具有抗微生物活性的RumC肽的製作方法

2023-06-02 07:36:56 1

專利名稱：：具有抗微生物活性的RumC肽的製作方法具有抗孩￡生物活性的RumC肽本發明涉及具有抗孩史生物活性的肽RumCl、RumC2和RumC3，以及還涉及編碼這些肽並分離自活潑瘤胃球菌El(iM顧7wcoccMSg"avMEl)的基因。某些菌株具有釋放對其竟爭劑有抑菌或殺菌作用的物質的能力。這些抗樣i生物物質可以具有有4幾物性質，例如，有^/l酸或過氧化氫(Ross等，Int.J.FoodMicrobiol.79,3-16,2002),或具有肽性質。酶促合成的抗微生物肽——其形成抗生素類(Mootz等，Curr.Opin.Chem.Biol.1,543-551,1997;Keating等，Curr.Opin.Chem.Biol.3，598-606,1999),以及核糖體產生的肽——其形成細菌素類(Jacob等，Ann.Inst.Pasteur(巴黎)84,222-224,1953)也是著名的。細菌素在研究和工業領域正在引起越來越多的興趣；它們可對抗生素應用提供可選的方案，特別是飼養方面(Luchansky,AntonieVanLeeuwenhoek76,335，1999;O'Sullivan等，Biochimie84，593-604,2002)。近年來，已經開發出這些細菌素的很多異源表達系統。具體而言，Morriset等(Morisset等，Appl.Environ.Microbiol"70,4672-4680,2004)已經在腸膜樣明串J朱菌亞種DSM20484(丄ewcowoWocme^Wero/t/eswZwp.^^ram'cwmDSM20484)中表達了腸膜菌素Y105(mesentricinY105)的變體，腸膜菌素Y105是由腸膜樣明串珠菌亞種Y105生產的IIa類細菌素(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesY105)。同樣，Flynn等(Microbiol"148，973-984,2002)完成了ABP-118——最初由唾液乳酸才幹菌亞種UCC118(丄acZoZ)acz.〃iwsahV(2n't^swZwp.sfl/Zvahi^UCC118)生產的lib4幹菌素--在宿主才直物享L^幹菌(Zacto6ac〃/MS;/a"fan/m)、IL酉復享U求菌(Z(3"ococcm6"/ac"s)和蟲普才羊芽孑包4幹菌(5flc"/wscereMS)中的表達。另夕卜，已經進行了幾項測試，以在細菌大腸桿菌(foc/zen'c/n'aco/z')中表達會田菌素(McCormick等，Appl.Environ.Microbiol,,64,4757-4766,1998;Garneau等，Appl.Environ.Microbiol"69，1352-1358,2003;Biet等，Microbiol"144,2845-2854，1998;Miller等，Appl.Environ.Microbiol"64,14-20，1998;Richard等，J.Bacteriol"186,4276-4284,2004;Kloche等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,67:532-538，2005)，在酉良酒西孝母菌(Saccharomycescerevisiae)中表達糹田菌素(Schoeman等，Yeast,15，647-656,1999;VanReenen等，Int.J.FoodMicrobiol.,81,29-40,2003),以及在乳酸菌中表達細菌素(Rodriguez等，Int.J.FoodMicrobiol"80,101-116,2003)。因此已經進行了很多研究，目的是鑑定新細菌素以及如何生產這些細菌素。消化生態系統由豐富且非常複雜的結合有細菌、酵母和古細菌(爿rc/^M)的^:生物系統組成。這種小型生物群本質上是厭氧的，並且主要發現的是類桿菌屬(Bacteroides)、真細菌屬(五wZ^"en'ww)、才炎菌屬(C7c^nWwm)、瘤胃f求菌屬(Ww/mVzococc^)、雙4支診幹菌屬(5zy(ioZ)a"en'M附)和衝炎形衝幹菌屬(FtwoZa"en'"w)等屬的糹田菌(Suau等，Appl.Environ.Microbiol.65，4799-4807,1999)。微生物系統對宿主的健康具有重要的影響。其尤其參與源自食物的代謝化合物的毒化(toxification)和解毒(HughesandRowlandMicrobialEcologyHealthDisease2，179-185,2000)。其也能夠調節腸細胞(enterocytic)功能的表達(Bry等,Science273，1380-1383,1996;Hooper等,Science291,881-884，2001)。最後，其在保護宿主免受潛在致病性外源細菌侵襲上起著基本的作用(Ducluzeau等,MicrobialEcologyandIntestinalInfections,1988;Fons等，MicrobialEcologyinHealthandDisease2,240-246,2000)。產氣莢月莫才炎菌(C/oWnWwwper/r/wge/w)屬於已知的腸病原體，其是一種嚴格的厭氧型革蘭氏陽性細菌，其能夠形成孢子並且其非常廣泛地分布於環境中。這種病原體可以源自食物，但也可以以低濃度存在於腸內，並且在應激效應下開始增殖並分泌毒素。針對它們所產生的毒素的功能，產氣莢膜梭菌的菌株被分成五種毒素型(toxmotype)(Petit等，TrendsMicrobiol.7,104-110,1999)。A型產氣莢膜梭菌菌林對人的胃腸道疾病負責。1997年，超過245000個感染產氣莢膜梭菌的病例在美國被記載。這導致41.人住院治療，其中7人死亡(Mead等，Emerg.Infect.Dis.5,607-625，1999)。A型和C型的產氣莢膜梭菌菌林可能分別是豬和家禽的壞死性腸炎的起因。在家禽中，壞死性腸炎是一種迅速發展的急性病理，其死亡率可達1%至2%/天。除了其在健康動物上的發病率之外，這種病理因此可具有值得重視的經濟影響。一直到1999，通過使用抗生素作為生長因子，這種疾病才得到令人滿意的控制。然而，為避免選擇抗性細菌以及因此避免降低抗生素在人中的功效，歐盟已經禁止它們用於動物飼料。因為這種禁止，由產氣莢膜梭菌在豬和家禽中引起的壞死性腸炎在歐洲不再受到4空制。在RiseauNationald，ObservationsEpid6miologiquesenAviculture(RNOEA)(AFSSAPloufragan)宣一爾的病例數量在1999和2000年顯著增加(Valancony，BulletindesGTV12，9-12，2001)。目前，尋找可選的解決方案用以控制和治療這種疾病因此非常重要。活潑瘤胃球菌是嚴格厭氧菌，其在梭菌目中屬於毛螺菌(丄ac/"腐p/raceae)家族。Dabard等(Appl.Environ.Microbiol,,67,4111-4118,2001)顯示，分離自人的顯性菌群的菌株活潑瘤胃球菌El能夠產生被稱為瘤胃球菌素A(ruminococcinA)或RumA的抗微生物物質，其積聚在培養上清液中。其是屬於硫醚抗生素家族的細菌素，對各種致病性梭菌種(Clostridiumsp.)的各種菌林均有活性。Gomez等(J.Bacteriol.,184,18-28,2002)已經顯示，參與瘤胃球菌素A生物合成的基因的表達在胰島素存在下被誘導。該作者還顯示，某些消化酶可能抑制RumA生產的誘導。本發明人因此開始關注其它細菌素。本發明涉及對產氣莢膜梭菌(C/oWnWi/m;er/n'wge船)具有抗菌活性的肽RumC1、RumC2和RumC3,以及還涉及編碼這些肽的基因。序列描述SEOIDNo.1:活潑瘤胃球菌E1的RumC肽的保守肽序列SEOIDNo.2:通過埃德曼降解方法實驗測定的活潑瘤胃球菌E1的RumC肽的肽序列SEQIDNo.3:通過埃德曼降解方法實驗、測定的活潑瘤胃3求菌El的RumC肽的肽序列SEOIDNo.4:推導自SEQIDNo.7的活潑瘤胃5求菌El的肽RumCl的肽序列SEQIDNo.5:推導自SEQIDNo.8的活潑瘤胃球菌El的肽RumC2的肽序列SEOIDNo.6:推導自SEQIDNo.9的活潑瘤胃球菌El的肽RumC3的肽序列SEOIDNo.7:活潑瘤胃球菌El的mmCl基因的核苷酸序列SEOIDNo.8:活潑瘤胃球菌El的mmC2基因的核苷酸序列SEOIDNo.9:活潑瘤胃球菌E1的mmC3基因的核苷酸序列SEOIDNo.10、11和12:實-驗測定的肽序列發明的描述本發明涉及具有抗微生物活性的肽，其特徵在於其包括選自下述肽的肽序列SEQIDNo.1的肽；包含與SEQIDNo.1的多肽具有至少80%同一性的肽；序列SEQIDNo.2的肽；以及包含與SEQIDNo.2的多肽具有至少80%同一性的肽。根據本發明的一個實施方式，這種肽也包括肽序列SEQIDNo.3。根據本發明的另一實施方式，這種肽包括的肽選自肽序列SEQIDNo.4、5或6。本發明也涉及編碼抗微生物活性的多核苷酸，其特徵在於其包括選自下述的多核苷酸按照序列SEQIDNo.7、8或9中任一種的多核苷酸；與按照序列SEQIDNo.7、8或9中任一種的多核苷酸雜交的多核苷酸；編碼如上定義的多肽的多核苷酸。本發明也涉及表達盒，其特徵在於其在轉錄方向包括啟動子，其在宿主生物中起作用；如上定義的多核苷酸；和在同一宿主生物中的終止序列。本發明還涉及載體，其包含如上定義的多核苷酸和/或如上定義的表達谷jsa>。本發明也涉及宿主生物，其用如上定義的多核苷酸、如上定義的表達盒和/或如上定義的載體轉化。本發明涉及活潑瘤胃球菌的菌抹，其於2006年12月19日以編號CNCM1-3705保藏在CNCM(法國巴斯德研究所國家微生物菌種中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes，InstitutPasteur),25rueduDocteurRoux,F-75015Paris)，以及還涉及遺傳未修飾的分離形式的菌株，所述菌株產生上述如上所述的肽。本發明涉及蛋白質混合物或發酵添加劑(fermentationmust),其可以通過上面定義的宿主生物或菌抹獲得。本發明也涉及組合物，其包括如上定義的肽、如上定義的宿主生物、如上定義的菌株、如上定義的宿主生物的發酵添加劑或者如上定義的菌抹的發酵添加劑。根據本發明的一個實施方式，組合物是液體形式或粉末形式。本發明也涉及營養添加劑，其包括如上定義的肽、如上定義的宿主生物、如上定義的菌抹、如上定義的宿主生物的發酵添加劑或者如上定義的發酵添加劑。根據本發明的一個實施方式，營養添加劑是液體形式或粉末形式。本發明也涉及動物飼料，其特徵在於其包括用於動物的營養基和如上定義的營養添力口劑。本發明也涉及如上定義的肽、如上定義的宿主生物、如上定義的菌抹、如上定義的宿主生物的發酵添加劑或者如上定義的菌抹的發酵添加劑用於製造藥物、營養添加劑或動物飼料的應用。根據本發明的一個實施方式，這種藥物或這種營養添加劑意圖用於預防或治療家禽或豬中的壞死性腸炎。根據本發明的另一實施方式，這種藥物或這種營養添加劑意圖用於預防或治療人的胃腸疾病。最後，本發明也涉及如上定義的肽用於治療動物的非治療應用。根據本發明的一個實施方式，所述肽得自所述動物的內源菌抹或得自所述動物的外源菌林。根據本發明的另一實施方式，所述肽得自所述動物的內源菌株，並且藉助所述內源菌抹的肽的生產被促進。根據本發明的又一實施方式，所述肽得自所述動物的內源菌抹，並且，所述內源菌林的生長被促進。叢本發明因此涉及具有抗微生物活性的肽。優選地，這些肽分離自活潑瘤胃球菌，例如分離自活潑瘤胃球菌的突變株。作為指導，這些肽可以分離自2006年12月19日以編號CNCM1-3705保藏在CNCM(法國巴斯德研究所國家微生物菌種中心，25rueduDocteurRoux，F-75015Paris)的活潑瘤胃球菌的菌4朱，即菌抹LEM9-17。術語"抗微生物活性"意指抑制靶細菌生長或發育的能力或者殺死靶細菌的能力。測量抗微生物活性的技術是本領域技術人員已知的。在本發明中，通過在瓊脂培養基上培養的菌株產氣莢膜梭菌CpA的活性試驗，展示抗微生物活性。將含有本發明的肽之一的樣品置於在瓊脂培養基中形成的孔中。當抑制孔環(inhibitionhalo)在孔周圍形成時，顯示出抗微生物活性。活潑瘤胃球菌El的肽RumCl、RumC2和RumC3的肽序列分別以序列SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6表示。這些序列分別推導自分別由序列SEQIDNo.7、SEQIDNo.8和SEQIDNo.9表示的基因rw附C、n/mC7和nwiC3的核苦@餅列。本發明也涉及具有抗微生物活性的活潑瘤胃球菌El的這些肽RumCl、RumC2和RumC3的片段。術語"肽片段"表示包含從中衍生的肽的一部分而非全部。本發明因此涉及序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的肽。這些片段保留了它們的抗微生物活性。本發明涉及生物活性片段。術語"生物活性片段"表示保留了其從中衍生的多肽功能的多肽片段。本發明也涉及具有抗微生物活性的肽，其具有至少80%、90%、95%、980/。以及優選至少99%的胺基酸與序列SEQIDNo.1、2或3的任一種肽相同。製備序歹'JSEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的肽的方法是本領域技術人員已知的。RumC肽通過細菌分泌(或釋放)到胞外環境中。可能的是，任一種序列SEQIDNo.4、5和/或6的肽包含特定數目胺基酸的信號肽。在這種情況中，本發明也涉及信號肽切割之後得到的成熟肽。根據本發明的一個實施方式，本發明涉及其序列在序列SEQIDNo.4、5和6的20位與63位之間的肽。在另一實施方式中，肽SEQIDNo.4、5或6的潛在信號肽可以用異源信號肽置換，以通過異源宿主生物執行該肽的表達和分泌。的肽具有至少80%的同一性。根據本發明的一個實施方式，這種肽分離自活潑瘤胃球菌的菌抹。根據本發明的另一實施方式，這種肽分離自瘤胃球菌屬的其它菌抹或者分離自其它細菌。可選地，這種肽可以通過化學合成獲得。本發明的一個主題是具有至少90%、95%、95%以及優選至少99%的胺基酸與序列SEQIDNo.4、5或6的4壬一種肽相同的肽。術語"相同的胺基酸"是指在兩個序列之間不變或沒有變化的胺基酸。這些肽相對於由序列SEQIDNo.4、5或6表示的肽可以具有至少一個胺基酸的缺失、添加或取代。在轉錄之後修飾的胺基酸，例如通過脫水、一硫化物橋(monosulfidebridges)、羊毛硫氨酸形成等修飾的胺基酸，被認為是在兩個序列之間未改變的胺基酸。本發明的主題還是與序列SEQIDNo.4、5或6的任一種肽具有至少80%、90%、95%、98%以及優選至少99%相似性的肽。術語"相似性"是指蛋白質或核酸序列之間的相似度量度。這些肽相對於由序列SEQIDNo.4、5或6表示的肽可以具有至少一個胺基酸的缺失、添加或取代。由分數來量化的兩個序列之間的相似程度基於序列中的同一性和/或保守置換的百分比。用於測量和鑑定多肽之間的同一性程度和相似性程度的方法是本領域技術人員已知的。例如，通過VectorNTi9.1.0——比對程序AlignX(ClustalW算';去)(InvitrogenINFORMAX,http://www,invitroge.n.corn)或利用工具CLUSTAW(http:〃www.ebi.ae.uk./clustalw/),進4t序歹't匕對。根據本發明的肽可以從它們的自然環境分離或純化。所述肽可以通過不同的方法製備。這些方法特別是從自然來源諸如自然表達這些肽的細菌進行糹屯化、通過合適的宿主細胞生產重組肽及其隨後對其純化、通過化學合成生產，或者最後這些不同方法的組合。因此,本發明序列SEQIDNo.1至6的肽可以分離自活潑瘤胃球菌菌抹，其於2006年12月19曰以編號CNCM1-3705保藏在CNCM。本發明的肽分離自重組宿主生物，其表達根據本發明的RumC肽或者表達具有抗微生物活性的RumC肽的片段。本發明的主題也是包含根據本發明的肽的融合蛋白、重組蛋白或嵌合蛋白。本發明的肽可以分離自聚藏菌抹活潑瘤胃球菌El的單菌大鼠(monoxenicrat)的盲腸內含物以及分離自活潑瘤胃球菌的突變抹，更具體地，分離自於2006年12月19日以編號CNCM1-3705保藏在CNCM的活潑瘤胃球菌的菌抹。這些肽具有抗微生物活性，通過對產氣莢膜梭菌的活性試驗展示。質語法能夠測定根據本發明的RumC肽的近似分子量。該分子量在4000與4600Da之間，以及更具體地在4100與4500Da之間。根據本發明的一個實施方式，肽適於營養或藥物應用，例如用於動物營養。術語"適於營養或藥物應用的肽"是指這樣的肽，其特徵使得其適合於營養或藥物。對於營養或藥物應用而言基本的特徵特別是肽能夠耐受的pH。具體而言，人和動物的消化系統的pH是酸性的，因此基本的是肽應當抵抗這種pH。用於營養應用的另一基本特徵是溫度，在該溫度下抗微生物物質是活性的。具體而言，抗微生物物質在藥物、營養添加劑或動物祠料中的加工，例如，包括處理和室溫以上的溫度。所使用的抗微生物的活性因此在工藝條件下特別是溫度條件下必須是穩定的。根據本發明的一個實施方式，根據本發明的肽或肽混合物在中性pH下具有抗孩i生物活性，並且在酸性pH下例如7以下以及優選4.4以下保留其抗微生物活性。才艮據本發明的一個實施方式，才艮據本發明的肽或肽混合物在37。C具有抗微生物活性，並且在低於和高於室溫的溫度下例如50。C以上保留這種活性。本發明也涉及具有抗微生物活性的肽，其分離自單菌大鼠的盲腸內含物或分離自活潑瘤胃球菌的菌抹，對產氣莢膜梭菌菌抹具有活性，具有通過質語法測定的4000與4600Da之間的分子量，並且對於小於或等於7的pH是耐受的。才艮據一個實施方式，肽包括序列SEQIDNo.1和/或序列SEQIDNo.2。根據另一實施方式，其也包括序列SEQIDNo.3的肽。有利地，肽包括選自具有序列SEQIDNo.4、5或6的肽的任一種的肽。本發明還涉及具有抗微生物活性的肽，其可以得自活潑瘤胃球菌的突變抹，例如，於2006年12月19日以編號CNCM1-3705保藏在CNCM的活潑瘤胃球菌的菌抹。根據一個實施方式，所述肽對於產氣莢膜梭菌菌抹具有抗微生物活性。根據另一實施方式，其具有4000與4600Da之間的分子量，以及優選地具有4100與4500Da之間的分子量，如通過質語法測定。根據另一實施方式，肽在中性pH下具有抗^i:生物活性，並且在酸性pH下例如7以下以及優選4.4以下保留其抗微生物活性。根據一個實施方式，肽包括序列SEQIDNo.1和/或序列SEQIDNo.2。根據另一實施方式，其也包括序列SEQIDNo.3的序列。可選地，肽包括選自具有序列SEQIDNo.4、5或6的肽的任一種的肽。本發明也涉及分離自單菌大鼠的盲腸內含物、具有抗微生物潛力的肽，其對應於圖4A的色i普圖，該色譜圖在214nm通過反相HPLC獲得，該肽對產氣莢膜梭菌的各種菌抹具有活性，特別是對毒素型A具有活性。多核苷酸本發明也涉及編碼抗^1生物活性的多核苷酸。優選地，這些多核苷酸編碼瘤胃球菌屬的抗微生物活性。根據本發明，術語"多核苷酸"是指可以屬於DNA型或RNA型的單鏈多核苷酸鏈或其互補鏈，或者是可以屬於互補或基因組DNA類型的雙鏈核苷酸鏈。優選地，本發明的多核苷酸屬於DNA類型，特別是雙鏈DNA。術語"多核苦酸"還表示修飾的多核苷酸。本發明的多核苷酸可以從它們的自然環境分離或純化。本發明的多核苷酸也可以通過化學合成製備，或通過由Sambrook,FristschandManiatis在其名稱為"Molecularcloning:alaboratorymanual",edition:ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989的書中描述的標準分子生物學技術製備。本發明涉及根據序列SEQIDNo.7、8或9任一種的多核苷酸。本發明也涉及與根據序列SEQIDNo.7、8或9任一種的多核苷酸雜交的多核苷酸。本發明也涉及編碼如上定義的具有抗微生物活性的肽的多核苷酸。本發明也涉及這樣的多核苷酸，其與根據序列SEQIDNo.7、8或9任一種的多核苷酸具有至少80%、85%、90%、95%、98%以及優選至少99%的同一性。這種多核苷酸編碼抗微生物活性。根據一個實施方式，多核苷酸編碼針對產氣莢膜梭菌菌抹的抗微生物活性。術語"相同的核苷酸"是指在兩個序列之間不變或沒有變化的核苷酸。這些多核苷酸相對於參考多核苷酸可以具有至少一個核苷酸的缺失、添加或取代。本發明也涉及與根據序列SEQIDNo.7、8或9任一種的多核苷酸具有至少80%、85%、90%、95%、98%以及優選至少99%相似性的多核苷酸。這種多核苦酸編碼抗微生物活性。根據一個實施方式，多核苷酸編碼針對產氣莢膜梭菌菌抹的抗微生物活性。術語"相似性"是指蛋白質序列或核酸序列之間的相似性量度。這些多核苷酸相對於參考多核苷酸可以具有至少一個核苷酸的缺失、添加或取代。由分數來量化的兩個序列之間的相似程度基於序列的同一性和/或保守置換的百分比。用於測量和鑑定核酸序列之間的同一性程度和相似性程度的方法是本領域技術人員已知的。例如，通過VectorNTi9.1.0——比對程序AlignX(ClustalW算'法)(InvitrogenINFORMAX,littp:〃www."witr卿,com)或矛J用工具CLUSTAW(htt:p:〃www.ebi,ac.uk/clustalw/)，進行序列比對。本發明也涉及能夠與根據序列SEQIDNo.7、8或9任一種的多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸。優選地，選擇性雜交在適度嚴格條件下進行並且優選在高度嚴格條件下進行。根據本發明，術語"能夠選擇性雜交的序列"是指這樣的序列，其與參考序列雜交的水平顯著高於背景噪聲。能夠選擇性雜交的序列與參考序列之間相互作用產生的信號水平通常比產生背景噪聲的其它DNA序列的相互作用的信號強IO倍以及優選強100倍。允許選擇性雜交的嚴格雜交的條件是本領域技術人員已知的。一4殳而言，在特定地pH以及針對特定的離子強度，雜交和洗滌溫度在參考序列的Tm之下至少5°C。通常，對於15至50個核苦酸的多核苷酸，雜交溫度是至少30。C，而對於大於50個核苷酸的多核苷酸，雜交的溫度是至少6CTC。以舉例的方式，在下述緩沖液中進行雜交6XSSC、50mMTris-HCI(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA,500呢/ml變性鮭精DNA。進行洗滌，例如，連續在下述條件下進行在2XSSC、0.1。/。SDS緩沖液中在非嚴格性下，在0.5XSSC、(Uo/。SDS緩沖液中在中等嚴格性下，以及在0.1XSSC、0.1%SDS緩衝液中在高嚴格性下。當然，雜交可以按照本領域技術人員已知的其它普通方法進4亍(4爭另'J參見Sambrook,FristschandManiatisintheirbookentitled"Molecularcloning:alaboratorymanual",edition:ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSprmgHarbor,NY，1989)。優選地，與參考多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸保留參考序列的功能。在本情況中，選擇性地與根據序列SEQIDNo.7、8或9任一種的多核芬酸雜交的多核苷酸編碼抗微生物活性。本發明一般涉及編碼根據本發明的肽的多核苷酸。因為遺傳密碼的簡併(degeneracy)，不同的多核芬酸可以編碼相同的多肽。這些表達盒在轉錄方向包括-啟動子，其在宿主生物中起作用；-根據本發明的多核苷酸；-在同一宿主生物中起作用的終止序列。任何類型的終止序列可以用於根據本發明的表達盒中。對啟動子的選擇將特別取決於針對相關基因表達所選擇的宿主生物。某些啟動子允許組成型表達，而另一方面其它啟動子是誘導型的。在真菌的功能啟動子中，特別要提到的是來自構巢麴黴菌(Jwwg說Mw'(iM/flra)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動子(Roberts等，CurrentGenet.15，177-180，1989)。在細菌的功能啟動子中，特別要提到的是來自噬菌體T7的RNA聚合酶的啟動子(Studier等，MethodsinEnzymology,185,60-89,1990)。在酵母的功能啟動子中，特別要提到的是基因的啟動子(Elledge等，Proc.NatlAcad,Sciences,USA.88,1731-1735，1991)或者釀酒酵母U.cerev&fle)的Ga"和AD/Z啟動子。所有這些啟動子都在文獻中描述並且是本領域技術人員熟知的。對於在繩狀青黴菌(/^m'c/〃/w,w/wm'CM/www)中的表達，例如將選擇包含H4B組蛋白啟動子、門冬氨酸蛋白酶啟動子或csl13啟動子(WO00/68401)的表達盒。對於在酵母巴斯德畢赤酵母(Pic/n'a/7似toni)中的表達，例如將選擇包含曱醇-誘導型AOXl啟動子(Tschopp等，Biotechnology,5,1305-1308,1987)或GAP強組成型啟動子(Waterham等，Gene186,37-44，1997)的表達盒。對於在粟酒裂殖酵母(Sc/n'zc^flcc/2arom少'(e,s';wmZ^)中的表達，例如將選擇包含由硫胺素抑制並且在石克胺素不存在時激活的調節啟動子(Maundrell,J.Biol.Chem.265,10857-10864,1989)的表達盒。根據本發明的表達盒也可以包括多肽或多核苷酸表達必需的任何其它序列，例如允許由宿主生物產生的多肽分泌的調節元件或信號序列。特別可能的是使用任何調節序列，其使得能夠增加被插入表達盒中的編碼序列的表達水平。根據本發明，特別可能的是與啟動子調節序列相結合而使用其它調節序列，其位於啟動子與編碼序列諸如轉錄激活子("增強子")之間。另外，根據本發明的表達盒可以包括由宿主生物產生的多肽分泌必需的任何其它序列，諸如信號序列。對於巴斯德畢赤酵母的分泌，例如使用a因子序列作為分泌信號是可能的。很多種終止序列可以用在根據本發明的表達盒中，這些需要允許轉錄終止以及mRNA的多腺香酸化。可以使用在已選宿主生物中起作用的任何終止序列。對於在繩狀青黴菌中的表達，例如將選擇包含H4.B組蛋白終止子、門冬氨酸蛋白酶終止子或csl13終止子(WO00/68401)的表達盒。本發明的主題還是構成根據本發明的表達盒的多核苷酸；有利地，根據本發明的表達盒被插入載體中。載體本發明也涉及用於宿主生物轉化的克隆或表達載體，其包含根據本發明的至少一種多核苷酸或表達盒。這種載體特別是可以對應於質粒、粘粒、噬菌體或病毒，根據本發明的多核苷酸或表達盒被插入其中。用於構建這些載體以及將本發明的多核芬酸插入這些載體中的技術是本領域技術人員已知的。一般而言，可以使用任何能夠在宿主細胞中維持其自身、自主複製或繁殖以便尤其是誘導多核苷酸或多肽表達的載體。作為待被轉化的宿主生物的函數以及作為所使用的轉化技術的函數，本領域技術人員將選擇合適的載體。本發明的載體被特別用於轉化宿主生物，用於複製載體和/或在該宿主生物中表達根據本發明的肽的目的。本發明也涉及用於製備根據本發明的肽的方法，包括下述步驟-用包括根據本發明的表達盒的表達載體和/或根據本發明的多核苷酸來轉化宿主生物，-分離通過宿主生物產生的肽。宿主生物達盒或至少一種載體整合到宿主生物中而轉化所述宿主生物的方法。多核苷酸可以被整合到宿主生物的基因組中，或者可以在宿主生物中穩定複製。轉化宿主生物的方法是本領域技術人員已知的並且在文獻中廣泛描述。本發明也涉及用根據本發明的多核苷酸、表達盒或載體轉化的宿主生物。根據本發明，術語"宿主生物"具體而言是指任何高等或低等的單細胞或多細胞生物體，特別地選自細菌、酵母或真菌。具體而言，術語"宿主生物"是指非人生物體。有利地，酵母例如選自巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母)、耶羅維亞酵母和許旺酵母(Sc/rvw2wm'omyces1oct^/ewto/h)。真菌例^口選自曲霧屬(^s"/erg7'〃MS)、木黴屬(7h'c/^cfermfl)和青黴菌(Pem'c/〃/wwM)，優選選4奪繩狀青黴菌、裡氏木酶(7h'c/wti^7W(3re&ye/)、黑麴黴素(y4s/7er^〃wsm'ger義5色盛麴黴(^s/erg7'〃ws)、白麴黴(J5/erg7.〃i^fc2vrac/n7)禾口康亍木黴(7h'cAo^fermaA:omVzg")。在本發明的一些實施方式中，宿主生物是繩狀青黴菌的菌株，其中根據本發明的肽被表達或過量表達。在另一實施方式中，宿主生物是卡氏德巴利酵母("eZ)ara附，rac"We〃a)的菌抹，其中才艮據本發明的肽^皮表達或過量表達。在又一實施方式中，宿主生物是活潑瘤胃球菌的菌株，其中根據本發明的肽被表達或過量表達。白的4支術廣泛描述於文獻中，特別是由Sambrook,FristschandManiatis在名稱為"Molecularcloning:alaboratorymanual",edition:ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989的書中所述，或者由Ausubel等在"CurrentProtocolsinMolecularBiology",edition:GreenePublishingAssociates,Inc.,andJohnWileyandSons,NY，1992的書中所述。囷林活潑瘤胃球菌的新菌4朱於2006年12月19日以編號CNCM1-3705保藏在CNCM(法國巴斯德研究所國家微生物菌種中心，25meduDocteurRoux,F-75015Pans)。根據布達佩斯條約第7條，CNCM是國際保藏單位。新菌抹通過菌株活潑瘤胃球菌L14的隨機誘變獲得。該菌抹是活潑瘤胃球菌El的自發突變體，其已經失去體外生產RumA的能力但是仍能體內合成RumC。強烷化劑N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NG)被用於誘變。利用另一起源的DNA或RNA，通過重組技術，沒有獲得遺傳修飾。菌抹LEM9-17的培養基優選是補充有酵母提取液和氯化血紅素的BHI培養基(BHI-YH)。蛋白質混合物、發酵添加劑法包括下述步驟a)在誘導肽表達的條件下，培養活潑瘤胃球菌的菌抹或根據本發明的轉化宿主生物，和b)回收包含所述肽的培養上清液。肽與培養上清液的分離可以通過電荷、大小和/或疏水性質進行。本領域技術人員知曉作為各種培養基組成的電荷、大小和/或疏水性質的函數的各種製備技術。這種培養上清液或發酵添加劑然後可以被濃縮或凍幹以配製食品添加劑或動物飼料。該過程可以包括從培養上清液中提純抗微生物物質的附加步驟。如果宿主生物不分泌抗樣i生物物質到培養上清液中，則細胞溶解和細胞提取的另外步驟可能是必需的。本發明的肽也可以從單菌大鼠的盲腸內含物獲得。組合物根據本發明的組合物包括根據本發明的肽、根據本發明的宿主生物、根據本發明的菌抹、根據本發明的宿主生物的發酵添加劑或者根據本發明的菌林的發酵添加劑。所述組合物處於液體形式或者處於粉末形式。這些組合物包括各種成分。液體組合物例如可以包括另一種抗微生物劑，例如山梨酸或山梨酸鹽、苯曱酸或苯甲酸鹽，或者富馬酸或富馬酸鹽。本發明的組合物也可以包括山梨糖醇。山梨糖醇是穩定劑和配製劑。本發明的組合物也可以包括防凍劑，例如乙二醇、甘油、丙二醇和1,2-丙二醇。粉末形式的組合物包含支持物。這種支持物可以選自小麥麵粉、澱粉、糊精、石膏或玉米芯。根據本發明的組合物具有抗微生物活性。它們對抗生素應用提供可選方案。它們可以用於例如動物飼養或用作人的藥物。本發明的組合物包含至少一種根據本發明的肽，但是它們也可以包含其它物質，例如維生素、其它活性成分、胺基酸或礦物鹽。根據本發明的組合物使得例如預防或治療豬或家禽中的壞死性腸炎以及預防或治療人的胃腸疾病成為可能。本發明的組合物例如被添加至動物飼料中或者例如與營養基料相結合。可以被摻入具有抗菌活性的組合物中的粉或顆粒的形式。本發明的主題還是動物飼料，其包含根據本發明的肽、根據本發明的宿主生物或者根據本發明的宿主生物的發酵添加劑/培養上清液。術語"飼料"是指可以用作動物食物的任何物質。術語"營養基(nutritionalbase)"是指組成動物食物定量的基本部分的任何物質，例如，其由穀類、蛋白質和動物和/或植物來源的脂肪的混合物組成。通常，這些營養基包括例如玉米、小麥、豌豆和大豆。這些營養基適應其預期的各種動物種類的需求。所述動物例如可以是家禽(蛋雞、肉雞、火雞和鴨子)或豬(生肥育豬(growingandfinishingpigs)或小豬)。肽的應用本發明也涉及根據本發明的肽、根據本發明的宿主生物、根據本發明的菌抹、根據本發明的宿主生物的發酵添加劑或者根據本發明的菌抹的發酵添加劑在製造藥物中的應用。本發明也涉及根據本發明的肽、根據本發明的宿主生物、根據本發明的菌抹、根據本發明的宿主生物的發酵添加劑或者根據本發明的菌抹的發酵添根據本發明的一個實施方式，這種藥物或這種營養添加劑意圖用於預防或治療家禽或豬中的壞死性腸炎。根據本發明的另一實施方式，這種藥物或這種營養添加劑意圖用於預防或治療人的胃腸疾病。附圖簡述圖:通過在SephadexG-75上可溶性餾分的分子篩選獲得的色譜圖，所述可溶性餾分含在聚藏菌抹活潑瘤胃球菌E1的單菌大鼠的10g盲腸內含物中；x-軸給出洗脫體積，以mL計；y-軸給出280nm處的吸收；陰影面積對應於對產氣莢膜梭菌有活性的餾分(餾分325至358)。圖2A:通過在SephadexG-75上標準蛋白質分子篩選獲得的譜圖；x-軸給出洗脫體積，以mL計；y-軸給出280nm處的吸收；a:白蛋白67kDa;b:卯白蛋白43kDa;c:糜蛋白酶25kDa;d:核糖核酸酶A13.7kDa圖2B:得自圖2A的色譜圖的log校準曲線(MM)=f(Ve);x-軸給出洗脫體積，以mL計；y-軸給出分子量對數軸左側，給出214nm處的吸收；y-軸右側給出NaCl濃度，以M計；x-軸給出時間，以分鐘計圖4A:通過反相HPLC獲得的活性CM餾分的色譜圖；y-軸，左側給出給出214nm處的吸收；y-軸右側給出乙腈洗脫劑的百分比；x-軸給出時間，以分鐘計；圖4B和4C:從反相HPLC得到的餾分的質語；x-軸給出質量/電荷；y-軸給出信號強度圖5:用於從聚藏菌抹活潑瘤胃球菌El的單菌大鼠的盲腸內含物純化RumC的方案規劃圖6:在陽離子交換樹脂上通過FPLC得到的脫鹽餾分SN9-17的色語圖；x-軸給出時間，以分鐘計；y-軸給出214nm處的吸收a:在214nm的吸光度b:NaCl濃度c:導電率d:流速，以mL/分鐘計圖7:在RumC純化過程中各種餾分的質語；x-軸給出質量/電荷；y-軸給出信號強度圖7A:SN9-17圖7B:活性CM餾分圖7C:R10kDa圖8:餾分GF47-50的質譜；x-軸給出質量/電荷；y-軸給出信號強度圖9:從突變4朱LEM9-17純化RumC的方案規劃實施例材料與方法1.細菌菌抹和培養基菌抹活潑瘤胃球菌El——其產生RumC,分離自健康成人的顯性排洩物小型生物群(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001)。菌林活潑瘤胃球菌L14是活潑瘤胃球菌El的自發突變體，其已經失去體外生產RumA的能力但是仍能體內合成RumC。於2006年12月19日以編號CNCM1-3705保藏於CNCM的活潑瘤胃球菌菌抹衍生自菌抹L14的隨機誘變。其能夠在胰島素補充的瓊脂培養基(500(ig/ml，但不在液體培養基中)上體外生產RumC。其是菌株LEM9-17。用作活性試驗靶標的菌抹是菌林產氣莢膜梭菌CpA(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol.,67，4111-4118，2001)。在受控大氣壓下在"Freter"型室中厭氧培養這四種菌抹(85%N2、10%H2、5%C02)。使它們在37。C在補充由酵母提取液和氯化血紅素的BHI培養基(BHI-YH)中溫育。液體BHI-YH:37g/LBHI(BrainHeartInfusion,DifcoLaboratories)5g/L酵母才是取液(YeastExtract,Fluka)5mg/L氯化血紅素(Hemin,Sigma)瓊脂BHI-YH:同前+15g/L瓊脂(BACTOagar,DifcoLaboratories)2.利用液體樣品的抗孩i生物活性試馬全為了由液體樣品進行抗微生物活性試驗，將104至105個產氣莢膜梭菌CpA細胞鋪板在瓊脂培養基上。室溫下30分鐘後，利用巴斯德吸管在瓊脂中製成直徑為6mm的孔。然後，體積為100|iL以下的樣品一皮置於孔中，並且培養m在37。C被溫育16至24小時。如果樣品含有直接對抗產氣莢膜4炎菌CpA的抗li生物物質，細菌的生長得到抑制，這導致在孔周圍形成"抑制孔環(inhibitionhalo)，，。也可以通過直接將10)iL測試樣品放到用產氣莢膜梭菌提前接種的瓊脂上進行活性測試。3.利用在瓊脂培養基中生長的菌落的抗微生物活性測試在補充有或另外具有50|ig/mL胰島素的瓊脂培養基上培養24小時之後，潛在生產抗微生物物質的菌株用含有靶菌抹的"軟"瓊脂培養基(含有7.5g瓊脂/L)覆蓋。這種軟瓊脂通過臨時混合5mL表面灌流的瓊脂培養基與5mL含有104至105個靶菌抹細胞的液體培養基來製備。然後將培養皿在37。C再溫育16至24小時。在產生抗微生物物質的菌落周圍觀察到抑制孔環。4.從盲腸內含物中取出細胞碎片和食物殘留物10g盲腸內含物在30mLPBS(NaCl137mM、KC12.68mM、Na2HP048.1mM、KH2P041.47mM，pH7.4)中稀釋，然後在10000xg以及4°C下離心15分鐘。移走含有細胞碎片和食物殘渣的片狀沉澱物。5.離心過濾裝置作為離心後其分子量的函數，這些是用於將蛋白質分離成兩部分的濾膜器。這些體系也可以被用於濃縮樣品或使樣品脫鹽。幾家製造商銷售這種類型的產品。在大多數情況下，膜由再生纖維素製成，但是它們也可以由聚醚碸製成。系統的選擇成為待被處理的樣品體積以及膜的截止閾值(cut-offthreshold)的函數(表1)。這些過濾裝置按照製造商提供的關於選擇轉子類型和離心速度的說明書使用。然而，離心時間作為樣品粘度的函數是可變的。表1:在RumC純化測試過程中使用的過濾裝置的特性名稱膜類型截止閾值最大體積AmiconUltra-15PL-5*再生纖維素5kDa20mLMicroconYM-10*再生纖維素10kDa0.5mLMicroconYM-3*再生纖維素3kDa0.5mLVivaspin500-5000MWCO**聚醚碸5kDa0.6mLVivaspin500-3000MWCO**聚醚碸3kDa0.6mL*商品名Millipore的產品；**商品名Sartorius的產品6.在SephadexG-75上的分子篩選在G-75柱(2.4x187cm)上進行盲腸內含物上清液的分子篩選。樣品(其體積是柱體積的大約2%)被放置在柱上，在4。C在1mL/分鐘的流速下利用PBS進行洗脫，並收集600個2-mL餾分。通過讀取每種餾分在280nm處的吸收穫得色語圖。7.在FPLC上的分子篩選在FPLC系統上進行活性CM餾分的分子篩選。將樣品裝載到HiLoad26/60Superdex30pg柱(GEHealthcare)上。在2.5mLZ分鐘的流速下利用PBS進行洗脫。通過測量280nm處的吸收變化，檢測所洗脫的蛋白質材料。自動收集對應於2分鐘洗脫的餾分。8.在陽離子交換CM柱上的HPLC在裝備有Waters616Pump注射器的Waters600SController上進4亍陽離子交換HPLC。將樣品(0.5mL)裝載到來自TSK的CM-3SWSpherogel半製備柱上。在pH5的20mM乙酸鈉緩衝液中在0.8mL/分鐘的流速下，利用從0至1M的NaCl濃度梯度進行洗脫。在第一個20分鐘期間，在沒有NaCl的情況下以無梯度模式進行洗脫，然後利用從0至0.5M的線性NaCl濃度梯度洗脫30分鐘。洗脫然後在無梯度條件下繼續5分鐘，然後在1分鐘內進行交換至1M的NaCl濃度，之後在無梯度條件下繼續15分鐘，最後，回到最初的條件。通過j吏用Waters486TunableAbsorbanceDetector測量280或214nm處的吸收，；險測所洗脫的蛋白質物質。自動收集餾分，然後利用AmiconUltraPL-5系統脫鹽。9.在陽離子交換柱上的FPLC在FPLC系列上進行陽離子交換色i普法。將樣品裝載到Hi-Prep16/10CMFF柱(GEHealthcare)上。在pH5的20mM乙酸鈉緩沖液中，利用從0至0.4M的NaCl濃度梯度進行洗脫。在沒有NaCl的情況下以無梯度模式進4亍洗脫50分鐘，流速為2mL/分鐘。然後在5mL/分鐘的流速下，利用從0至0.4M的線性NaCl濃度梯度在40分鐘內進行洗脫。通過測量在280nm處的吸收變化，檢測所洗脫的蛋白質物質。自動收集1mL餾分，然後在Sep-PakC18柱體上脫鹽。10.反相HPLC在AllianceWaters1690SeparationsModule系列上進行反相HPLC。將預先用0.1%三氟乙酸(TFA)酸化的樣品(100)裝載到Vydac218TP52250x2分析柱上。在恆定流速(0.5mL/分鐘)下進行洗脫。在15%乙腈下以無梯度模式洗脫10分鐘後，在60分鐘內應用15%至30%乙腈的線性梯度。然後在1分鐘內進行交換至70%乙腈，並且在無梯度條件下繼續洗脫19分鐘，之後回到初始條件。通過4吏用Waters996PhotodiodeArrayDetector測量214nm處的吸收變化，檢測所洗脫的蛋白質物質。自動收集0.5mL餾分。利用SpeedVacConcentrator(Savant)蒸發掉乙月青。11.質譜法在Timoneproteomicplateau(SchoolofPharmacy,Marseilles,France)進行質譜法分析。在以正線性模式使用的EttanMaldi-TofPro光i普儀(GEHealthcare,Uppsala,瑞典)上利用延遲萃取獲得Maldi類型的質譜。樣品與511^/1^0;-氰基—4-羥基桂皮酸溶液在Maldi耙上通過幹點滴法共結晶。利用20kV的加速電勢獲得光i普，並且雷射功率被設定為最低水平，以便獲得優良信號。在外部模式下通過採集已知質量的標準肽混合物獲得光譜校準(Pepmix4,Laserbiolabs,Nice,France)。對於某些難於結晶的樣品，利用2，5-二羥基苯曱酸的溶液進行共結晶。12.Edman測序該技術基於蛋白質的游離末端胺基團與異硫氰酸苯酯(C6H5NOS)的反應。這種環狀化合物在^5威性介質中在蛋白質的第一胺基酸殘基上進行親核攻擊。然後肽的苯M^硫曱醯基(phenylthiocarbamyl,PTC)衍生物通過水解作用被切割。獲得第一胺基酸的苯胺基-噻唑啉酮(ATZ)和已經失去這種胺基酸的蛋白質。入丁2-#^酸然後被轉化為乙內醯^^克脲-(PTH)tt酸。分離連續獲得的PTH-氨基S臾，並通過RP-HPLC通過測量280nm處的吸收以及通過比4交洗脫時間進4亍鑑定。反應周期可以重複，並因此產生蛋白質的序列。13.隨機誘變在37。C溫育24小時的14mL菌抹L14的培養物被分入七個2mL試管中，然後將試管在5800xg下離心10分鐘。將細胞沉澱用2mL0.1M檸檬酸鹽緩衝液(檸檬酸21mg/mL,NaOH8.8mg/mL,pH5.5)洗滌兩次，然後溶解在含有增加濃度的N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NG)——有效地誘變劑——的擰檬酸鹽緩沖液中。表2:在Sep-Pak上脫鹽期間使用的溶液的體積tableseeoriginaldocumentpage24然後將試管在37。C上溫育30分鐘，之後在5800xg離心10分鐘。片狀沉澱物用0.1M磷酸鹽緩衝液(KH2P0413.6mg/mL，NaOH2,32mg/mL,pH7)洗滌，然後溶解在液體BHI-YH培養基中。14.在Sep-PakCI8柱體(Waters)上脫鹽根據才莫型，這些柱處於所述相^皮傾倒入注射器中的形式，或者這些柱處於固定至注射器末端的微型柱的形式。緩沖液的流量通過蠕動泵得以保障。在第一階段，通過使H20經過，然後使CH3CN以及最後使含有0.05%TFA的H20經過，平衡柱。然後施加預先用0.05%TFA酸化的樣品。通過連續加入H20-0.05%TFA、40%CH3CN-0.05%TFA和CH3CN-0.05%TFA,以三步進行洗脫。因此收集三種鎦分:對應於未被柱保留的蛋白質的餾分以及對應於鹽的餾分(餾分NR)、含有用40%CH3CN稀釋的蛋白質的餾分(40%CAN餾分)以及含有用100%CH3CN稀釋的蛋白質的餾分U00。/。CAN餾分)。取決於體積，利用SpeedVacConcentrator或旋轉蒸發器蒸發4皂i容劑。表3顯示使得自RumC純化的餾分脫鹽所使用的每種溶液的體積(cf.結果和討i侖)。這些體積取決於Sep-Pak的相體積。表3:作為施加的函數在Sep-Pak期間所使用的溶液體積tableseeoriginaldocumentpage2515.溫度耐受性測試加熱含有RumC的等分部分的餾分，每種達到不同的溫度，用導熱釜(heatingblock)進行5或15分鐘，然後在4。C保藏。然後使它們經歷抗微生物活性試驗。16.pH耐受性測《式將含有RumC的等分部分的餾分在期望的緩衝液大約稀釋十倍。室溫下IO分鐘後，將每種溶液置於Vivaspin5003kDa過濾裝置上，然後按照製造商的指令離心。將緩衝液添加至由Vivaspin500保留的餾分中，然後再離心過濾裝置。由Vivaspin5003kDa保留的每種餾分-即含有RumC-的體積用緩衝液調節，以便對應於起始體積。然後在進行抗微生物活性試驗之前將各種餾分保藏在4。C下。Vivaspin5003kDa濾器不耐受大於9的pH。因此僅測試酸性或中性pH的緩衝液。成分如下t)H2緩衝液:50rnMKC1-13mMHClpH4.4緩衝液:0.2MpH4.4乙酸鈉緩沖液pH7li沖液:50mMKH2P04-39mMNaOH結果和討論1.來自盲腸內含物的RumC的純化儘管菌株活潑瘤胃球菌El是可培養的，但是在測試的培養條件下RumC不能體外生產。為純化RumC，因此必需利用來自聚藏菌株E1的單菌大鼠的盲腸內含物來操作，或者產生能夠體外生產RumC的活潑瘤胃球菌的突變抹(見第2節)。1.1.來自單菌大鼠的盲腸內含物的稀釋第一步由在PBS中稀釋盲腸內含物組成。1.2.細胞碎片的移除在第二步純化期間，細菌、細胞碎片和食物殘渣通過離心盲腸內含物而被移走。1.3.濃縮然後在Amicon⑧Ultra-15PL-5系統上濃縮溶液，之後應用於分子篩選柱。1.4.抗微生物活性試驗在菌株產氣莢膜梭菌CpA上測試所得到的所有餾分，這證實抗-產氣莢膜梭菌物質在單菌大鼠的盲腸內含物中的存在。利用來自無菌大鼠(無微生物)的盲腸內含物進行陰性對照。未4企測到抗-產氣莢膜梭菌活性。在單菌大鼠的盲腸內含物中存在的抗-產氣莢膜梭菌物質的確是活潑瘤胃球菌El特定的。之後，每一純化試驗之後進行抗-產氣莢膜梭菌活性試驗。在第一階段，僅研究活性的存在或缺乏，注意要確保陰性結果與技術的靈敏度閾值(sensitivitythreshold)無關。當明確的方案被確定時，在第二階段進行定量試驗。1.5.在G-75柱上的分子篩選在SephadexG-75柱(2.4x187cm)上進行分子篩分。通過讀取所收集的600個2-mL餾分中每一種在280nm處的吸收，監測洗脫。在利用MicroconYM-3預先濃縮的餾分上進行抗孩i生物活性試驗。餾分325至358證實對產氣莢膜梭菌具有活性，並且其被匯集以形成新的活性GF餾分(圖1的陰影部分)。利用來自無菌大鼠的盲腸內含物進行的對照產生的洗脫曲線與利用來自單菌大鼠的盲腸內含物得到的洗脫曲線相當，但是未檢測到抗-產氣莢膜梭菌活性。1.6.RumC大小的評價為了評價在活性GF餾分中存在的RumC的大小，將已知分子量的標準蛋白質置於同一SephadexG-75柱上，並測量各洗脫體積(圖2A)。然後繪製定義物質的分子量對數(log(MM))與其洗脫體積(Ve)之間比例的校準曲線(圖2B)。平均洗脫體積是683mL的情況下，抗微生物物質不在選擇的標準蛋白質範圍內，但是通過外推，其分子量可以近似評價為5200Da。1.7.在陽離子交換樹脂上的色譜法利用活性GF餾分，使用HPLC系統，考慮在羧曱基(CM)-Spherogel柱上的陽離子交換色鐠。在pH5，通過NaCl濃度梯度進行洗脫，並在214nm監測(圖3)。在32分鐘與38分鐘之間發現活性(活性CM餾分)，其對應於0.2至0.3M的NaCl濃度。該技術使得消除未被保留的餾分中的汙染物特別是消除所有的黃色顏料成為可能。通過質譜法進行的活性CM餾分的分析顯示其含有大約4200Da的單一肽(結果未顯示)。使該餾分經歷N-末端測序。最初的11個胺基酸因此被測定AGVIX(N/S)GTXAV(SEQIDNo.10)。該序列未顯示與已知蛋白質具有任何強同源性。測序也顯示出兩個較小的序列。1.8.反相HPLC色譜獲得在214nm處的各種吸收峰。在被稱為a(或"雙峰")和b(或"單峰")的兩種餾分中顯示出活性(圖4A)。通過質語法對這兩種餾分進行分析顯示存在三種主要的肽，它們各自的分子量在4230與4460Da之間(圖4B和4C)。利用所開發的三種色譜法，即，分子篩選、陽離子交換色譜法和反相色譜法，再次進行RumC自盲腸內含物的純化。得到的洗脫曲線與所展開的第一次測試的那些洗脫曲線相當。RumC純化方法因此是可再現的，並且因此可以被採用。總結/人盲腸內含物純化RumC方案示出圖5中。1.9.純化收率和純化因子按慣例，在溶液中存在的隨意活性單位(arbitraryactivityunit,AAU)的數目被定義為最後活性稀釋的倒數。因此在得自純化的每種活性餾分的連續稀釋(兩倍)上進行抗-產氣莢膜梭菌活性測試。通過比較以AAU/mg蛋白質表達的每種餾分的比活性獲得純化因子(purificationfactor)。對各種餾分中蛋白質數量的估計得自其在280nm處的吸收測量，利用的是1.8的質量消光係數EQ1%。表4給出了用於自單菌大鼠盲腸內含物純化RumC的方案步驟的活性收率和純化因子。表4:在從10g單菌大鼠盲腸內含物體內製備RumC過程中的活性收率和純化因子餾分V(mL)抗-CpAA.(AAU)M蛋甴質(mg)SA(AAU/mg)收率F純化勻漿39780nd100%SN32375375148%i濃縮的SN143502701.345%1.3活性GF662052010.326%]0活性CM1-1.51700.135126022%1200雙峰1-1.550nd13%單峰1-1.550ndn.d.=未測定V:餾分的總體積，以mL計抗-CpAA.:抗-產氣莢膜^l菌活性，即在餾分中包含的活性單位總數M蛋自質餾分中的蛋白質質量，以mg表達SA:抗-產氣莢膜梭菌比活性，以AAU/mg計SA=^t-CpAA./m蛋由質收率純化的活性收率收率=100x抗-CpAA.測試餾分/抗-CpAA.ij裝F純化純化因子F純化=SA測試泡分/SAsN1.10.肽序列的測定儘管在"雙峰"和"單峰"餾分中存在的產物的分子量不同，但是Edman測序使得建立單一主要N-末端序列AGXIXSGSVAV(SEQIDNo.3)成為可能。在所關注的兩種餾分中，也顯示了較小的17個殘基的序列AGPAYXVGYXGNNGAVT(SEQIDNo.2)。2.通過隨機誘變產生突變抹所採用的技術是菌株活潑瘤胃球菌L14的隨機誘變。該菌抹是活潑瘤胃球菌E1的自發突變體，其已經失去體外生產RumA的能力，但是仍能體內合成RumC。將該菌抹暴露於有效的烷化劑N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NG)。因此，將等分部分的菌4朱L14的同一培養物暴露於增加濃度的NG(0至1000fig/mL)。處理後，稀釋各種細胞懸液，然後將其鋪板在培養皿上。在培養之後計數菌落使得能夠評價在各種懸液中的活細胞濃度。通過與對照濃度(試管l,無NG處理)比較，可以測定每種處理的死亡率。其表明用NG的處理是有效的死亡率在50%至99%之間，並且隨濃度增力口。為了發現感興趣的突變體(多種)，近860個隨機選自在各種處理中存活的克隆的菌落在胰島素補充的瓊脂培養基上進行次培養，然後使其經受抗-產氣莢膜梭菌活性試驗。發現83個克隆是在胰島素存在下抗-產氣莢膜梭菌物質的潛在生產者。在這些當中，選擇20個進行更嚴格的表徵。在第一階段，檢查影響克隆的突變，以確保它們沒有通過PCR在n/mJ中恢復染色體組成(chromosomalorganization)。然後，在胰島素存在或不存在下，使該20個已選克隆在瓊脂培養基上和在液體培養基中經歷抗-產氣莢膜梭菌活性試驗。在胰島素補充的瓊脂培養基上，在所測試的20個克隆中的7個克隆周圍出現抑制孔環。另一方面，在無胰島素的瓊脂培養基上，不存在產生任何抗-產氣莢膜梭菌物質的克隆因此胰島素對於桿菌素的合成總是必需的。甚至在胰島素存在的情況下，在液體培養基中培養的克隆沒有產生抗-產氣莢膜梭菌。3.利用突變抹的純化在七個生產克隆之一——突變體9-17上進行生產和純化試驗。利用可變濃度的細胞和胰島素，在軟瓊脂上進行試驗。在培養突變體之後，磨碎瓊脂然後離心，回收上清液(SN9-17)。然後針對產氣莢膜梭菌測試該上清液，其證明是活性的。在該活性上清液上進行通過質譜法的分析(圖7A)。3丄利用FPLC系統在陽離子交換樹脂上的色語法在進行離子交換色譜法之前，樣品需要脫鹽。第一試驗顯示，SN9-17在Amicon上的脫鹽是不足的。因此，應當考慮樣品在Sep-Pak上脫鹽，作為初步純化步驟。用40。/。乙腈溶液進行蛋白質從Sep-Pak的洗脫。在旋轉蒸發器上蒸發掉乙腈之後，通過在20mM,pH5乙酸鈉緩衝液中稀釋溶液，使其在pH5平衡。從65mLSN9-17中獲得50mL在pH5平衡的SN9-17,並將其裝載到羧曱基-Sepharose陽離子交換柱上。將0至0.4MNaCl的濃度梯度運行40分鐘。在用0.2至0.3MNaCl洗脫的餾分中檢測抗-產氣莢膜梭菌活性，儘管當參比在280nm處的吸收變化時非常少的蛋白質物質存在於這些餾分中(圖6)。在RumC從盲腸內含物純化過程中已經觀察到這種現象。匯集活性餾分然後脫鹽並在Sep-Pak上濃縮。通過質譜法分析該餾分("活性CM餾分")證實通過陽離子交換色語法^是供的純化增加顯著，並且顯示汙染物都具有小於2500Da的分子量(圖7B)。3.2.CM餾分的分子篩選通過FPLC系統在柱上進行活性CM餾分的分子篩選，這使得分離出具有10kDa以下分子量的肽。通過讀取280nm處吸收的變化監測洗脫；蛋白質物質的量小，而且分離證實不令人滿意(未顯示)。雖然如此，在收集的餾分中測試了抗-產氣莢膜梭菌活性。在篩選之後僅發現5%的已裝載活性。因此，對於純化而言，不採用這種技術。另一方面，活性餾分("GF47-50")通過質語法分析並且證實其事實上是純的，其中肽為4235Da(圖8)。3.3.CM餾分的過濾利用過濾裝置，進行了從活性CM餾分去除汙染物的另一種嘗試。因為RumC被5kDa濾器保留(儘管具有稍微較低的分子量)，因此利用Vivaspin500過濾裝置——其截止閾值是5kDa——進行了第一次試驗。遺憾的是，雜種還是被濾器保留，儘管它們的分子量小於2.5kDa。具體而言，質譜分析沒有顯示任何純度增加(結果未顯示)。因此利用Microcon過濾裝置——其截止閾值是10kDa——嘗試了第二次試驗。具體而言，儘管其分子量，但是先前觀察到RumC可被10kDa濾器保留("10kDaR餾分")。質語法分析證實了先前的結果，並且使得能夠顯示大部分汙染物在未保留的餾分中被去除(圖7C)。3.4.在HPLC系統上10kDaR餾分的反相色語法然後含有三個RumC峰的10kDaR餾分(4235D、4324Da和4456Da)經歷反相HPLC。流速與梯度條件與從盲腸內含物純化RumC所開發的那些條件相同，並且得到的結果相當兩種不同的鎦分一一"雙峰"餾分和"單峰"餾分對產氣莢膜梭菌有活性。3.5.純化收率和純化因子驗。然後計算在每種餾分中包含的隨意活性單位數(AAU)，並推導活性收率(表5)。在培養上清液脫鹽、陽離子交換色譜之後另一次脫鹽的步驟過程中觀察到活性物質損失重大。損失很可能是發生在陽離子交換色譜過程中，但是這不會使該方案的有效性被質疑。200880017926.4表5:來自突變體9-17的培養上清液的RumC純化的收率餾分V(mL)抗畫CpAA.(AAU)收率SN9-171251453100%活性CM330021%雙峰0.42140}19%單峰0.42140V:餾分總體積，以mL計抗-CpAA.(抗-產氣莢膜梭菌活性)包含在餾分中的活性單位總數目，以AAU計收率二100x抗-CpAA.測試餾分/抗-CpAA.sN9-n;以％表達評價純化方案的另一種重要的標準是展示通過每一步驟所提供的純化增長。純化因子通過比較每一步驟的比活性(AAU/mg白質)確定，但是為了完成此工作，必須測量每種餾分中含有的蛋白質的質量。由於該方法的靈敏性，通過質語法監測純化，這使得能夠避免"消耗"太多生物材料。儘管該方法不是定量的，但是純化的增加得到非常清楚地展示。3.6.質譜法通過質語法分析"雙峰"和"單峰"餾分。得到的結果與得自使用盲腸內含物的純化的餾分的那些結果相同"雙峰"餾分含有4324Da和4456Da肽，而"單峰"餾分含有4235Da肽。3.7.測序這些餾分因此^皮測序。對於"單峰"餾分，得到的序列與已經測定的序列相同AGXIXSGSVAV(SEQIDNo.3)。較小的序列出現在第五周期AGPAY(SEQIDNo.il)。關於"雙^奪"餾分，注意到輕微的差異AGXYXSGSIAV(SEQIDNo.12)。較小序列是相同的AGPAY(SEQIDNo.il)。總結,人突變才朱純化RumC的方案示於圖9中。純化RumC的生產被極大簡化。4.RumC肽的表徵4丄對不同菌抹的抗微生物活性測試RumC對不同Gram+和Gram-治病菌一朱的抗微生物活性，在第一階段利用來自菌抹活潑瘤胃球菌El的單菌大鼠的盲腸內含物的濃縮上清液(SNCCEl)。然後用兩種對抗對SNCCEl敏感的菌抹的純化組分進行其它試驗。結果示於表6中。表6:RumC對抗不同致病菌抹的活性試驗結果tableseeoriginaldocumentpage33所測試的所有產氣莢膜梭菌菌株對RumC肽都是敏感的。4.2.對產氣莢膜梭菌的抗微生物功效通過估計每種純化RumC餾分的"體內"最小抑制濃度並使其與曱硝唑-所使用的對抗產氣莢膜梭菌的參比抗生素——的最小抑制濃度比較，也評價了RumC的抗微生物功效。為進行此工作，製備"雙峰"和"單峰"餾分兩倍連續稀釋(可達1/512稀莢膜梭菌活性試驗(結果未顯示)。根據該實驗，曱硝唑的最小抑制濃度是25)ig/mL。該結果與先前由Dabard等(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol"67,4111-4118,2001)獲得的結果一致。關於"雙峰，，和"單峰"餾分，僅有濃溶液(稀釋1)是活性的。儘管並沒有精確地知曉這些溶液的濃度，根據Edman測序，其可以被估計為大約40|ig/mL。RumC對產氣莢膜梭菌的抗微生物功效因此顯示與曱硝唑的相當。4.3.溫度耐受性通過在不同的溫度下溫育相同數量的肽15分鐘，進行RumC耐熱性的第一初步試驗。對於兩種"體內"RumC餾分("雙峰"和"單峰"餾分)，在75°C下15分鐘的處理對活性沒有影響。然而，在100。C,肽在15分鐘內完全滅活。利用從菌林9-17的培養上清液純化的RumC樣品，完成這些試驗。在不同溫度下的溫育時間是5分鐘。在100°C下的溫育時間是15分鐘。測試的第一溫度是80°C。利用活性CM餾分進行第一試驗，該活性CM餾分是含有三種肽的預純化餾分。與"雙峰"和"單峰"餾分相反，活性CM餾分耐受100。C下15分鐘的處理。然後測試餾分GF47-50。這種僅含有4235Da肽的純餾分對IO(TC下15分鐘的處理是敏感的。其對90。C下5分鐘的處理也是每丈感的(表7)。表7:溫度耐受性測試的總結表溫育條件"體內"RumC"體外，，RumC溫度時間雙峰單峰活性CM餾分GF47-5050。C15分鐘RR//75。C15分鐘RR//80°C5分鐘//R/85°C5分鐘//R/90°C5分鐘//RStableseeoriginaldocumentpage35R=抗性的；s:敏感的；/=未測試4.4.對pH的抵抗性在pH2、pH4.4和pH7下，還測試了活性CM餾分中存在的肽對pH的抗性。在pH2觀察到的活性與pH7時觀察的活性相當。在4。C溫育24小時之後，在pH2沒有觀察到活性損失。本發明的肽因此對酸性pH有抗性並且特別適合用在動物養分或藥物領域。權利要求1.一種具有抗微生物活性的肽，其特徵在於其包括選自下述肽的肽-序列SEQIDNo.1的肽，-肽，其包含與SEQIDNo.1的多肽具有至少80％同一性的肽，-序列SEQIDNo.2的肽，-肽，其包含與SEQIDNo.2的多肽具有至少80％同一性的肽。2.根據權利要求1所述的肽，3.根據權利要求1所述的肽,No.5或SEQIDNo.6的肽的肽。還包括序列SEQIDNo.3的肽。包括選自序歹llSEQIDNo.4、SEQID4.根據前述權利要求任一項所述的肽，其具有通過質語法測定的4000與4600Da之間的分子量。5.根據前述權利要求任一項所述的肽，其分離自活潑瘤胃球菌的突變株。6.根據權利要求5所述的肽，其分離自於2006年12月19日以編號CNCM1-3705保藏在CNCM(法國巴斯德研究所國家微生物菌種中心,紅色醫生路25號，F-75015巴黎)的活潑瘤胃球菌菌抹。7.—種編碼抗微生物活性的多核苦酸，其特徵在於包括選自下述的多核芬酸-按照序列SEQIDNo.7、8或9中任一種的多核苷酸，-多核苷酸，其與按照序列SEQIDNo.7、8或9中任一種的所述多核苷酸雜交，-多核苷酸，其編碼根據權利要求l-6任一項所述的多肽。8.表達盒，其特徵在於其在轉錄方向包括-啟動子，其在宿主生物中起作用，-根據權利要求7所述的多核苷酸，和-在同一宿主生物中的終止子序列。9.載體，其包含根據權利要求7所述的多核苷酸和/或根據權利要求8所述的表達盒。10.宿主生物，其用根據權利要求7所述的多核苷酸、根據權利要求8所述的表達盒和/或根據權利要求9所述的載體轉化。11.活潑瘤胃球菌的菌株，其於2006年12月19日以編號CNCM1-3705保藏在CNCM(法國巴斯德研究所國家孩i生物菌種中心，紅色醫生路25號，F-75015巴黎)。12.蛋白質混合物或發酵添加劑，其能夠通過根據權利要求10所述的宿主生物或通過根據權利要求11所述的菌林獲得。13.組合物，其包括根據權利要求1至6任一項所述的肽、根據權利要求10所述的宿主生物、根據權利要求11所述的菌抹、根據權利要求IO所述的宿主生物的發酵添加劑或者根據權利要求11所述的菌抹的發酵5恭力口劑。14.根據權利要求13所述的組合物，其是液體形式或粉末形式。15.營養添加劑，其包括根據權利要求1至6任一項所述的肽、根據權利要求10所述的宿主生物、根據權利要求11所述的菌林、根據權利要求10所述的宿主生物的發酵添加劑或者根據權利要求11所述的菌抹的發酵添加劑。16.根據權利要求15所述的營養添加劑，其是液體形式或粉末形式。17.動物伺料，其特徵在於其包括用於動物的營養基和根據權利要求15或16所述的營養添加劑。18.根據權利要求1至6任一項所述的肽、根據權利要求10所述的宿主生物、根據權利要求11所述的菌抹、根據權利要求10所述的宿主生物的發酵添加劑或者根據權利要求11所述的菌抹的發酵添加劑用於製造藥物、營養添加劑或動物飼料的應用。19.根據權利要求18所述的應用，其用於製造用以預防或治療豬或家禽中的壞死性腸炎的藥物或營養添加劑。20.根據權利要求18所述的應用，其用於製造用以預防或治療人胃腸疾病的藥物或營養添加劑。21.根據權利要求1至6中任一項所述的肽用於治療動物的非治療應用。22.根據權利要求21所述的應用，根據所述應用，所述肽得自所述動物的內源菌林或得自所述動物的外源菌抹。23.根據權利要求21所述的應用，動物的內源菌衝朱，以及#^居所述應用，促進。24.根據權利要求21所述的應用，動物的內源菌抹，以及根據所述應用，根據所述應用，所述肽得自所述藉助所述內源菌林的肽的生產被根據所述應用，所述肽得自所述所述內源菌株的生長被促進。全文摘要本發明涉及具有抗微生物活性的肽RumC1、RumC2和RumC3，以及還涉及編碼這些肽並分離自活潑瘤胃球菌E1的基因。文檔編號C07K7/04GK101679984SQ200880017926公開日2010年3月24日申請日期2008年5月16日優先權日2007年5月29日發明者埃馬紐埃爾·克羅斯,皮埃爾·安德烈·熱阿特,米歇爾·馮斯申請人:安迪蘇法國聯合股份有限公司