替度魯肽在促進幼齡反芻動物小腸發育中的應用的製作方法
2023-06-02 07:36:06
本發明涉及胰高血糖素樣肽-2(glp-2)的替代物替度魯肽，具體涉及替度魯肽在幼齡反芻動物上促進小腸發育中的應用。
背景技術：
幼齡反芻動物胃腸道的生長發育不但對動物各種生理功能的完善有重要的意義，而且對成年後的健康及生產性能具有重要的影響。近年來，營養與胃腸道健康一直是國內外營養學家關注的熱點。但是，較多研究關注營養素對幼齡反芻動物例如犢牛和羔羊瘤胃發育及功能完善的調控作用，而對小腸發育的調控關注相對較少。許多研究發現小腸可消化澱粉轉化為體脂肪的效率明顯高於瘤胃澱粉，同時腸澱粉對體蛋白沉積有明顯調控效應。因此，腸道的發育及其對營養物質的消化吸收效率可能是影響反芻動物生產性能的重要潛在因素。另外一方面，反芻動物的小腸也起著重要的屏障和免疫作用。基於此，通過相應調控手段促進幼齡反芻動物小腸的生長發育對保證其早期斷奶後的腸道健康，降低腹瀉率及提高成年後的生產性能具有重要的意義。
胰高血糖素樣肽-2(glp-2)是一種由腸l內分泌細胞分泌的由33個胺基酸組成的腸上皮特異性生長因子，其分泌受腸道營養素和營養水平的調控。glp-2的功能包括促進腸道發育、增強腸道屏障功能、增加血液流量及抗炎症作用等，而其中最主要的功能就是特異性地促進腸黏膜生長與損傷後修復。l細胞分泌的glp-2胺基酸序列seqidno.1如下所示：
h-his-ala-asp-gly-ser-phe-ser-asp-glu-met-asn-thr-ile-leu-asp-asn-leu-ala-ala-arg-asp-phe-ile-asn-trp-leu-ile-gln-thr-lys-ile-thr-asp-oh；
但是，glp-2被分泌後迅速地被glp-2的降解物(二肽基肽酶ⅳ)在n端的2位丙氨酸(ala)處切割，形成無活性的glp-2(3-33)。除了腎清除之外，glp-2(1-33)的這種快速酶降解導致該肽的半衰期為約7分鐘。所以尋求一種持續高效的glp-2替代物代替glp-2發揮作用，對出生後到斷奶前的幼齡反芻動物小腸發育具有十分重大的意義。
替度魯肽做為一種新藥，對短腸症候群腸衰竭而依賴靜脈營養的患者有顯著療效。每日注射一次替度魯肽可有助於提高腸道對液體和營養物質的吸收，降低腸外營養的頻率以及供給量。目前還沒有關於替度魯肽用於促進幼齡反芻動物小腸發育的報導。
發明目的
技術實現要素：
：針對現有技術存在的問題，本發明提供替度魯肽在促進幼齡反芻動物小腸發育中的應用。本發明提出了一種替度魯肽的新功能，可以作為glp-2替代物促進幼齡反芻動物小腸發育，同時解決glp-2存在的穩定性、有效性不足等問題。
技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述的替度魯肽在促進幼齡反芻動物小腸發育中的應用。
進一步地，所述替度魯肽作為胰高血糖素樣肽-2替代物在在促進幼齡反芻動物小腸發育中的應用。
進一步地，所述幼齡反芻動物為羔羊或犢牛。
更進一步地，所述的動物的生長階段為出生後到斷奶前。
作為優選，所述替度魯肽通過注射促進幼齡反芻動物小腸發育。
進一步地，所述替度魯肽溶於牛血清白蛋白的按50-60ug/kg動物體重注射幼齡反芻動物腹腔皮下。即按幼齡反芻動物體重，每kg需要注射50-60ug替度魯肽；優選按50ug/kg動物體重注射腹腔皮下。
本發明是所使用的的原料和儀器都是市售可得。
替度魯肽由南京肽業生物科技有限公司合成
牛血清白蛋白(bsa)購自南京建成生物有限公司
可攜式ph計(hi9024c；hannainstruments，美國)
血漿血糖試劑盒購自上海榮盛生物藥業有限公司
glp-2螢光酶免疫試劑盒購自德國phoenixeuropegmbh
反轉錄試劑盒購自takara公司
q5real-timepcr儀(appliedbiosystems，美國)。
有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下優點：
本發明提出了一種替度魯肽的新功能，可以作為glp-2替代物促進幼齡反芻動物小腸發育，替度魯肽的胺基酸序列的第二個胺基酸為gly，而glp-2胺基酸序列的同等位置胺基酸為ala，這個差異不但不會造成與glp-2功能的差異，而且還會避免被glp-2的降解物(二肽基肽酶ⅳ)降解，持續高效的發揮作用，並且具有穩定、高效的優勢。glp-2注射到幼齡反芻動物體內半衰期是7min，1小時，藥效就基本消失，而替度魯肽半衰期可達到3-5小時，藥效可持續15-25小時。
本發明通過注射替度魯肽調節幼齡反芻動物細胞周期蛋白和相關依賴性激酶的表達推動細胞周期進程促進小腸上皮的發育、增強小腸屏障功能；從而防護腸道上皮屏障來預防羔羊等幼齡反芻動物腹瀉的發生，提高羔羊等幼齡反芻動物的成活率，有利於幼齡反芻動物斷奶前期腸道發育，減弱斷奶應激。
附圖說明
圖1為替度魯肽注射對羔羊體重變化的影響關係圖；
圖2為替度魯肽注射對羔羊小腸上皮細胞周期蛋白mrna相對表達量的影響關係圖；
圖3為替度魯肽注射對羔羊小腸上皮gcg、glp-2r、igf-1及igf-1rmrna相對表達量的影響關係圖。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本發明做進一步說明。
實施例1
試驗選擇10隻體況良好，胎次一致，體重相近的新生羔羊(湖羊)，隨機分為對照組和替度魯肽處理組，每組5隻。10日齡時，羔羊開始補飼精料補充料，自由飲水，自由採食苜蓿和燕麥乾草，每周監測羔羊體重變化。羔羊28日齡時試驗開始，將4mg替度魯肽溶於50ml含有0.5％的牛血清白蛋白溶液中(0.5％bsa溶液是按質量體積比將bsa溶於生理鹽水mg/ml)配製成80ug/ml的替度魯肽溶液，處理組羔羊按替度魯肽比羔羊體重為50μg/kg將替度魯肽溶液注射腹腔皮下；對照組羔羊腹腔皮下注射等體積的不含替度魯肽的0.5％牛血清白蛋白溶液，每隔12小時注射1次，連續注射14天。試驗開始前，兩組羔羊的體重沒有顯著差異(6.18±0.47vs.5.80±0.26kg，p＝0.504)。替度魯肽由南京肽業生物科技有限公司合成，牛血清白蛋白(bsa)購自南京建成生物有限公司。精料補充料開食料依據湖羊開食料營養需要標準(ny/y816-2004；中國農業部,2004)設計開食料配方，組成見表1。
表1試驗開食料組成與營養水平
實施例2
實施例2採用是相同的試驗方法，不同之處在於試驗對象為體重相近的新生犢牛，處理組按替度魯肽比犢牛體重為60μg/kg將實施例1製備的替度魯肽溶液注射到犢牛腹腔皮下。
實施例3
試驗期間每周監測實施例1的對照組和試驗組羔羊體重變化，結果如圖1所示。在整個試驗期間兩組羔羊體重無顯著差異。
實施例4
取實施例1的羔羊42日齡時，早晨飼餵兩小時後進行屠宰，屠宰前頸靜脈採血，血液在1000g4℃離心15min儲存在-20℃用於血常規檢測。屠宰後立即分離瘤胃和小腸並稱重，收集有代表性的瘤胃內容物測定ph值，測定完ph值後的瘤胃內容物四層紗布過濾收集瘤胃液，-20℃保存待測揮發性脂肪酸濃度。採集具有代表性的十二指腸、空腸和迴腸組織在冰的磷酸緩衝溶液裡清洗3次後，剪成0.5cm×0.5cm的小碎塊裝入凍存管置於液氮保存，用於後續rna的提取。
實施例5
檢測替度魯肽注射對羔羊各器官重量的影響：
在羔羊42日齡時屠宰採樣，羔羊屠宰後立即分離各器官並稱重，結果如表2所示。
表2替度魯肽注射對羔羊各器官重量的影響
註：數據以平均值±標準誤形式表示，n＝5
由表2可知，與對照組羔羊相比，試驗組羔羊空腸重和迴腸重有升高的趨勢，而瘤胃溼重、瘤胃乾重、瓣胃溼重、瓣胃乾重、十二指腸重、盲腸重、結腸重及肝臟重與對照組相比差異不顯著。上述結果表明，替度魯肽可促進了羔羊空腸和迴腸的發育。
實施例6
對實施例4的血液進行血常規檢測以及瘤胃內容物測定ph值，考察替度魯肽注射對羔羊瘤胃和血液參數的影響，結果如表3所示。
血常規分析的血漿血糖試劑盒購自上海榮盛生物藥業有限公司；glp-2螢光酶免疫試劑盒購自德國phoenixeuropegmbh。血糖和glp-2試劑盒的測量範圍分別是3.89～6.11mmol/l和0-10000pg/ml。
瘤胃生理參數測定，用可攜式ph計(hi9024c；hannainstruments,美國)測定瘤胃ph值。氣相色譜測定(gc-14b,島津,日本；毛細管柱:30m×0.32mm×0.25mm膜厚度)vfa濃度，參照秦為琳(應用氣相色譜測定瘤胃揮發性脂肪酸方法的研究改進.南京農業大學學報,1982(4):110-116.)的方法(柱溫＝110℃,汽化室溫度＝180℃,檢測器＝180℃)。
表3替度魯肽注射對羔羊瘤胃參數和血液參數的影響
如表3所示，體外注射替度魯肽顯著提高了羔羊血漿中glp-2濃度；但對羔羊瘤胃ph值、總vfa濃度、乙酸濃度、丙酸濃度、丁酸濃度、其他vfa濃度、乙丙比及血漿血糖濃度沒有顯著影響。上述結果說明體外皮下注射的glp-2替代物替度魯肽被羔羊吸收入血，通過血液運輸到達胃腸道進而發揮作用，但對羔羊瘤胃發酵及機體對葡萄糖的吸收無顯著性影響。
實施例7
替度魯肽注射對羔羊小腸上皮mrn相對表達量的影響。
rna的提取和cdna的合成：提取實施例4得到小腸上皮總rna，使用nanodrop分光光度計檢測rna的濃度和純度。所有樣品的吸收比例(260/280nm)都在1.8～2.0之間，證明rna純度較高。用1.4％的瓊脂糖膠檢測rna的完整性。將所有的rna濃度調整到1μg/μl，置於-80℃冰箱保存備用。利用購自takara公司含基因組rna酶的反轉錄試劑盒進行cdna的合成。
引物的合成和實時定量pcr：利用q5real-timepcr儀(appliedbiosystems，美國)對目的基因及內參基因gapdh、18srrna進行定量，gapdh引物序列參照wang等(wanga,guz,heidb,etal.identificationandcharacterizationofthebovinegprotein-coupledreceptorgpr41andgpr43genes1[j].journalofdairyscience,2009,92(6):2696-2705.)，實時定量pcr分析所用引物採用primer5.0軟體自行設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物sqeidno.2-29，如表4所示。sybr購自takara公司，反應條件為：95℃30s預變性，95℃5s，60℃30s，重複40個循環，95℃，15s；60℃，1min；95，15s。反應體積20μl：10.4ulsybr，10umol/l上下遊引物各0.4ul，2ul樣品cdna以及6.8ul無菌水。所有樣品設3個重複。目的基因的相對表達量以管家基因gapdh作為內參進行校正，數據分析採用2-△△ct的方法。
表4擴增引物序列
結果以平均值±標準誤(means±se)進行表示。數據採用spss20.0中的獨立樣本t檢驗進行顯著性分析。採用graphpadprism6.01(www.graphpad.com)軟體分析目的基因的mrna表達量。p<0.05表示差異顯著。
替度魯肽注射對羔羊小腸上皮細胞周期蛋白mrna相對表達量的影響：細胞周期的推進主要受細胞周期蛋白(cyclins)及其相關的激酶(cdks)的調控，所以cyclins和cdks的表達情況會影響細胞周期進程。兩組羔羊小腸上皮細胞周期蛋白和相關依賴性激酶的實時定量pcr結果如圖2所示，與對照組相比，替度魯肽試驗組顯著升高了十二指腸cyclinb、cyclind1、cdk1及cdk6的mrna表達量；空腸cyclina,cyclinb1,cdk1,cdk4和cdk6的mrna表達量；迴腸cyclina、cyclind1、cdk2和cdk4的mrna表達量。上述結果說明，體外注射glp-2替代物替度魯肽促進了小腸上皮相關細胞周期蛋白和相關依賴性激酶的mrna表達，一定程度上推動了細胞周期進程，促進了小腸上皮的增殖。
替度魯肽注射對羔羊小腸上皮gcg、glp-2r、igf-1及igf-1rmrna相對表達量的影響：如圖3所示，與對照組相比，試驗組顯著升高了十二指腸gcg和igf-1r；空腸gcg、igf-1、igf-1r和glp-2r；迴腸gcg、igf-1、igf-1r和glp-2r的mrna表達量；但對十二指腸igf-1和glp-2r的表達沒有顯著影響。上述研究結果表明：體外注射glp-2替代物替度魯肽促進了羔羊小腸上皮glp-2受體的表達，同時促進了igf-1和igf-1受體的表達，暗示glp-2是通過igf-1信號通路調控細胞周期進程，促進了小腸上皮的增殖。同時採用實施例2犢牛為實驗對象，結果與上述實施例結果類似。
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南京農業大學
替度魯肽在促進幼齡反芻動物小腸發育中的應用
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