一種對蝦腸道微生物dna的提取方法
2023-06-02 06:42:46 2
專利名稱：一種對蝦腸道微生物dna的提取方法
技術領域：
本發明屬於微生物學和分子生態學領域，具體涉及一種對蝦腸道微生物DNA的提 取方法。
背景技術：
腸道微生物的研究日益成為熱點，目前對蝦腸道微生物多樣性的研究多為可培養 細菌的研究，但是自然界中99%以上的微生物是不可培養的，為了克服傳統微生物培養技 術的缺陷，更全面深入地了解對蝦腸道的微生物群落結構，需要建立研究對蝦腸道微生物 組成的分子方法。腸道微生物DNA是進行分子研究的前提。能否獲得高的DNA提取率和高 質量的DNA，從而真實地反映微生物群落的實際情況，是保障研究結果是否可靠的關鍵。如 何獲取高質量、較完整的腸道菌群基因組DNA是腸道微生物研究中的關鍵。
微生物分子生態學是通過分析樣品中DNA分子的種類、數量等基因組信息來反映 微生物細胞種類與種群比例等信息的。用這種方法對環境微生物多樣性、群落結構及變化 規律進行研究始於20世紀80年代中期，近年來在土壤、海洋、動物腸道等微生態系統的研 究中得到快速發展，已成為最富於活力的生態學科前沿領域之一。由於擺脫了培養方法的 局限性，直接對環境樣品中的細菌基因組DNA組成狀況進行分析評價，因此建立高效、可靠 的DNA提取方法成為研究者關注的熱點。有關從土壤、水體、海洋沉積中提取DNA的方法已 得到較好發展，而對於腸道微生物DNA的提取方法的研究相對較少，不同動物腸道複雜環 境的影響增加了 DNA的提取的難度。按照常規方法進行腸道微生物DNA的提取，很難得到 可用於擴增的DNA樣品，一種專門用於腸道微生物DNA提取的方法是進行研究的首要前提。
發明內容
本發明的目的是提供一種通用性好、可靠性高、成本低廉的對蝦腸道微生物DNA 的提取方法。 為實現上述目標本發明採用的技術方案為對蝦腸道微生物DNA的提取方法
1)將O. 01-0. 05g對蟲下腸道在液氮下研磨，並加入0. 8-1. 2mL PBS、 15-25 y L PVPP 勻槳和200-300 ii L 0. 5% Tween-80，均勻後吹打洗脫3-5min ; 2)將洗脫液在200g離心5-10min，取上清菌液待用；沉澱中加0. 8-1. 2mL PBS以 200g離心取上清菌液，將兩次離心所得上清菌液合併，合併上清液以300g離心5-10min，取 上清菌液待用； 3)將步驟2)所得上清菌液以1200g離心5-10min，收集上清菌液；
4)將步驟3)所得上清菌液中加100-150 iiL CTAB提取液和10-15 yL溶菌酶， 放入37 。C搖床，振蕩30-40min;而後加15-20 iiL 20% (W/C) SDS和10-15 y L蛋白酶K， 60-70。C水浴l-2h ; 5)將水浴後菌液在4。C 3200g離心8-15min，取上清菌液，而後加100-150 iiL CTAB 液和20-25 ii L 20% SDS混勻後，渦旋，6Q-70。C水浴10-15min ;
6)將水浴後菌液以3200g離心8-15min，取上清菌液，而後加入與上述上清菌液等 體積的酚/氯仿混合液，14000g離心10-15min，取上清菌液待用；其中酚/氯仿按25 : 24v 混合； 7)將步驟6)所得上清菌液中加上清菌液體積0. 6-0. 8倍的異丙醇，而後於_20°C 靜置l-2h，再以4°C 14000g離心10-15min，所得沉澱待用; 8)將步驟7)所得沉澱中加入600-800 ii L 70%預冷乙醇，14000g離心10-15min， 所得沉澱即為對蟲下腸道微生物DNA。 所述所得對蝦腸道微生物DNA在超淨臺下乾燥，加50 ii L TE重懸，凍於-8(TC備 用。所述TE溶液成分為100mM Tris，lmM EDTA， 0. 1 % RNase， pH = 8. 0所述步驟1)中PBS 溶液，其成分為2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaC1，2. 7mM KC1， pH = 7. 4。所述步驟1) 所述對蝦腸道放入無水乙醇中，凍於-8(TC保存待用。所述步驟3)離心後所得上清菌液 用PBS洗滌2-3次。所述步驟4)中CTAB提取液，其成分為100mM Tris-HCl， 100mM EDTA， 100mM磷酸鈉，1. 5M NaCl， 1% CTAB，pH = 8. 0 ;所述步驟4)中溶菌酶濃度為50mg/mL ;所述 步驟4)中蛋白酶K濃度為20mg/ml。所述步驟4)水浴時每隔15min將離心所得上清菌液 上下翻轉混勻。
本發明的優點 本發明快速並成本低，適合腸道微生物研究中總DNA提取，尤其適合處理大批量 的樣品。採用各種細胞破壁方法相結合，裂解完全；不需要核酸吸附材料進一步純化，可直 接用於PCR擴增的腸道微生物DNA提取方法；有較好的通用性，僅一次提取即得到高質量的 模板DNA，在對16S rRNA基因的擴增中，所有提取的DNA模板均能成功進行擴增。得到與預 計大小相同的1500bp產物，且濃度大、特異性強，測序結果證實了提取的可靠性和真實性。
本發明得到的產物DNA片段大於20Kb，可進行基因擴增和測序。本發明通用性好， 適用於各種甲殼類水產動物腸道微生物DNA提取。
圖1為對蝦腸道微生物DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜(其中M為1Kb DNAladder)。
圖2為日本對蝦16S rDNA基因的濃度梯度PCR結果(其中模板濃度依次為稀釋 20倍分別取1 ii L， 2 ii L， 4 ii L， 8 ii L以及原樣1 ii L， 2 ii L。 M為DL2000 plus DNA ladder)。
具體實施方式
實施例1 以南美白對蝦為例；取對蝦腸道放入無水乙醇中，凍於_80°C ;取蝦腸0. 02g，液氮 下研磨，加入總量lmL PBS和20 ii L 20 % (體積比)PVPP勻漿，250 y L 0. 5 % (體積比) Tween-80，吹打洗脫3min，所述PBS溶液，其成分為2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaCl， 2.7mM KCl，pH=7.4。而後以200g離心6min，取上清菌液待用，沉澱中加lmL PBS再以 200g離心後取上清菌液，將兩次上清菌液合併；將合併的上清菌液以300g離心6min，取上 清菌液；所得上清菌液再以1200g離心6min，收集上清菌液，並用PBS洗滌2次；得到的上清 菌液中加130 ii L CTAB提取液和10 ii L溶菌酶，放入37。C搖床，振蕩30min ;而後再加15 y L 20% (W/C)SDS和lOii L蛋白酶K，65t:水浴2h ;所述水浴時每隔15min將離心所得上清菌液上下翻轉混勻。水浴後以4°C 3200g離心lOmin，取上清菌液；並在上清菌液中加100 y L CTAB液禾口 25 ii L 20% SDS，渦旋，65。C水浴lOmin ;水浴後以3200g離心8min，取上清菌液; 而後在上清菌液中加入等體積的酚/氯仿混合液，再以14000g離心15min，取上清菌液；在 上清菌液中加0. 7倍體積的異丙醇，-2(TC靜置lh ;而後以4°C 14000g離心15min，取沉澱； 在沉澱中加入600iiL 70%預冷乙醇，並以14000g離心10min，取沉澱，即為對蝦腸道微生 物DNA ;將所得沉澱對蝦腸道微生物DNA在超淨臺下乾燥，加50 ii L TE重懸，凍於-8(TC備 用(參見圖1中K1所示)。所述TE溶液成分為100mM Tris， lmM EDTA， 0. 1 % RNase， pH = 8. 0
所述CTAB提取液，其成分為100mM Tris-HCl， 100mM EDTA， 100mM磷酸鈉，1. 5M NaCl， 1% CTAB， pH = 8. 0 ;所述溶菌酶濃度為50mg/mL ;所述蛋白酶K濃度為20mg/ml。
實施例2 以中國明對蝦為例，取對蝦腸道放入無水乙醇中，凍於_80°C ;取蝦腸0. 05g，液氮 下研磨，加入總量O. 8mL PBS和15iiL 20% (體積比)PVPP勻漿，200 y L 0.5% (體積比) Tween-80，吹打洗脫5min，所述PBS溶液，其成分為2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaCl， 2. 7mMKCl，pH = 7. 4。而後以200g離心10min，取上清菌液待用，沉澱中加0. 8mL PBS再以 200g離心後取上清菌液，將兩次上清菌液合併；將合併的上清菌液以300g離心10min，取 上清菌液；所得上清菌液再以1200g離心10min，收集上清菌液，並用PBS洗滌3次；得到的 上清菌液中加100 ii L CTAB提取液和15 ii L溶菌酶，放入37。C搖床，振蕩40min ;而後再加 20 ii L 20% (W/C) SDS禾P 15 y L蛋白酶K， 70。C水浴lh ;所述水浴時每隔15min將離心所得 上清菌液上下翻轉混勻。水浴後以4°C 3200g離心15min，取上清菌液；並在上清菌液中加 150 ii L CTAB液和20ii L 20% SDS，渦旋，67。C水浴15min ;水浴後以3200g離心15min，取 上清菌液；而後在上清菌液中加入與其等體積的酚/氯仿混合液(酚/氯仿按25 : 24v混 合)，再以14000g離心10min，取上清菌液；在上清菌液中加其0. 6倍體積的異丙醇，_20°C 靜置2h ;而後以4t: 14000g離心15min，取沉澱；在沉澱中加入800 y L 70%預冷乙醇，並以 14000g離心10min，取沉澱，即為對蝦腸道微生物DNA ;將所得沉澱對蝦腸道微生物DNA在 超淨臺下乾燥，加50yL TE重懸，凍於-8(TC備用(參見圖1中K2所示)。
實施例3 以日本對蝦為例，取對蝦腸道放入無水乙醇中，凍於-8(TC ;取蝦腸0.01g，液氮下 研磨，加入總量1.2mL PBS禾P25iiL 20% (體積比)PVPP勻漿，300 y L 0.5% (體積比) Tween-80，吹打洗脫4min，所述PBS溶液，其成分為2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaCl， 2. 7mMKCl， pH = 7. 4。而後以200g離心8min，取上清菌液待用，沉澱中加1. 2mL PBS再以 200g離心後取上清菌液，將兩次上清菌液合併；將合併的上清菌液以300g離心8min，取上 清菌液；所得上清菌液再以1200g離心8min，收集上清菌液，並用PBS洗滌2次；得到的上清 菌液中加150 y L CTAB提取液和12 y L溶菌酶，放入37"搖床，振蕩35min ;而後再加18 y L 20% (W/C)SDS和13ii L蛋白酶K，60。C水浴1. 5h ;所述水浴時每隔15min將離心所得上清 菌液上下翻轉混勻。水浴後以4°C 3200g離8min，取上清菌液；並在上清菌液中加130 y L CTAB液和23iiL 20% SDS，渦旋，60。C水浴12min ;水浴後以3200g離心10min，取上清菌液; 而後在上清菌液中加入等體積的酚/氯仿混合液，再以14000g離心12min，取上清菌液；在 上清菌液中加0. 8倍體積的異丙醇，-20"靜置1. 5h ;而後以4°C 14000g離心15min，取沉澱；在沉澱中加入700 ii L 70%預冷乙醇，並以14000g離心10min，取沉澱，即為對蝦腸道微 生物DNA ;將所得沉澱對蝦腸道微生物DNA在超淨臺下乾燥，加50 ii L TE重懸，凍於_80°C 備用(參見圖1中K3所示)。 以上述提取的基因組DNA為模板，擴增16S rDNA基因，PCR擴增引物為 27F(5' -AGAGTTTGATCMTGGCTC-3， ；M = A或C) ， 1387R(5' -GGGCGGWGTGTACAAGGC-3' ;W = A 或T)。PCR反應體系為:無菌雙蒸水34. 5iiL，10XPCR緩衝液5iiL，2. 5mmol/L dNTP 4yL， 2. 5iimol/LPCR引物各2ii L，Taq酶O. 5ii L，模板DNA2ii L。PCR反應條件94。C預變性4min ; 94°C lmin， 65°C 45s， 72°C 45s，退火溫度每個循環降低1 °C ，當退火溫度降至55°C後，再以該 溫度擴增25個循環；最後72t:補平10min。 PCR產物用1. 0%的瓊脂糖凝膠進行電泳(參 見圖2)。 從圖2可知，本發明僅一次提取即得到高質量的模板DNA，在對16SrRNA基因的擴 增中，所有提取的DNA模板均能成功進行擴增。得到與預計大小相同的1500bp產物，且濃 度大、特異性強，本發明方法提取的DNA可以應用於分子生態學研究。 從上述結果可以看出，本發明方法不僅可以得到質量較好的DNA，而且此DNA用於
16S rDNA的PCR擴增，得到了特異性較好的產物。此外，本發明方法不需要額外的儀器設
備，因此本發明方法可以成為腸道微生物分子生態學研究中的一種簡單易行、高質量、低成
本的腸道微生物DNA提取技術。 SEQUENCE LISTING 〈110〉中國科學院海洋研究所 〈120〉 一種對蝦腸道微生物DNA的提取方法 〈130〉 〈160>3 〈170〉Patentln version 3. 1 〈210>1 〈211>18 〈212>DNA 〈213〉人工設計 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (1) (18) 〈223>M = A或C 〈400〉 1 aga gtt tga tcm tgg etc 18 Arg ValXaa Trp Leu 1 5 〈210>2 〈211>18 〈212>DNA 〈213〉人工設計
〈220〉 〈221>CDS 〈222>(1). . (18) 2 ggg egg wgt gta caa ggc 18 Gly Arg Xaa Val Gin Gly 1 5 〈210>3 〈211>6 〈212>PRT 〈213〉人工設計 〈220〉 〈22 l>misc—feature 〈222〉 (3). . (3) 〈223>The， Xaa， at location 3 stands for Ser， or Cys. 〈400>3 Gly Arg Xaa Val Gin Gly 1 權利要求
一種對蝦腸道微生物DNA的提取方法，其特徵在於1)將0.01-0.05g對蝦腸道在液氮下研磨，並加入0.8-1.2mL PBS、15-25μL PVPP勻漿和200-300μL 0.5％Tween-80，均勻後吹打洗脫3-5min；2)將洗脫液在200g離心5-10min，取上清菌液待用；沉澱中加0.8-1.2mL PBS以200g離心取上清菌液，將兩次離心所得上清菌液合併，合併上清液以300g離心5-10min，取上清菌液待用；3)將步驟2)所得上清菌液以1200g離心5-10min，收集上清菌液；4)將步驟3)所得上清菌液中加100-150μLCTAB提取液和10-15μL溶菌酶，放入37℃搖床，振蕩30-40min；而後加15-20μL 20％(W/C)SDS和10-15μL蛋白酶K，60-70℃水浴1-2h；5)將水浴後菌液在4℃ 3200g離心8-15min，取上清菌液，而後加100-150μL CTAB液和20-25μL 20％SDS混勻後，渦旋，60-70℃水浴10-15min；6)將水浴後菌液以3200g離心8-15min，取上清菌液，而後加入與上述上清菌液等體積的酚/氯仿混合液，14000g離心10-15min，取上清菌液待用；7)將步驟6)所得上清菌液中加上清菌液體積0.6-0.8倍的異丙醇，而後於-20℃靜置1-2h，再以4℃ 14000g離心10-15min，所得沉澱待用；8)將步驟7)所得沉澱中加入600-800μL 70％預冷乙醇，14000g離心10-15min，所得沉澱即為對蝦腸道微生物DNA。
2. 根據權利要求1所述的對蝦腸道微生物DNA的提取方法，其特徵在於所述所得對 蟲下腸道微生物DNA在超淨臺下乾燥，加50 LTE重懸，凍於-S(TC備用。
3. 根據權利要求2所述的對蝦腸道微生物DNA的提取方法，其特徵在於所述TE溶液 成分為lOOmM Tris， ImM EDTA， 0. 1 % RNase， pH = 8. 0
4. 根據權利要求1所述的對蝦腸道微生物DNA的提取方法，其特徵在於所述步驟1) 中PBS溶液，其成分為2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaCl，2. 7mM KCl， pH = 7. 4。
5. 根據權利要求1所述的對蝦腸道微生物DNA的提取方法，其特徵在於所述對蝦腸 道放入無水乙醇中，凍於-S(TC保存待用。
6. 根據權利要求1所述的對蝦腸道微生物DNA的提取方法，其特徵在於所述步驟3) 離心後所得上清菌液用PBS洗滌2-3次。
7. 根據權利要求1所述的對蝦腸道微生物DNA的提取方法，其特徵在於所述步驟 4)中CTAB提取液，其成分為lOOmM Tris-HCl， lOOmM EDTA， lOOmM磷酸鈉，1. 5M NaCl，l% CTAB， pH = 8.0 ;所述步驟4)中溶菌酶濃度為50mg/mL ;所述步驟4)中蛋白酶K濃度為 20mg/ml。
8. 根據權利要求1所述的對蝦腸道微生物DNA的提取方法，其特徵在於所述步驟4) 水浴時每隔15min將離心所得上清菌液上下翻轉混勻。
全文摘要
本發明屬於微生物學和分子生態學領域，具體涉及一種對蝦腸道微生物DNA的提取方法。具體為過程採用液氮研磨，機械力破壁，溶菌酶，SDS裂解液裂解細胞，然後經分離、析出得到DNA沉澱，最後用TE溶解得到質量較好的DNA。本發明得到的產物DNA片段大於20Kb，可進行基因擴增和測序。本發明通用性好，適用於各種甲殼類水產動物腸道微生物DNA提取，僅一次提取即得到高質量的模板DNA，不需要重複實驗，所獲得的DNA可用於分子生態學、系統進化等研究。
文檔編號C12N15/10GK101748118SQ20091026366
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月18日 優先權日2009年12月18日
發明者劉梅, 劉淮德, 王寶傑, 王雷, 蔣克勇 申請人:中國科學院海洋研究所