一種丁二酸的發酵生產工藝的製作方法

2023-06-02 06:58:56

專利名稱：一種丁二酸的發酵生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物發酵技術領域，具體涉及丁二酸的發酵生產工藝。
背景技術：
丁二酸又稱琥珀酸，是一種重要的C4平臺化合物，是一種常用的工業原料，廣泛 用於合成塑料、橡膠、染料、製藥、食品加工和其它領域中，現有的市場規模超過400萬噸/每年。傳統的丁二酸生產方法，是使用不可再生的化石原料，經化學合成而來；由於化石 原料的匱乏以及不可再生性，限制了丁二酸的進一步應用。丁二酸也可以由微生物使用可 再生資源葡萄糖、秸稈等為原料，經生物加工固定CO2合成；由於發酵法效率高、可減緩溫室 效應以及原料可持續利用等優點，正被廣泛深入的研究。然而目前只有食品行業的丁二酸 是發酵生產的，若降低微生物發酵法生產丁二酸的成本，實現用丁二酸取代很多基於苯和 石化中間產物的商品，這不僅可以減少超過250種苯基化學製品的生產和消費過程中所產 生的汙染，還可以緩解石油化石資源的壓力，實現可持續發展，進一步擴大丁二酸的市場容 量。目前已經報導的用於發酵產丁二酸菌種主要有A. succiniciproducens, E. coli, C. glutamicum, M. succiniciproducens, A. succinogenes。這些微生物都是通過糖酵解途 徑，分解葡萄糖生成丙酮酸等中間體，再經羧化酶固定CO2生成草醯乙酸，進一步生成蘋果 酸、富馬酸，最終還原成丁二酸。研究表明，在CO2供給不足的情況下，丁二酸的產量明顯降 低，而主要生成副產物乳酸、乙酸，而CD2主要通過添加MgCO3, CaCO3, Na2CO3, NaHCO3 (持續通 CO2並同時利用NaOH調節pH固定CO2)等碳酸鹽的方式來供給。目前，NaHCO3或者Na2CO3 (持續通(X)2並同時利用NaOH調節pH固定CO2)由於其 生產效率高，效果好等優點已被廣泛用於發酵產丁二酸。但是由於其發酵終點含有大量鈉 鹽，造成鈉鹽汙染，增加發酵終點廢液處理的成本，同時大規模的發酵生產丁二酸需要大量 的碳酸鹽或者NaOH，選擇低廉、可回收利用的碳酸鹽成為降低工業生產成本的關鍵因素。

發明內容
本發明所要解決的問題是提供一種丁二酸的發酵生產工藝，該工藝使用可回收利 用的碳酸鹽以降低經濟成本，利於廢液處理。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下一種丁二酸的發酵生產工藝，以穀氨酸棒桿菌為生產菌株，先進行好氧富集，再進 行厭氧發酵生產丁二酸，在厭氧發酵過程中CO2的提供以添加NH4HC03、或(NH4)2C03、或NH4OH 與(X)2的形式，或上述三種形式中任意兩種或三種的組合。其中，好氧富集階段的發酵條件為30 35°C下好氧發酵12 14h，通氣1 2v/ vm、攪拌轉速為300 600rpm。其中，好氧富集階段，發酵培養基包括如下組分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/L, KH2PO4 0. 5g/L，無水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2 lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L，生物素 0. 2mg/L，維生素 Bl 200 μ g/L, 初始pH 6.5。其中，厭氧發酵生產丁二酸階段是在好氧富集階段結束後，在培養基中繼續添加 葡萄糖至30 90g/L ；同時添加NH4HCO3、或(NH4) 2C03、或NH4OH與CO2,或上述三種形式中任 意兩種或三種的組合，其添加總量約為30 100g/L ；30 35°C下厭氧發酵12 40h，攪拌 轉速為300 600rpm，發酵生產丁二酸。優選的，NH4OH與(X)2的摩爾比相同。冊4!10)3、或(NH4)2CO3、或NH4OH與(X)2在發酵法生產丁二酸的工業生產中具有很大 的市場潛力，主要表現在首先，目前NH3的合成技術趨於成熟，年產量大，使得NH4HCO3、或 (NH4) 2C03、或利用NH4OH固定(X)2生成NH4HCO3具有很大的儲備量，保證其在碳酸氫鹽化學物 質中價格最低；其次，發酵終點時採用膜分離法，將發酵液經微濾、超濾後，得到澄清的琥珀 酸溶液，利用鹽酸調節PH2. 0 3. 5，濃縮結晶得到琥珀酸晶體，同時得到高純度的NH4Cl晶 體，可循環利用於其他工業生產，廢液經蒸髮結晶後作為氮肥應用為農業生產中，不僅降低 了工業生產丁二酸的成本，還幾乎對環境不造成壓力。因此在工業生產中使用NH4HCO3、或 (NH4)2C03、或者考慮使用NH4OH固定CO2，調控pH發酵生產丁二酸具有很大社會和經濟效益。工業中使用的產丁二酸菌株大多數不耐受高濃度的銨鹽，如高濃度的NH4+影響 E. coli和A. succinogenes生長和抑制丁二酸的合成代謝。主要是因為在高濃度的NH4+環 境下，一方面細胞為了維持胞內PH的穩定，需要供應更多的能量，不利於細胞的生長甚至 導致細胞的死亡；另一方面NH4+通過作用於糖代謝途徑中的多個位點抑制細胞的合成代 謝，影響丁二酸的生產強度以及產率。而申請人意外發現穀氨酸棒桿菌卻可以在高濃度的 銨鹽環境下生長，厭氧條件下分解葡萄糖主要生成丁二酸，副產物種類少產量低，整個產丁 二酸的過程為淨消耗。這些優勢使得穀氨酸棒桿菌具有良好的丁二酸生產潛力。有益效果本發明與現有技術相比具有如下優勢1、與其他菌種相比，穀氨酸棒桿菌具有很高的NH4+耐受性，這為使用以NH4HCO3形 式固定(X)2提供了前提。2、與NaHCO3, MgCO3, CaCO3等其他中和劑相比，NH4HCO3價格低廉，工業生產上能夠 降低生產成本，並且以NH4OH來固定(X)2發酵生產，方法簡便，進一步降低成本，帶來巨大的 經濟效益。3、利用本發明的方法，最終回收有機酸時，避免大量金屬離子的汙染處理問題，同 時可以回收利用NH4Cl,或者由於廢液成分簡單，可以製成氮肥，用於農業生產，從而在產品 處理上節約成本，同時降低環境汙染。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 將穀氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032)活化後，按照 3%
4(ν/ν)接種量轉接入3L發酵培養基，通空氣lv/vm，轉速500rpm，30°C，好氧發酵1 後，補 加至30g/L的葡萄糖與40g/L的NH4HCO3,轉入厭氧發酵，轉速200rpm，溫度控制在30°C。厭 氧發酵Uh。其中，發酵培養基包括如下組分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，無水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L，初始 ρΗ6· 5。發酵結果，主要轉化產物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產量分別為14. 93g/L、2. 37g/ L、9. 63g/L，丁二酸生產強度為 1. Mg*!/1*!!-1，丁二酸綜合質量產率為 0. 51g/g (glucose)。實施例2 將穀氨酸棒桿菌(保藏號為CGMCC NO. 3991)活化後，按照3% (ν/ν)接種量轉接 入3L發酵培養基，通空氣lv/vm，轉速500rpm，30°C，好氧發酵1 後，補加至80g/L的葡萄 糖與30g/L的NH4HCO3,轉入厭氧發酵，轉速200rpm，溫度控制在30°C，並以2. Sg^L"1^1的 流量流加NH4HCO3,厭氧發酵40h。其中，發酵培養基包括如下組分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，無水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L,初始 ρΗ6· 5。發酵結果，主要轉化產物為乙酸和丁二酸，其產量分別為11.56g/L和55.47g/L， 丁二酸的生產強度為1. Sgg^-Sh-1, 丁二酸綜合質量產率為0. 70g/g (glucose)。實施例3 將穀氨酸棒桿菌(保藏號為CGMCC NO. 3991)活化後，按照3% (ν/ν)接種量轉接 入3L發酵培養基，通空氣lv/vm，轉速500rpm，30°C，好氧發酵1 後，補加至60g/L的葡萄 糖與30g/L的NH4HCO3,轉入厭氧發酵，轉速200rpm，溫度控制在30°C，持續通CO2，並以NH4OH 調節PH值固定CO2，控制pH值為7. 0，厭氧發酵36h。其中，發酵培養基包括如下組分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，無水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L,初始 ρΗ6· 5。發酵結果，主要轉化產物為乙酸和丁二酸，其產量分別為8. 62g/L和41. 32g/L，丁 二酸的生產強度為1. ISg^-Sh-1, 丁二酸綜合質量產率為0. 69g/g (glucose)。實施例4 將穀氨酸棒桿菌(保藏號為CGMCC N0. 3991)活化後，按照3% (ν/ν)接種量轉接 入3L發酵培養基，通空氣lv/vm，轉速500rpm，30°C，好氧發酵1 後，補加至30g/L的葡萄 糖與30g/L的(NH4)2CO3,轉入厭氧發酵，轉速200rpm，溫度控制在30°C，厭氧發酵20h。其中，發酵培養基包括如下組分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，無水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L,初始 ρΗ6· 5。發酵結果，主要轉化產物為乙酸和丁二酸，其產量分別為5. 53g/L和20. 63g/L，丁 二酸的生產強度為1. OSg^-1*!!-1, 丁二酸綜合質量產率為0. 69g/g (glucose)。實施例5 將穀氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum 1006)活化後，按照 3% (ν/ν)接種量轉接入3L發酵培養基，通空氣lv/vm，轉速500rpm，30°C，好氧發酵1 後，補加至30g/ L的葡萄糖，轉入厭氧發酵，轉速200rpm，溫度控制在30°C，並將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣 速率流入發酵罐的厭氧發酵培養基中，同時以NH4OH調節pH值，控制pH值為7. 0，厭氧發酵 1 後，補加葡萄糖至30g/L，厭氧發酵觀小時後，繼續補加葡萄糖至30g/L，厭氧發酵50h。其中，發酵培養基包括如下組分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，無水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L，初始 ρΗ6.5。發酵結果，主要轉化產物為乳酸，乙酸和丁二酸，其產量分別為37. 59g/L， 12. 12g/L和33. 73g/L，丁二酸的生產強度為0. eTg^-1^-1, 丁二酸綜合質量產率為0. 40g/ g(glucose)。
權利要求
1.一種丁二酸的發酵生產工藝，以穀氨酸棒桿菌為生產菌株，先進行好氧富集，再 進行厭氧發酵生產丁二酸，其特徵在於在厭氧發酵過程中CO2的提供以添加NH4HCO3、或 (NH4)2CO3、或NH4OH與CO2的形式，或上述三種形式中任意兩種或三種的組合。
2.根據權利要求1所述的丁二酸的發酵生產工藝，其特徵在於好氧富集階段的發酵條 件為30 :35°C下好氧發酵12 14h，通氣1 2v/vm、攪拌轉速為300 600rpm。
3.根據權利要求1所述的丁二酸的發酵生產工藝，其特徵在於好氧富集階段，發酵培 養基包括如下組分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/L，KH2PO4O. 5g/L，無水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2 lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L，生物素 0. 2mg/L，維生素 Bl 200μ g/L，初始 pH 6. 5。
4.根據權利要求1所述的丁二酸的發酵生產工藝，其特徵在於厭氧發酵生產丁二酸階 段是在好氧富集階段結束後，在培養基中繼續添加葡萄糖至30 90g/L ；同時添加NH4HC03、 或(NH4)2CO3、或NH4OH與CO2,或上述三種形式中任意兩種或三種的組合，其添加總量約為 30 100g/L，30 :35°C下厭氧發酵12 40h，攪拌轉速為300 600rpm，發酵生產丁二酸 酸。
5.根據權利要求1或4所述的丁二酸的發酵生產工藝，其特徵在於NH4OH與(X)2的摩 爾比相同。
全文摘要
本發明公開了一種丁二酸的發酵生產工藝，以穀氨酸棒桿菌為生產菌株，先進行好氧富集，再進行厭氧發酵生產丁二酸，在厭氧發酵過程中CO2的提供以添加NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或NH4OH與CO2的形式，或上述三種形式中任意兩種或三種的組合。利用本發明的方法，最終回收有機酸時，避免大量金屬離子的汙染處理問題，同時可以回收利用NH4Cl，或者由於廢液成分簡單，可以製成氮肥，用於農業生產，從而在產品處理上節約成本，同時降低環境汙染。
文檔編號C12P7/46GK102146422SQ201110025759
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月24日 優先權日2011年1月24日
發明者嚴明, 安明東, 李豔, 歐陽平凱, 蔡萍, 許晟, 郝寧, 郝思清 申請人:南京工業大學