的產物抑制性評估
將實施例4 培養的 50ml 重組菌 E. coli JM109 (DE3) /ρΕΤ28-0Ρ0ΒογΜ2 和 JM109 (DE3) / pET28-CPCacyM-D4 以及對照菌 JM109 (DE3) /pET28_CPCacy 發酵液分別離心收穫細胞，用等體積的O. IM磷酸鹽緩衝液PBS (pH 8. 5)重懸、常規方法超聲破碎後備用。
各取20 μ I超聲破碎液與等體積20 mM CPC溶液混合，加入6g/L的7-ACA溶液浸泡，37°C放置5分鐘後再測量生成的7-ACA量。結果表明，在加入6g/L的7-ACA產物抑制條件下，原酶CPCacy的酶活保留率僅為7. 5%，而改良型CPCAcy_D2和CPCAcy_D4的酶活保留率分別提高到17. 5%和40%，如圖3所示。組成型表達的改良CPCAcy-D2和CPCAcy_D4 具有同樣的結果。
實施例6
本發明改良CPC醯化酶催化CPC生成7-ACA試驗
對實施例4 獲得的誘導型轉化體 JM109 (DE3) / pET28_CPCacyM-D2 和 JM109 (DE3) / pET28-CPCacyM_D4進行搖瓶培養。收集50ml菌液，用O. IM PBS緩衝液(pH 8. 5)洗滌後低溫超聲破碎，細胞破碎後的粗酶液直接用於3% CPC鈉鹽到7-ACA的催化轉化，28°C下搖床振蕩反應lh。取樣200 μ 1，用PDAB顯色法分析，結果表明，本發明CPC醯化酶CPCAcy_D2和 CPCAcy-D4可以成功地將底物CPC —步轉化生成7-ACA，產物濃度分別為2. 80和2. 83g/L。 組成型表達的改良CPCAcy-D2和CPCAcy_D4具有同樣的結果。
權利要求
1.一種突變頭孢菌素C醯化酶，其特徵在於，其具有SEQ ID N0:2所示胺基酸序列，其是通過對SEQ ID NO: I所示基因編碼的頭孢菌素C醯化酶胺基酸序列的第227位Ala和第 228位Met進行缺失突變得到的。
2.根據權利要求I所述的一種突變頭孢菌素C醯化酶，其特徵在於，其具有SEQID NO:3所示胺基酸序列，其是通過對SEQ ID NO: I所示基因編碼的胺基酸序列中的第212位 Ala、第213位Asp、第214位Leu和第215位Ala進行缺失突變得到的。
3.編碼權利要求1-2中任一項的突變頭孢菌素C醯化酶的基因。
4.含有權利要求3所述突變頭孢菌素C醯化酶基因的表達載體。
5.權利要求3所述突變頭孢菌素C醯化酶基因的轉化體。
6.根據權利要求5所述的轉化體，其特徵在於，所述轉化體為誘導型或組成型的重組大腸桿菌。
7.權利要求1-6所述任一項在製備7-氨基頭孢烷酸中的應用。
全文摘要
本發明公開了屬於酶工程和工業生物技術領域的一種耐產物抑制型突變頭孢菌素C醯化酶、該酶基因的載體、轉化體及其在一步酶法生產7-氨基頭孢烷酸中的應用。該酶的胺基酸序列為在基因序列SEQ ID NO:1所編碼的頭孢菌素C醯化酶胺基酸序列上進行缺失突變得到酶CPCAcy-D2和CPCAcy-D4，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示。本發明還公開了該酶的基因的載體和轉化體以及其應用，該酶不僅表達活性高，產物耐受性也顯著提高，能夠高效催化底物CPC生成產物7-ACA。
文檔編號C12P35/02GK102925423SQ201210466978
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者于慧敏, 張婧, 王穎, 羅暉, 沈忠耀 申請人:清華大學