豬日增重tef－1基因及其在豬分子標記輔助選擇中的應用的製作方法

2023-06-02 07:40:26 1

專利名稱：豬日增重tef－1基因及其在豬分子標記輔助選擇中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物基因工程技術領域，具體涉及豬日增重TEF-1基因的克隆及其在豬分子標記輔助選擇中的應用。
背景技術：
豬肉是我國城鄉居民動物性蛋白的主要來源，我國豬肉產量和生豬飼養量居世界第一，養豬業的發展在我國具有極其重要的理論和實踐意義。近年來，豬肉一直佔肉類總產的65％左右。尤其隨著我國經濟體制的改革，農民商品意識逐步增強，養豬業正由傳統家庭副業向專業化、規模化、集約化、工廠化方向迅速發展。因此，加快遺傳育種學的發展用於支持養豬業有著極為重要的作用。
以前，豬的育種目標簡單，主要是提高生長率和降低背膘厚，隨著育種工作的進展，育種目標變得複雜，包括1，提高育肥豬的生長速度和飼料利用率，主選日增重。2，提高瘦肉率和肉質。3，提高繁殖率和育成率。
隨著人們對肉品需要量的增加，畜牧業必須縮短家畜飼養期，也就是提高豬的生長速度，對日增重進行選育，更多的為人們提供肉食產品。生長性狀屬於數量性狀，由多基因控制、並存在主基因(major gene)效應。分子生物學技術的發展，使人們可以在DNA水平尋找控制生長性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標記，在育種過程中用於標記輔助選擇(marker assistedselection，MAS)，以便提高選擇進展，更好地改善豬生長性狀，滿足人們的需要，同時獲得較大的經濟效益。
通過候選基因法，已經找到了一些影響豬的生長速度的基因。位於豬12號染色體上的生長激素基因(Growth Hormon，GH)編碼一種由豬腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的單一肽鏈蛋白質類激素，經過證實GH具有促生長作用，因此稱之為生長激素。GH是調控動物生長發育的核心，是一種具有廣泛生理功能的生長調節素，對動物的組織細胞生長與物質代謝具有極其廣泛的調節作用。豬生長激素可促進蛋白質合成和脂肪動用，顯著提高豬的生長速度、飼料報酬和瘦肉率，具有明顯的經濟效益和社會效益(邢晉瑋，2001；熊文中，1998)。
位於豬2號染色體上的胰島素樣生長因子(IGF2)是一類小分子單鏈多肽(相對分子質量7471，67個胺基酸殘基)對胚胎的生長有重要作用，Owens P C等進一步研究表明IGF2是一類多功能細胞增殖調控因子(The relationship between endogenous insulin-like growth factors andgrowth of pigs.Anim Sci，1999，77(8)2098-2103).劉鑫等對其Nci I酶切位點進行檢測，結果表明在杜洛克、長白、大白中，AA基因型比BB基因型生長速率快，生長性能指數高4.06％～8.31％。
此外，豬胰島素樣生長因子(IGF-1)，PIT1基因，肥胖基因(LEP)等均被認為與豬的生長速度有關。儘管豬日增重侯選基因的研究取得了一些重要進展，但仍然存在不足，表現在豬的重要經濟性狀通常是數量性狀，涉及到的生理生化過程相當複雜，即使同一個數量性狀，它也受多個基因的調控，儘管已揭述其1-2個受控基因，尋找具有重要生理功能基因的方法不夠全面，檢測基因的數量有限，效率不高，需要創新，仍有其它具有大效應的新基因有待發現，所以進一步尋找與豬重要經濟性狀相關新基因的工作迫在眉睫。
TEF-1是轉錄因子TEAD家族中的一員，具有TEA DNA結合結構域，TEF-1定位於豬2p14-2p17。S.S.Lee等研究了豬2號染色體上影響豬日增重的一個QTL，連鎖分析表明TEF-1位於此QTL上。TEF-1在早期就有表達，在小鼠原腸形成前期6.5天就在胎盤外層表達，8.5天就在整個胚胎表達，從10.5天開始，就在發育中的心肌和骨骼肌前體細胞中表達(Patrick Jacquemin等，A Novel Family of Developmentally Regulated Mammalian Transcription Factors Containing theTEA/ATTS DNA Binding Domain，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.271，No.36，Issue of September 6，pp.21775-21785，1996)。TEF-1幾乎出現在所有的組織，特別是腎臟，肌肉，肺和心臟，表達量較高。TEF-1基因的突變小鼠由於心臟形成缺陷導致胚胎11至12天死亡(Z Chen等Transcriptional enhancer factor 1 disruption by a retroviral gene trap leadsto heart defects and embryonic lethality in mice.GenesDevelopment.8，2293-2301)，表明TEF-1基因對肌肉的發育起著比較重要的作用。
TEF-1轉錄因子在肌肉特異基因的表達中起著比較重要的作用，TEF-1的TEA結構域能不但能與肌肉特異基因的M-CAT元件作用，還能與其他因子的MADS結構域作用調節其他的肌肉基因的表達。TEF1的TEA結構域的第二、三a螺旋在體內和體外都能與SRF轉錄因子C末端的MADS結構域結合，形成穩定的複合體，調節骨骼肌a-actin基因啟動子，還能與MEF2MADS因子作用，控制依靠MEF2的肌肉特異基因的表達。TEF-1與bHLHZ Max蛋白相互作用，結合到a-MHC(Myosin heavy-chain)基因的EM(E-box-M-CAT)motif正調控基因的表達。a-TM(tropomyosin)基因的表達需要TEF1因子的參與。TEF-1激活-myosin heavy chain基因富含A/T元件的啟動子，表明TEF-1蛋白除了具有結合MCAT元件的結合作用，很可能通過結合富含A/T元件和MEF2元件調節骨骼肌、心肌和平滑肌的基因網絡。通過以上資料我們可以得出TEF-1基因是一個重要的肌肉生長發育相關基因。因此將該基因運用在分子輔助標記選擇中具有重要的意義。但是到目前為止，國內外對豬TEF-1基因的研究還是空白。研究突變位點在群體中的多態性，並進行性狀關聯分析是研究基因功能的一個非常有力的手段。所以申請人對這個基因的部分的cDNA序列進行了多態研究和關聯分析，以期能夠發現它的功能。

發明內容
本發明的目的在於克隆豬日增重基因TEF-1，尋找TEF-1基因的突變位點以及作為豬日增重基因多態性的檢測方法，為豬的標記輔助育種提供一種有用的分子標記。
本發明是這樣實現的一種豬日增重基因TEF-1，它的部分cDNA序列如序列表SEQI D NO1所述，該基因存在選擇性剪接，有兩個剪接體，長的轉錄本含1654bp，包含1308bp的開放閱讀框，短的轉錄本為1591bp，缺少一個63bp的外顯子，包含1245bp的開放閱讀框，兩個轉錄本都包含246bp的5』非翻譯區和100bp的3』非翻譯區，其中所獲TEF-1基因cDNA序列中5』非翻譯區的第93個鹼基位點突變。
所獲得的TEF-1基因cDNA序列中有1個如序列表SEQ ID NO1所示的第93bp處有一個A93-G93的鹼基突變，導致BshN I-RFLP多態性。
一種篩選適用於豬日增重的分子標記方法，按照以下步驟用人TEF-1基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得相似性85％以上的表達序列標籤(EST)；然後拼接豬EST-重疊群；根據EST-重疊群設計引物，引物用於PCR擴增，對獲得的PCR產物純化、克隆和測序，進行序列分析，獲得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
本申請人應用上述PCR-RFLP方法對豬TEF-1基因5』非翻譯區的第93個鹼基突變進行了檢測。
以下對本發明作進一步的描述1、TEF-1基因的部分cDNA序列的克隆(1)引物設計用人TEF-1基因cDNA(GenBank收錄號NM_021961)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST資料庫中做同源序列篩選，獲得一系列相似性為85％以上的ESTs(片段長度大於100bp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查詢相應序列，然後用DNAStar中的SeqMan程序構建豬EST-重疊群。根據EST拼接序列設計引物，序列如下表1用於TEF-1基因cDNA克隆的引物序列設計

(2)PCR產物的純化、克隆和測序PCR產物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mLEpendorff管中，然後用PCR產物純化試劑盒(購自Promega公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是每100mg的凝膠中300μL的S1液，於65℃溫育10min至凝膠完全融化，將S1/DNA混合物轉入回收柱，9200g離心30s，使漿液通過Minicolumn擠出。將下面管子中的廢液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g離心15s，倒掉管中的廢液。再加入500μL的W1液，靜置1min，9200g離心30s，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，加入25μL的滅菌水或者TE液，靜置1min之後，9200g離心1min，以洗脫DNA存於Ependorff管。
連接反應將純化PCR產物與pGEM-T載體(購自Promega公司)連接，連接反應總體積是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T載體，0.5μl的純化PCR產物，0.5μl的T4連接酶，最後加入1μl滅菌水置4℃水浴過夜。
感受態細胞的製備從37℃培養了16-20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種於2ml LB中，於37℃振蕩培養3h，轉接1ml菌液於含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續在37℃振蕩培養約4h，待OD600達到0.3-0.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15min，然後將菌液轉入離心管中於4℃ 4,000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄淨培養液，用10ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉澱，冰浴30min，重複4℃ 4,000g離心10min一次，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉澱，置4℃保存備用。
轉化無菌狀態下取100-120μl感受態細胞於1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出後冰浴3-4min，加入400μl無抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養45min。取100μl塗布於已提前4h塗布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h後倒置培養。
(3)DNA序列同源性檢索鑑定通過美國國家生物技術信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網站的BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)軟體，將測序後獲得的DNA序列與GenBank資料庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑑定和獲得該DNA序列的功能信息。
(4)物理定位(1)用於物理定位的引物序列是TEF-1MF5′CACACTCTCCATGATCCAAC3′TEF-1MR5′TCACGGTTCACCCTTCTG3′該引物擴增片段長度為234bp。
(2)用於物理定位的實驗材料用豬×嚙齒類體細胞雜種板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)進行染色體區域定位，用美國Minnesota大學共同構建的豬輻射雜種板(INRA-Minnesota porcineradiation hybrid panel，IMpRH)進行染色體精確定位，上述兩套體細胞雜種板均由由法國Martin Yerle博士(Laboratoire de Génétique Cellulaire，INRA，Castanet-Tolosan，France)惠贈。
其中SCHP包括27個體細胞雜種細胞系，1-19號是豬×倉鼠體細胞雜種細胞系，20-27號是豬×小鼠體細胞雜種細胞系，並以倉鼠、小鼠和豬基因組DNA作為陽性對照。經細胞遺傳學鑑定該雜種板保留了豬的除Y染色體外的全部18條常染色體以及X染色體，其中含有127個非重疊的染色體區域，各細胞系中所包含的豬染色體及染色體片段信息可從全球資訊網(http://www:toulouse:inra:fr/lgc/lgc:html/)獲得。
IMpRH使用的輻射劑量是7,000-rad。IMpRH包括118個豬×倉鼠輻射雜種細胞系，以及倉鼠和豬基因組DNA陽性對照，用757個標記的鑑定結果表明IMpRH中的平均標記存留率為29∶3％，包含有128個連鎖群，覆蓋了18對常染色體及X染色體，用於估計標記間距離的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理論解析度是145kb。
(3)PCR分型條件進行擴增的PCR反應總體積為10μl，其中模板DNA為20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(購自Promega公司)。PCR擴增程序是94℃ 3min，循環35次94℃ 30s，62℃ 30s，然後72℃ 30s，最後72℃延伸5min。PCR反應產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3.PCR-RFLP診斷方法建立(1)引物序列TEF-1F1 5′GGCAGGAGCAGTGCTAACAG3′TEF-1SNPR5′GCGAGTCCGAGGCAAACTTC3′該引物擴增片段長度118bp。
(2)PCR擴增條件PCR反應總體積20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(購自Promega公司)。PCR擴增程序是94℃ 4min，循環34次94℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 20s，最後72℃延伸5min。PCR反應產物用3％瓊脂糖凝膠電泳檢測並拍照。
(3)RFLP檢測條件PCR產物酶切反應體積是5μl，其中10×buffer 0.5μl，PCR產物2μl，限制性內切酶BshNI為0.2μl(2U)，H2O為2.310μl，將樣品混勻後離心，37℃水浴4h，用3％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
4.標記性狀關聯分析在利用申請人所在的動物分子生物學與育種實驗室組建的「通城豬」(該品種屬於一種公開飼養的中國地方豬品種)和其他血緣的豬群做性狀關聯分析，取大約200個DNA樣品用於基因型檢測。所分析的性狀有部分生長性能和部分肉質性狀。申請人為此建立了如下最小二乘模型yijk＝μ+GENOTYPEi+SEXj+COMBINATIONk+εijk，其中，yijk是性狀觀察值，μ為總體均數，GENOTYPEi為基因型效應，SEXj為性別效應，COMBINATIONk為組合的效應，εijk為隨機誤差，假定服從N(0，σ2)分布。
本發明的效果是1.豬TEF-1基因的克隆結果以成年長白豬(一種具有歐洲血緣外來引進豬品種，在中國大規模飼養)的肌肉組織提取總RNA，經過反轉錄合成的cDNA為模板，分別用表1所示的引物進行PCR擴增，擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，其中一個片斷有兩條特異的條帶。將PCR產物回收純化後克隆測序，並用GeneTool1.0軟體中的ASSEMBLY程序進行拼接，得到一條長度為1654bp和一條1591bp的兩條cDNA整合序列(見序列表SEQ ID NO1所示)。序列分析表明該cDNA序列具有1308bp(nt 247-1554)和1245bp兩個開放閱讀框，分別編碼435和414個胺基酸的兩個蛋白質。將基因編碼序列在GenBank中進行同源性檢索，檢索結果該序列與人TEF-1基因cDNA(GenBank收錄號NM_021961)的同源性達94％，2.豬TEF-1基因的定位結果用TEF-1MF和TEF-1MR引物在SCHP中分型結果表明，19個豬×中國倉鼠體細胞雜種細胞系(1-19號)中，6號出現與豬基因組DNA陽性對照擴增一致的95bp的目的片段，而在8個豬×小鼠體細胞雜種細胞系(20-27號)中，21、23號雜種細胞系均擴增得到95bp的目的片段。將上述實際觀測的PCR分型數據提交給HybWeb(http://www:toulouse:inra:fr/lgc/lgc:html/)進行統計分析以獲得區域定位信息，數據分析結果是TEF-1基因定位於豬2號染色體上，進一步的區域定位結果為SSC2p14-2p17。
用TEF-1MF和TEF-1MR引物在IMpRH分型結果是1111000000 0100001000 00000011010010000000 1000000000 1000000101 1000000100 0010010011 0110001001 00000000000100001100 11000000(其中0和1分別表述擴增結果為陰性和陽性)。統計分析結果，TEF-1基因與豬2號染色體上的SW1857緊密連鎖，LOD值為9.77，RH圖距是0.42Ray，進一步證實該基因位於豬2號染色體上。
3.PCR-RFLP診斷方法建立根據測序結果和釣取的EST序列的拼接結果發現5′非翻譯區存在一個鹼基突變，存在BshN I(G*G(C/T)(G/A)CC)的酶切位點，用TEF-1F1和TEF-1SNPR擴增豬基因組DNA得到118bp特異擴增片段，酶切產生三種基因型，基因型BB型有93bp和25bp兩條帶，AA型只有118bp的一條帶，雜合子AB型有118bp，93bp和25bp三條帶。
4.標記性狀關聯分析對豬TEF-1基因5′非翻譯區BshN I-RFLP多態性位點與部分胴體、肉質、生長性狀進行關聯分析，基因型檢測結果表明在159個個體中GG基因型有58個，GC基因型有71個，CC基因型有30個，所得到相關的性狀全程日增重。
由表2可知，C等位基因是豬全程日增重的有利標記，CC基因型標記可用於提高豬生長速度的選擇標記(分子標記)。
表2 TEF-1基因多態性對全程日增重的影響




序列表SEQ ID NO1是本發明克隆的豬日增重TEF-1基因的cDNA序列；圖1是本發明的豬日增重TEF-1基因製備的流程圖；圖2是本發明中豬TEF-1基因用於PCR-RFLP檢測的部分DNA片段；圖3是本發明中豬日增重TEF-1基因5′非翻譯區的BshN I-RFLPs的三種基因型(GG GC CC)電泳結果。
具體實施例方式
實施例1PCR-BshN I-RELP多態性在各豬品種中的檢測應用利用PCR-BshN I-RFLP檢測了五個豬種二花臉(中國地方豬血緣)，通城豬(中國地方豬血緣)，長白(歐洲血緣外來豬)，大白(歐洲血緣外來豬)，杜洛克豬(歐洲血緣外來豬)，各豬種的基因頻率如表3所示，發現幾個豬種中都是等位基因G佔優勢。
表3本發明克隆的豬日增重TEF-1基因BshN I多態性基因型頻率及基因頻率

實施例2豬標記性狀關聯分析的應用舉例對豬日增重TEF-1基因5』非翻譯區BshN I-RFLP多態性位點與部分胴體、肉質性狀進行了關聯分析的應用，基因型檢測結果表明在159個個體中GG基因型有58個，GC基因型有71個個體，CC基因型有30個，在與部分生產性狀進行關聯分析應用中，所分析的性狀有部分生產性狀和肉質性狀，所分析的性狀是全程日增重。結果如表4所示。
表4 本發明克隆的豬日增重TEF-1基因多態性對全程日增重的影響

注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01。
序列表110華中農業大學120豬日增重TEF-1基因及其在豬分子標記輔助選擇中的應用130
1412007-05-211602170PatentIn version 3.121012111654212DNA213豬(Sus scrofa)220
221gene222(1)..(1654)223
220
221mutation222(93)..(93)223
220
221CDS222(247)..(1554)223
4001ggcaggagca gtgctaacag gggtggggtg gcccagcccg gggactggga gccggggagg 60gagccgggct ccgagctgaa agcgagggaa gcrgcgccga agtttgcctc ggactcgccg 120ggcgctgcgg cggctccctt cgccgaggtt tattttcttg aaaaggctcc aggcttcggc 180ttggaaaatc cggccgccaa aattgagccc agcagctgga gcggcagtga gagccctgcc 240gaaaat atg gaa agg atg agt gac tct gca gat aag ccc att gac aat 288Met Glu Arg Met Ser Asp Ser Ala Asp Lys Pro Ile Asp Asn1 5 10gat gca gaa ggg gtc tgg agc ccc gac att gag cag agc ttt cag gaa336Asp Ala Glu Gly Val Trp Ser Pro Asp Ile Glu Gln Ser Phe Gln Glu
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1.一種豬日增重TEF-1基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根據權利要求1所述的豬日增重TEF-1基因，其特徵在於，序列表SEQ ID NO1的第93bp處有一個A93-G93的鹼基突變，導致BshN I-RFLP多態性。
3.根據權利要求1所述的豬日增重TEF-1基因，其中克隆TEF-1基因所用的引物的DNA序列如下所示正向5′GGCAGGAGCAGTGCTAACAG 3′，反向5′GCGAGTCCGAGGCAAACTTC 3′。
4.權利要求1或2所述的豬日增重TEF-1基因在豬標記輔助選擇中的應用。
5.權利要求3所述的引物在豬標記輔助選擇中的應用。
6.一種篩選適用於豬日增重分子標記方法，按照以下步驟用人TEF-1基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得相似性85％以上的表達序列標籤；然後拼接豬表達序列標籤-重疊群；根據該表達序列標籤-重疊群設計引物，利用權利要求3所示的引物進行PCR擴增，對獲得的PCR產物純化、克隆和測序，進行序列分析，獲得如序列表SEQ ID NO1所述的cDNA序列。
全文摘要
本發明屬於動物基因工程技術領域，具體涉及一種豬日增重基因TEF－1的克隆及其應用。本發明克隆了一種豬日增重基因TEF－1，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。序列表SEQ ID NO1的第93bp處有一個A93－G93的鹼基突變，導致BshN I－RFLP多態性。本發明還公開了豬日增重TEF－1基因的製備方法、引物設計以及在豬分子標記輔助選擇中的應用。
文檔編號C12Q1/68GK101092622SQ20071005221
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月21日 優先權日2007年5月21日
發明者劉榜, 邢雙, 趙書紅, 朱猛進, 李奎, 樊斌, 餘梅, 李長春 申請人:華中農業大學